组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对人骨髓瘤U266细胞生长的影响及其可能机制

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)MS-275对人骨髓瘤细胞U266的凋亡抑制基因生存素(survivin)和核因子-κB(NF-κB)表达的影响.方法 台盼蓝拒染法观察MS-275对细胞活力的影响;瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析细胞周期;Western blot检测survivin、p21、细胞周期依赖激酶4(CDK4)和NF-κB的抑制蛋白(IKB-α)等的表达,以及凋亡信号通路中caspase-3活化及蛋白聚ADP核糖聚合酶(PARP)裂解情况.结果 MS-275抑制U266细胞增殖,阻断细胞周期于G0/G1期,呈时间-剂量依赖性.MS-275作用U266细胞48 h的IC50为1.39μmol/L.2 μmol/L MS-275作用U266细胞24 h后,G0/G1期细胞所占比例为(64.57±4.09)%;作用36 h后,G0/G1期细胞所占比例为(87.20±2.83)%;瑞氏-姬姆萨染色显示,U266细胞形态发生明显变化.Western blot检测表明,MS-275作用U266细胞后,survivin和CDK4表达下降,p21表达增加,IκB-α磷酸化水平受到明显抑制,caspase-3被裂解活化,其底物蛋白PARP发生剪切,细胞发生凋亡.结论 MS-275可诱导人骨髓瘤细胞系U266凋亡,NF-κB信号通路阻断是凋亡发生的机制之一.     

松油烯-4-醇对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨松油烯-4-醇（T4O）对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制。 方法 不同浓度（5~80 μmol/L）T4O体外作用于U266细胞。CCK-8法检测增殖抑制率;AO/EB染色,倒置显微镜观察细胞凋亡形态;比色法检测Caspase-3酶活性;流式细胞术检测细胞凋亡及周期;JC-1染色检测细胞线粒体膜电位。结果 T4O对U266细胞有增殖抑制作用,呈时间-剂量依赖性（P<0.05）。T4O诱导U266细胞凋亡,呈剂量依赖性（P<0.05）,随药物浓度增加,Caspase-3酶活性逐渐增强（P<0.05）, 线粒体膜电位逐渐降低（P<0.05）,细胞周期被阻滞在G2期。结论 T4O对U266细胞有抑制增殖及促凋亡作用,其机制是激活细胞凋亡途径关键酶Caspase-3,使细胞线粒体膜电位降低,并且使细胞周期阻滞在G2期,进而抑制肿瘤细胞分化与增殖。     

葛根总黄酮对骨髓瘤细胞株U266及RPMI8226增殖作用的研究

 【摘要】　目的　初步探讨葛根总黄酮（PRF）对骨髓瘤细胞株U266及RPMI 8226增殖影响及其机制。方法　采用0、10、30、50、100 μg／ml PRF分别处理U266、RPMI 8226细胞 48 h及72 h,MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期变化,瑞特染色观察细胞形态学改变,FITC-Annexin V／PI双染法检测细胞早期凋亡率改变,DNA片段化分析观察PRF处理U266细胞DNA断裂片段。结果　PRF可以抑制2种骨髓瘤细胞增殖,对U266细胞抑制作用大于对RPMI 8226细胞的作用,呈浓度依赖性;随PRF浓度增加2种细胞凋亡比例增加。瑞特染色未观察到2种细胞凋亡形态学特征。0、10、30、50、100 μg／ml PRF 处理U266细胞48 h早期凋亡率分别为（3.20±0.36）%、（5.20±0.92）%、（7.30±1.22）%、（8.10±0.53）%、（10.80±0.90）%,呈剂量依赖性增高,组间差异有统计学意义（P＜0.05）。DNA片段化分析U266细胞未出现凋亡细胞特有的DNA梯带。结论　一定浓度PRF对骨髓瘤U266及RPMI 8226细胞具有较明显的增殖抑制作用;PRF对U266细胞增殖抑制作用机制虽可能与凋亡相关,但并非U266细胞增殖受抑的主要途径,其确切机制有待进一步探讨。     

曲古霉素A对多发性骨髓瘤U266细胞株的影响

 目的　观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A（TSA）对多发性骨髓瘤U266细胞株增殖、周期、凋亡和侵袭力的影响。探讨该药对DNA甲基转移酶（DNMT）、甲基结合结构域（MBD）蛋白MBD2和MeCP2的影响。方法　不同浓度TSA作用于U266细胞株12、24、48和60 h,MTT法检测细胞的增殖活性,并计算药物作用24 h相应IC50。以IC50作用U266细胞24 h后,检测细胞周期;荧光定量PCR分析基质金属蛋白酶-2（MMP-2）基因、抗凋亡基因bcl-2、bcl-xl以及DNMT、MBD2、MeCP2 mRNA的改变表达。分别用流式细胞术和Western blotting检测MMP-2和MBD2蛋白的变化。结果　TSA对U266细胞增殖的影响具有时间和剂量依赖性。作用24 h的IC50为0.07 μmol／L。TSA可将细胞阻滞于G0／G1期,细胞增殖指数（49.90±0.39）%,与对照组的（55.78±0.49）%相比差异有统计学意义（P＜0.01）。TSA作用后,MMP-2、bcl-2、bcl-xl 2-ΔΔCt 分别为：0.71±0.06、5.04±0.92、2.95±0.35,与对照组相比P＜0.05,TSA作用可以逆转DNMT、MBD2和MeCP2转录。结论　TSA可通过干扰细胞周期,将U266细胞阻滞于G0／G1期,从而抑制细胞增殖,促进凋亡的发生,该作用可能是通过改变细胞甲基化调节蛋白的表达而实现。     

狗舌草提取物对多发性骨髓瘤U266细胞株的作用

 目的　探讨狗舌草提取物对多发性骨髓瘤U266细胞株的细胞毒作用及其机制。方法　U266细胞株与狗舌草提取物共同培养,用CCK-8试剂检测细胞毒作用,用流式细胞术（FCM）对细胞周期及凋亡进行检测。结果　狗舌草提取物对U266细胞有细胞毒作用,半数抑制质量浓度约为3.2 μg／ml;狗舌草总提取物影响U266细胞周期,当药物质量浓度为1.25、2.5、5、10 mg／L时G0／G1期细胞减少[（34.12±0.49）%、（38.06±0.63）%、（27.46±0.61）%、（15.91±0.32）%],S期[（4.98±0.50）%、（4.01±0.22）%、（4.16±0.15）%、（5.04±0.12）%]、G2／M期[（50.05±1.12）%、（51.27±0.71）%、（51.84±0.73）%、（55.11±0.25）%]细胞增加;凋亡细胞增加;用Annexin V／PI染色FCM检测,均显示细胞凋亡与狗舌草提取物有剂量依赖关系。结论　狗舌草提取物对U266细胞有体外细胞毒作用,其作用机制部分是诱导细胞凋亡。     

miRNA-181a对多发性骨髓瘤细胞生物学特性影响的初步研究

目的 探讨miRNA-181a(miR-181a)在多发性骨髓瘤(MM)患者中的表达情况及其对MM细胞生物学特性的影响.方法 应用免疫磁珠筛选的方法分离并纯化25例初治、复发难治MM患者及10例非恶性血液病患者骨髓CD138+细胞,应用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-181a表达情况.同时检测RPMI 8226、H929及U266三种MM细胞株中miR-181a的表达.应用miR-181a抑制剂及激动剂观察下调和上调miR-181a表达对MM细胞生物学特性的影响,并对miR-181a进行靶基因预测.结果 与非恶性血液病患者相比,MM患者CD138+细胞中miR-181a表达上调.对MM细胞株的观察发现,与非恶性血液病患者骨髓CD138+细胞相比,RPMI 8226及U266细胞株miR-181a高表达,而H929细胞株则低表达.相比对照组,应用100 nmol/L miR-181a抑制剂下调miR-181a后,U266细胞的增殖活力在24、48及72 h分别为(50.5±4.1)%、(52.3±2.2)%和(69.5±4.3)%,低于对照组的(67.1±3.3)%、(71.5±3.6)%和(78.1±5.4)%(均P<0.05),提示细胞增殖受抑.而应用100 nmol/L miR-181a激动剂上调miR-181a后,H929细胞在24、48 h时的增殖活力分别为(38.5±3.6)%和(82.2±6.9)%,高于对照组的(21.2±2.4)%和(61.3±5.4)%(均P<0.01),提示细胞增殖增强.细胞周期分析提示,miR-181a抑制剂使U266细胞周期阻滞在G0/G1期.细胞药敏实验结果显示,多柔比星、紫杉醇及5-氟尿嘧啶作用后,与药物单独处理的细胞相比,miR-181a抑制剂下调U266细胞miR-181a表达的细胞增殖活力下降.在48 h和72 h的吸光度(A)值显著低于对照组.细胞迁移实验显示,miR-181a抑制剂下调miR-181a能抑制U266细胞的迁移能力,实验组细胞的迁移比例为(62±10)%,低于对照组的(89±12)%(P<0.05),而miR-181a激动剂则能提高H929细胞的迁移能力,实验组细胞的迁移比例[(242±9)%]高于对照组的(98±8)%(P<0.01).结论 MM细胞高表达miR-181a.miR-181a的高表达可能会促进MM细胞的增殖、转移及耐药,可能与MM患者预后有关,是MM预后评估一个重要的候选生物标志物.对miR-181a靶基因进行进一步预测,同时应用基因缄默的策略可能会改善MM患者的预后.     

艾拉莫德通过活化AMPK对骨髓瘤细胞株U266增殖的影响

目的:探讨艾拉莫德对多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）细胞株U266细胞增殖的影响。方法:艾拉莫德（10、20和30 μg/ml）作用于骨髓瘤细胞株U266细胞后,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测U266细胞活力;细胞周期染色试剂盒检测U266细胞周期分布情况;Western blot检测细胞周期相关蛋白CDK2、AMPK及p-AMPK的表达水平。结果:10、20和30 μg/ml的艾拉莫德处理24 h后,U266细胞活力呈剂量依赖性的降低。艾拉莫德（10、20和30 μg/ml）处理U266细胞24 h后,G0/G1期细胞数明显增加,S期细胞数明显降低。本研究还进一步发现10、20和30 μg/ml的艾拉莫德处理24 h后可显著下调U266细胞的CDK2蛋白表达水平。此外,艾拉莫德人处理骨髓瘤细胞株U266细胞24 h后,U266细胞的p-AMPK/AMPK水平明显增加。结论:艾拉莫德可抑制骨髓瘤细胞株U266细胞增殖以及细胞周期,其作用机制可能涉及促进AMPK的活化。     

罗格列酮与全反式维甲酸对骨髓瘤细胞分化的影响及其可能机制

目的 探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)的配体罗格列酮(RGZ)与全反式维甲酸(ATRA)对骨髓瘤细胞分化的影响及其可能机制.方法 以RGZ和ATRA处理人骨髓瘤细胞U266和RPMI-8226,用~3H-掺入法检测细胞增殖变化;碘化丙啶(PI)染色后,以流式细胞仪检测细胞周期变化;瑞氏-姬母萨染色观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析细胞表面CD49e的表达变化;Western blot方法检测p27~(k1p1)和p21~(Wafl)的表达变化.结果 RGZ能显著抑制U266和RPMI-8226细胞的增殖,并且这种抑制作用呈剂量依赖性.经5 μmol/L RGZ处理后,U266和RPMI-8226细胞G_0/G_1期细胞的比例分别为(45.2±6.7)%和(40.3±7.3)%,较对照组明显增加(均P<0.05);G_2/M期和S期细胞的比例分别为(52.2±7.4)%和(57.4±9.5)%,较对照组明显减少(均P<0.05);CD49e的表达率分别为(8.7±1.5)%和(7.9±1.6)%,较对照组明显上调(均P<0.05).以10μmol/L RGZ处理后,U266和RPMI-8226细胞的G_0/G_1期、G_2/M期和S期细胞比例、CD49e的表达率均较5μmol/LRGZ组的变化更加显著.同时,经RGZ处理后,U266和RPMI-8226细胞的形态学变化也符合骨髓瘤细胞分化成熟的规律,p27~(kipl)和p21~(Wafl)蛋白的表达量也较对照组明显增加.RGZ和ATRA联合对U266和RPMI-8226细胞影响较RGZ单独作用更加明显.结论 RGZ可能通过上调p27~(kipl)和p21~(Wafl)蛋白的表达,介导骨髓瘤细胞的周期阻滞,并诱导骨髓瘤细胞分化,抑制骨髓瘤细胞增殖.ATRA能增强RGZ对骨髓瘤细胞的上述作用,两者联合具有协同效应.     

环腺苷酸拟似物 8-CPT-cAMP诱导骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

背景与目的：多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者经标准方案治疗后缓解率虽高,但其缓解后复发及对化疗药物耐药性的产生较普遍。通过调变细胞内环腺苷酸浓度可以诱导多种肿瘤细胞增殖阻滞和凋亡,成为肿瘤治疗新途径。本研究观察环腺苷酸拟似物8-对氯苯硫基环腺苷酸［8-(4-chlorophenylthio)adenosine 3’,5’-cyclic monophosphate,8-CPT-cAMP］对MM细胞生物学行为的影响,探讨其诱导MM细胞凋亡的可能机制,为开发临床MM治疗新药提供研究方向。方法：以不同浓度8-CPT-cAMP处理MM细胞系U266,用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测其增殖,流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率和线粒体跨膜电位的变化,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)分别检测凋亡相关基因caspase-8、caspase-9、Bcl-2和Bax的转录及Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果：U266细胞经不同浓度8-CPT-cAMP处理5 d后,生长受到明显抑制,呈浓度和时间依赖性;伴随作用时间延长,8-CPT-cAMP的半数有效抑制浓度(IC50)明显减低,第5天可达58.52 μmol/L。U266细胞周期在8-CPT-cAMP浓度增加的状态下逐渐停滞在G0/G1期;各浓度组细胞增殖抑制率、凋亡率与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。同时8-CPT-cAMP能够诱导U266细胞线粒体跨膜电位下降;此外,经8-CPT-cAMP处理48和72 h后,不同浓度U266细胞Bcl-2 mRNA及蛋白表达较对照组明显下降(P<0.05),caspase-9、Bax mRNA及 Bax蛋白表达明显升高(P<0.05),而caspase-8 mRNA表达与对照组比较无明显差异。结论：8-CPT-cAMP能够抑制骨髓瘤细胞增殖并诱导其凋亡,呈时间和浓度依赖性;该效应可能通过caspase依赖的线粒体诱导细胞凋亡途径来实现。     

异土木香内酯通过bcr-abl-STAT5信号通路抑制慢性粒细胞白血病耐药细胞K562/A02增殖

目的 探讨异土木香内酯对慢性粒细胞白血病耐药细胞K562/A02增殖的抑制作用及其机制.方法6.25、12.5、25、50、100μmol/L的异土木香内酯作用于K562/A02细胞24、48 h,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对K562/A02细胞的增殖抑制效果;10、15、20μmol/L异土木香内酯作用于K562/A02细胞24 h,流式细胞术检测细胞周期及凋亡;Western blot法检测增殖相关蛋白表达水平.多组间比较采用单因素方差分析.结果异土木香内酯能够显著抑制K562/A02细胞增殖,并呈浓度依赖性(P<0.05),作用24 h的半数抑制浓度(IC50)值为(15.00±1.03)μmol/L;阴性对照组及10、15、20μmol/L异土木香内酯作用后K562/A02细胞凋亡率分别为(2.71±0.52)%、(19.10±1.55)%、(27.61±2.32)%和(32.01±3.01)%,呈浓度依赖性(F=33.901,P<0.05);S期细胞比例分别为(57.80±2.11)%、(68.62±2.89)%、(78.44±3.51)%和(80.61±2.90)%,呈浓度依赖性(F=51.328,P<0.05).异土木香内酯明显降低bcl-2、p-bcr-abl、p-STAT5、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)和细胞周期蛋白A(cyclin A)的表达(P<0.05),上调细胞色素C、Bax和p21的表达(P<0.05).结论异土木香内酯能够通过bcr-abl-STAT5信号通路抑制K562/A02细胞增殖.     

重楼皂苷D对人慢性粒细胞白血病K562细胞增殖的抑制作用及其机制

目的 探讨重楼皂苷D对人慢性粒细胞白血病细胞株K562增殖的抑制作用及其机制.方法 选用浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2.4μmol/L重楼皂苷D作用于K562细胞24 h,用CCK-8法检测重楼皂苷D对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测重楼皂苷D对K562细胞凋亡以及细胞周期分布的影响;Western blot方法检测相关蛋白的表达.结果 重楼皂苷D可显著抑制K562细胞增殖,24 h的半数有效抑制浓度(IC50)为(0.9±0.1)μmol/L.流式细胞术检测结果显示,浓度为0.9μmol/L重楼皂苷D作用于K562细胞12、24 h后,细胞早期凋亡率较对照组的(2.05±0.45)%分别提高到(11.46±1.51)%、(28.87±2.35)%,差异有统计学意义(F=38.637,P<0.05).重楼皂苷D能够显著下调bcl-2、CDK1、cyclin B1、bcr-abl融合蛋白的表达,上调Bax、细胞色素C、活化的caspase-3以及p21的表达(均P<0.05).此外,重楼皂苷D能够将细胞周期阻滞在G2/M期(F=42.355,P<0.05).结论 重楼皂苷D能够明显抑制慢性粒细胞白血病K562细胞增殖,其作用机制可能是诱导细胞凋亡及促进细胞周期阻滞.     

多发性骨髓瘤患者原代细胞与U266细胞株zeste基因增强子同源物2表达升高的初步研究

 目的　探讨多发性骨髓瘤（MM）U266细胞株和MM患者的骨髓单个核细胞（BMMNC）中DNA甲基化相关蛋白zeste基因增强子同源物2（EZH2）的表达,分析DNA甲基化与MM的关系。方法　选取MM U266细胞株及10例MM患者BMMNC（MM-BMMNC）,同时选取10名健康人骨髓提取的单个核细胞（N-BMMNC）。用Western blot法测定细胞EZH2的含量,以目的蛋白EZH2与内参照β-actin 表达量的比值作为EZH2蛋白相对表达水平。结果　与10例N-BMMNC（0.2277±0.1306）比较,EZH2在U266细胞（0.9730±0.1029）和10例MM-BMMNC（0.9220±0.1301）中表达明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论　EZH2在MM U266细胞株及MM-BMMNC中含量明显增多,EZH2与MM的发生和发展机制可能有密切联系。     

微小RNA-206通过干扰CDK4和GAK的表达对前列腺癌细胞生长的影响

目的 探讨微小RNA-206(miR-206)对前列腺癌细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和细胞周期素G相关蛋白激酶(GAK)表达的干扰作用及对前列腺癌细胞生长的影响.方法前列腺癌细胞株DU-145和PC-3为转染对象,转染miR-NC为对照组,转染miR-206为实验组.荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测CDK4和GAK mRNA的表达水平.Western blotting检测CDK4和GAK蛋白的表达水平.流式细胞术检测细胞周期分布.EdU增殖实验和集落形成实验检测细胞增殖能力.结果在DU-145和PC-3细胞株中,miR-NC组CDK4 mRNA表达量分别为1.00±0.09、1.00±0.10,GAK mRNA表达量为1.00±0.05、1.00±0.06;与之相比,两细胞株miR-206组中CDK4 mRNA表达明显下降,分别为0.36±0.18(t=6.572,P=0.001)、0.43±0.17(t=5.794,P=0.001),GAK mRNA表达量亦明显下降,分别为0.23±0.04(t=22.420,P<0.001)、0.32±0.08(t=14.500,P<0.001).Western blotting实验结果与qRT-PCR结果一致.流式细胞术检测结果显示,分别与两细胞株miR-NC组比较,转染miR-206后前列腺癌细胞在S期(23.60%±5.68%∶32.53%±4.52%,t=2.462,P=0.049;22.09%±4.35%∶30.96%±4.86%,t=2.720,P=0.035)和G2-M期(16.28%±7.12%∶26.63%±4.33%,t=2.484,P=0.048;14.60%±1.62%∶24.68%±7.13%,t=2.758,P=0.033)的细胞比例下降,在G0-G1期(60.13%±5.82%∶40.84%±5.37%,t=4.872,P=0.003;63.31%±3.27%∶44.36%±3.82%,t=7.533,P<0.001)的细胞比例升高.EdU增殖实验结果显示,转染miR-206的细胞增殖能力明显减弱(22.56±3.81∶38.90±8.51,t=3.503,P=0.013;25.12±6.42∶48.45±8.92,t=4.244,P=0.005).集落形成实验结果显示,两细胞株miR-NC组形成的集落数分别为218.66±44.59、177.35±24.49,miR-206组形成的集落数分别为125.38±32.80(t=3.370,P=0.015)、82.65±14.05(t=6.708,P=0.001),提示miR-206组细胞增殖能力降低.结论 miR-206可通过干扰CDK4和GAK的表达显著抑制前列腺癌细胞的生长,提示miR-206可能成为前列腺癌的分子靶向治疗工具.