抑制survivin 表达对肝癌细胞阿霉素化疗敏感性的影响

目的:探讨survivin基因沉默对人肝癌耐药株阿霉素化疗敏感性的影响.方法:针对人survivin基因设计并合成3条siRNA序列,分别用脂质体法转染人肝癌BEL-7402细胞(3组).以未转染的BEL-7402细胞为对照,分别用RT-PCR法,免疫细胞化学技术及MTT法检测各组细胞survivinmRNA与蛋白的表达,及对阿霉素敏感性.结果:与对照组比较,各转染组细胞survivin mRNA与蛋白的表达均明显降低(均P＜0.05);对照组细胞对阿霉素的IC50值为(20.60±2.86) μg/mL,各转染组细胞对阿霉素的IC50值分别为(11.53±1.46) μg/mL,(14.13±1.82) μg/mL,(15.53±0.46) μg/mL,与对照组比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论:抑制survivin基因的表达能增加BEL-7402细胞阿霉素化疗敏感性.     

转染TSLC1基因肝癌细胞株BEL-7402生物学特性的研究

目的 将人TSLCl基因转染人肝癌细胞BEL-7402中稳定表达,检测转染后细胞生物学特性的变化.方法 用脂质体法将TSLCl基因的真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)/TSLCl导人人肝癌细胞株BEL-7402中,G418筛选克隆,再以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、Western blot的方法检测TSLCI的表达,细胞计数、流式细胞术及裸鼠负荷瘤实验分析转染后细胞的生物学特性变化.结果 TSLCl在BEL-7402细胞中的表达可抑制BEL-7402细胞的生长,BEL-7402-TSLCI与BEL-7402比较s期及G2/M期的细胞减少,G0/G1期的细胞增加.转染后的BEL-7402-TSLCl细胞的凋亡明显增加,转染后荷瘤裸小鼠肿瘤的生长受到抑制.结论 TSLCl基因的转染可以抑制BEL-7402细胞的增殖、诱导肝癌细胞的凋亡,为肝癌的基因治疗提供理论依据.     

pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因靶向性治疗人原发性肝癌的实验研究

目的研究pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因对人肝癌细胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤模型的靶向性治疗作用。方法建立人原发性肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分成肿瘤对照组、空质粒组、丙氧鸟苷（GCV）组、pcDNA3/TK/Angio组及pcDNA3/AFP/TK/Angio组5组。于瘤体内分别直接注射不同的质粒,同时于裸鼠腹腔内注射GCV,观察不同时段皮下肿瘤的生长情况并做病理学检查,免疫组化法检测肿瘤微血管密度（MVD）以及血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达量,原位末端标记（TUNEL）法检测细胞原位凋亡。放免法检测裸鼠血清甲胎蛋白（AFP）的变化,透射电镜观察肿瘤细胞超微结构的变化。结果裸鼠皮下成瘤率100%;pcDNA3/TK/Angio组及pcDNA3/AFP/TK/Angio组的肿瘤体积、血清AFP含量、肿瘤MVD和VEGF表达强度均明显低于对照组、空质粒组和GCV组（P〈0.05）,细胞凋亡指数都明显高于后3组（P〈0.05）,可见较多的凋亡细胞。而pcDNA3/AFP/TK/Angio组的肿瘤体积、AFP、MVD及VEGF表达强度又明显低于pcDNA3/TK/An-gio组（P〈0.05）,凋亡指数高于后者（P〈0.05）。结论pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因系统可显著抑制肿瘤的生长,有望成为治疗原发性肝癌的新型生物制剂之一。     

靶向抑制survivin基因对肝细胞癌血管生成的影响

目的研究靶向抑制survivin基因对肝细胞癌血管生成的影响,探讨survivin在血管生成中的作用机制。方法采用脂质体介导survivin ASODN体外转染人肝癌细胞株HepG2,Western blot检测细胞中survivin蛋白的表达;RT-PCR检测细胞中VEGF mRNA的表达;FCM检测细胞的凋亡率;利用皮下注射法建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型;采用脂质体包裹survivin ASODN直接瘤内注射,观察其对移植瘤生长情况的影响;SABC法检测移植瘤组织MVD。结果400 nmol/L survivin ASODN转染可明显下调HepG2细胞survivin蛋白表达,但不影响VEGF mRNA表达;ASODN组HepG2细胞凋亡率显著高于空白对照组和SODN组(F=428.19,P<0.01);ASODN组瘤体生长速度较空白对照组和SODN组明显减慢(F=12.63,P<0.01);ASODN组瘤体重量较空白对照组和SODN组明显减轻(F=5.90,P<0.05);ASODN组MVD较空白对照组和SODN组明显降低(F=34.29,P<0.01)。结论survivin ASODN可以抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长,其机理可能是诱导HepG2细胞自发性凋亡和抑制肿瘤血管生成。     

超声辐照微泡介导双自杀基因转染对裸鼠乳腺癌杀伤作用的在体研究

目的：探讨超声辐照微泡介导CD/TK双自杀基因质粒转染对在体乳腺癌的杀伤效应。 方法：用人乳腺癌MCF-7细胞建立裸鼠移植瘤模型后,将荷瘤裸鼠随机分为对照组、质粒组、超声辐照组、超声辐照微泡组,每组5只。对照组仅给予CD与TK相应的前药（5-氟胞嘧啶与更昔洛韦）;质粒组注射质粒（含CD/TK基因）与前药;超声辐照组注射质粒与前药,并予超声辐照;超声辐照微泡组注射靶向超声造影剂（质粒与微泡混合物）与前药,并予超声辐照。实验期间记录裸鼠肿瘤生长情况;处理结束后5 d,剥除肿瘤,计算各组的抑瘤率;用倒置荧光显微镜观察目的基因瘤内转染情况,计算基因转染效率;RT-PCR法检测目的基因的表达;免疫组化法计数肿瘤的微血管密度（MVD）。 结果：与对照组比较,质粒组肿瘤的生长无统计学差异（P>0.05）,而超声辐照组与超声辐照微泡组肿瘤生长被明显抑制（均P<0.05）,质粒组、超声辐照组、超声辐照微泡组的抑瘤率分别为3.72%、21.40%、47.13%。质粒组、超声辐照组、超声辐照微泡组基因转染效率分别为0.78%、2.81%、23.87%,后者转染效率明显高于前两组（均P<0.05）。超声辐照组与超声辐照微泡组肿瘤组织中均出现CD/TK基因阳性片段,而对照组与质粒组的肿瘤组织中未见。超声辐照组与超声辐照微泡组肿瘤组织MVD计数均明显低于对照组,且超声辐照微泡组低于超声辐照组（均P<0.05）,质粒组MVD计数与对照组无统计学差异（P>0.05）。 结论：超声辐照微泡介导的双自杀基因系统能有效提高基因转染效率与表达,从而增强对肿瘤生长和肿瘤微血管的生成的抑制作用。     

腺病毒介导双自杀基因CD/TK对人肝癌细胞株Bel7402的抑制作用

目的探讨含胞嘧啶脱氨酶(CD)／5-氟胞嘧啶(5-Fc)单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶基因融合自杀基因(CD／TK)的重组腺病毒治疗肝癌的疗效。方法重组腺病毒Ad．CD／TK感染人肝癌细胞Bel7402,用噻唑蓝(MTT)方法观察不同浓度5-Fc和无环鸟苷(GCV)对其杀伤效应; 建立Bel7402裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射Ad．CD／TK,腹腔注射GCV(50 mg／kg体重)和／或5- Fc(500 mg／kg体重)10 d,观察肿瘤生长抑制效应。结果在对感染Ad．CD／TK的Bel7402细胞的体外杀伤实验中,GCV的IC50为(12．1±2．3)μmol／L,5-Fc的IC50为(223±15)μmol／L,并且两者有协同效应。在Bel7402裸鼠移植瘤模型中,联合Ad．CD／TK和GCV、5-Fc能够显著抑制肿瘤的生长。结论腺病毒为载体的双自杀基因转染和前药的应用对人肝癌细胞的体内、体外治疗疗效明显。     

TK自杀基因对甲胎蛋白阳性肝癌的特异性杀伤作用

目的观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统在体内外对人肝癌细胞的杀伤效应.方法在体外按MOI值为100、10、1、0用重组腺病毒转染人肝癌细胞BEL-7402和SMMC-7721,48 h后用噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率.在两种肝癌裸鼠模型上,瘤体内注射重组腺病毒(1×1012 pfu/L)0.1 ml,GCV作用后观察抑瘤效果.结果体外MOI为100时,可杀死99.8%的BEL-7402细胞和17.8%的SMMC-7721细胞,两者差异有显著性(P＜0.05).体内BEL-7402组肿瘤生长明显受到抑制.结论在体内外,腺病毒介导的含AFP调控序列的HSV-tk/GCV自杀基因系统对甲胎蛋白(AFP)阳性肝癌细胞具有特异性杀伤作用,该系统可望用于肝癌的特异性基因治疗.     

双启动子引导自杀基因靶向杀伤5-FU耐药肿瘤细胞的研究

目的：探讨胸苷酸合成酶（TS）基因启动子和p16基因启动子引导胸苷激酶（TK）自杀基因靶向杀伤5－FU耐药肿瘤细胞的作用。方法：构建TS、p16双启动子重组表达载体,将TK基因插入TS、p16启动子之间,转染耐药人直肠癌细胞系HR－8348、外周血单个核细胞。通过克隆形成实验、细胞存活率测定和裸鼠移植瘤治疗实验,观察双启动了引导TK基因特异杀伤肿瘤细胞的作用。结果：将TS、p16双启动子重组质粒载体转入耐药HR－8348细胞,检测TS、TK基因表达阳性,TK基因与TS表达一致。转染组和对照组肿瘤细胞集落形成分别为：9／300、92／300。转染组瘤细胞集落形成率明显降低（t=33.885,P＜0．01）,癌细胞生长抑制率显著提高。对裸鼠移植瘤的生长抑制率为74．5％。在转染的外周血单个核细胞,p16表达阳性,TS、TK表达阴性。转染双启动子重组质粒对正常外周血单个核细胞无损伤作用。结论：TS和p16双启动子可引导TK基因靶向性杀伤5－FU耐药肿瘤细胞,保护肌体正常细胞,提高自杀基因治疗的安全性。     

RNA干扰survivin联合X线放射对大肠癌SW480细胞的影响

目的探讨RNA干扰技术和X线放射处理对大肠癌细胞survivin基因表达的影响。方法合成靶向人survivin基因的siRNA,转染大肠癌细胞SW480,联合或不联合放射治疗。检测转染前后及放射前后细胞survivinmRNA的表达;细胞抑制率及凋亡率,细胞周期分布,细胞survivin蛋白的表达。结果转染survivinsiRNA后的SW480细胞survivin mRNA及蛋白的表达明显低于对照组;SW480细胞转染survivinsiRNA 48 h后G2/M期细胞达(20.90±2.62)%,survivinsiRNA联合放射处理组细胞生长抑制率达59.8%,FCM显示survivinsiRNA联用放射处理组细胞凋亡率达(35.72±1.07)%。结论靶向survivin的siRNA能有效抑制大肠癌细胞SW480 survivin基因的表达,引起大肠癌细胞SW480 G2/M周期阻滞,抑制大肠癌细胞SW480的生长并能诱导其凋亡,并对大肠癌细胞SW480具有放射增敏作用。     

腺病毒介导自杀基因对消化系统肿瘤的杀伤作用

目的观察腺病毒介导的自杀基因对消化系肿瘤的杀伤作用。方法腺病毒介导的自杀基因HSV-TK分别转染结肠癌LOVO细胞、胃癌MGL-803细胞和肝癌BEL-7402细胞,比较腺病毒载体对不同肿瘤细胞的转染效率。加入前药丙氧鸟苷(GCV),通过MTT法检测细胞存活率,观察单纯疱疹病毒1型胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统对不同肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应。结果在GCV浓度100mg/L以上时,3种转基因肿瘤细胞均可被HSV-TK/GCV系统完全杀伤;旁观者效应以MGL-803细胞最为明显,与LOVO细胞和BEL-7402细胞相比,差异有显著性意义(P<0.05);腺病毒对肿瘤细胞的转染效率强弱依次为BEL-7402细胞、MGL-803细胞和LOVO细胞。结论重组腺病毒可以作为消化系肿瘤基因治疗的高效载体。HSV-TK/GCV系统对胃癌MGL-803细胞的作用最佳。     

腺病毒驱动KDR启动子介导CD/TK融合基因系统对肝癌细胞的靶向杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统（AdKDR- CDglyTK）对肝癌细胞选择性杀伤作用。方法 将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后，体外感染表达KDR的BEL-7402细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株，并给予不同浓度的前药5-FC和/或GCV，观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应。结果 所得病毒滴度为2.5×10^12pfu/ml。两种细胞的感染率相似，其感染率随腺病毒滴度的递增而增加。RT-PCR方法 检测发现：感染AdKDR-CDglyTK的BEL-7402有目的 基因CDglyTK的表达，感染AdKDR- CDglyTK的LS174T细胞无目的 基因表达。表达KDR的BEL-7402细胞对前药具有较高的敏感性，不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感（F=750.03，P〈0.001）。融合基因的疗效优于任一单自杀基因（F=275.89，P〈0.05）。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养，观察到该体系明显的旁观者效应。结论 KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的肝癌细胞。     

靶向存活素基因短发卡RNA对人脑胶质母细胞瘤U251细胞在裸鼠体内生长的影响

目的观察靶向存活素基因的特异性短发卡RNA（shRNA）对人脑胶质母细胞瘤U251细胞裸鼠体内肿瘤生长和血管形成的影响。方法将U251细胞、稳定转染存活素基因shRNA真核表达载体pWH1-SR的U251细胞（U251-SR细胞）、稳定转染空载体pWH1的U251细胞（U251-P细胞）,分别接种于15只裸鼠背部皮下,每组5只,观测肿瘤生长情况。采用免疫组化SABC方法检测存活素、增殖细胞核抗原（PCNA）以及第八因子相关抗原（FⅧRAg）在各组肿瘤标本中的表达;采用TUNEL方法检测凋亡细胞,分别计算各组肿瘤标本的增殖指数（PI）、凋亡指数（AI）以及微血管密度（MVD）。结果与U251、U251-P组相比,U251-SR组裸鼠肿瘤形成时间延迟,肿瘤生长缓慢,肿瘤体积及重量均明显减小（P均〈0.01）;肿瘤标本存活素蛋白表达明显下调;PI和MVD明显减少,AI明显升高（P均〈0．01）。结论靶向存活素基因的shRNA能够在裸鼠体内明显抑制U251细胞的肿瘤生长和血管形成。     

血管内皮生长因子受体启动子双自杀基因治疗乳腺癌

目的 探讨腺病毒介导的KDRP-CD/TK融合基因对乳腺癌裸鼠体内抑瘤作用的特点.方法 以MCF-7细胞株建立裸小鼠乳腺癌动物模型,随机分为Ⅰ组[注射重组腺病毒AdKDRP-CDglyTK与前药5-氟胞嘧啶(5-FC)与丙氧鸟苷(GCV)]、Ⅱ组(仅注射前药5-FC与GCV)、Ⅲ组(仅注射重组腺病毒AdKDRP-CDglyTK)及Ⅳ组(空白对照,不施加任何处理).治疗结束后,计算抑瘤率、常规病理检查、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测瘤体CD/TK融合基因的表达以及微血管密度(MVD)变化的检测,同时观察该治疗体系有无系统毒性.结果 各组瘤重如下:Ⅰ组(实验组)(25.04±3.09)mg、Ⅱ组(498.07±4.47)mg、Ⅲ组(501.94±4.50)mg、Ⅳ组(503.79±6.27)mg.可见Ⅰ组肿瘤逐渐缩小,余各组肿瘤逐渐增大(F=12 727.420,P＜0.01);第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤生长差异无统计学意义(P＞0.05);Ⅰ组有CD/TK基因表达且MVD(1.05±0.04)较对照组(4.15±0.10)变小(t=64.126,P＜0.01);常规病理检查发现Ⅰ组组织片状坏死,且该治疗体系对重要脏器无毒性作用.结论 KDR启动子驱动双自杀基因体系对裸鼠皮下移植瘤有明显的生长抑制作用,其机制涉及对肿瘤及其血管内皮细胞的双重杀伤.     

裸鼠人肝癌原位移植多药耐药模型的建立及其耐药机制的探讨

目的　在体内建立人肝癌裸小鼠原位移植多药耐药模型,并研究其耐药机理。方法采用人肝癌（BEL-7402）裸小鼠（4～6周龄）原位移植,给予阿霉素(1.5mg/kg体重,每周1次)腹腔注射诱导耐药（共8周）,经四唑蓝(MTT)快速比色法检测原代培养的耐药细胞对抗癌药的敏感性,以流式细胞仪检测癌细胞表面mdr1基因产物P-糖蛋白（P-gp）的表达,并用罗丹明试验观察该蛋白功能。结果　移植瘤组织形态及生物学方面符合人肝癌特征,实验组肝癌细胞表面P-gp表达为(75.45±5.67)%,而对照组表达仅(4.25±1.28)%,差异有非常显著性（P＜0.01）,对阿霉素的耐药倍数提高了16.67倍,对羟基喜树碱具有交叉耐受性（13.67倍）。耐药细胞表面P-gp有较强的药物外排功能。结论　阿霉素较易诱导原位移植于裸小鼠的人肝癌多药耐药性的产生,其耐药倍数与临床肝细胞癌相似。该模型的建立对研究肝癌多药耐药的产生机制以及逆转其多药耐药性具有重要价值。     

联合基因靶向治疗对乳腺癌细胞及血管内皮细胞的特异性杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体（KDR）启动子驱动的双自杀基因（CDglyTK）联合survivin反义寡核苷酸（ASODN）对乳腺癌细胞（MCF-7）及血管内皮细胞（ECV304）的特异性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy—KDR—CD0yTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的MCF-7和ECV304细胞株,同步用survivinASODN转染已感染腺病毒的MCF-7和ECV304细胞株,观察腺病毒的感染效率和survivinASODN的转染情况,应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot免疫印迹法检测CDglyTK和survivin基因在转基因MCF-7和ECV304细胞中的表达,MTT法测定两者联合应用对细胞的杀伤效应和旁观者效应。结果SurvivinASODN可转染重组腺病毒感染的细胞,并且survivinASODN的转染率及重组腺病毒的感染率均不受影响,CDglyTK可在两种细胞中高表达,survivinASODN可明显降低survivin蛋白表达。单一survivinASODN基因转染MCF-7和ECV304细胞后,细胞存活率为56．4％±3．8％和55．9％±3．6％,与AdKDR—CDglyTK基因联用后,随着丙氧鸟苷（GCV）和5-氟胞嘧啶（5-FC）浓度的增加,细胞存活率迅速下降,两者联合作用与单一基因作用相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。但在GCV100μg／ml、5．FC2000μg／ml时,联合基因治疗组细胞存活率略低于单用AdKDR—CDglyTK组,两者差异无统计学意义（P〉0．05）。SurvivinASODN和AdKDR—CDglyTK联合作用在GCV、5-FC浓度较低时表现为协同效应,并具有更明显的旁观者效应。结论KDR启动子调控的CDglyTK融合基因体系和survivinASODN基因联合应用对乳腺癌细胞及血管内皮细胞具有显著的特异性杀伤作用。     

腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统体内外旁观者效应的观察

目的：观察腺病毒介导的HSV－tk/GCV自杀基因系统的体外,体内接触及体内远端旁观者效应。方法：采用向体外培养的tk阴性人肝部BEL－7402细胞中加入不同比例tk阳性同种细胞;向荷tk阴性BEL－7402小鼠瘤体内注射不同数量tk阳性同种细胞;向双侧荷瘤小鼠一侧瘤体内注射重组腺病毒,GCV作用后用不同方法来观察不同情况下的旁观者效应。结果：体外组中观察到明显旁观者效应,当tk阳性细胞占10％时,混合细胞存活率为36．6％,体内接触组中也观察到旁观者效应,实验组瘤体生长明显受到抑制（P＜0．05）;体内远端组中,未观察到旁观者效应（P＞0．05）。结论：腺病毒介导的HSV－tk/GCV自杀基因系统在体外及体内接触时均存在旁观者效应。