MicroRNA-520a通过失活AKT抑制HepG2.2.15细胞中HBV DNA复制

目的探讨microRNA-520a(miR-520a)抑制HepG2.2.15细胞中HBV DNA复制的机制。方法通过Entrez Nucleotide数据库预测AKT是否为miRNA-520a的靶基因。通过RT-qPCR和Western blot验证miRNA-520a是否调控HepG2.2.15细胞中AKT的表达,研究miRNA-520a模拟物及其抑制剂对HepG2.2.15细胞中HBV DNA转录和复制的影响。评价siRNA对AKT mRNA和蛋白表达以及HBV DNA转录和复制的作用。结果在HepG2.2.15细胞中,AKT为miRNA-520a的靶基因,miRNA-520a通过抑制AKT表达可进一步抑制HepG2.2.15细胞中HBV DNA的转录和复制。AKT表达下调受siRNAs诱导,同时抑制HepG2.2.15细胞中HBV的转录和复制。结论 MiRNA-520a可抑制AKT表达,进而抑制HBV DNA转录和复制,其可能成为治疗HBV感染的新靶点。     

不同靶区RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制与表达

目的 观察针对乙型肝炎病毒（HBV）不同靶区发夹样RNA（shRNA）抑制HBV复制与表达的效率。方法 根据shRNA表达载体设计原则，设计并构建了针对HBVP、C、S和X区7种特异性和2种序列突变的shRNA表达载体，将其与1．3倍HBV全基因表达载体共转染于HepG2细胞，通过Southernblot和酶联免疫吸附法分别检测HBV DNA复制中间体和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）水平，来观察shRNA抗HBV复制与表达的效率。结果 发现针对HBV不同靶区shRNA均有抗HBV复制和表达效果，以P1、S2、C2、S1和X抑制HBV DNA复制效率较高，P1的抑制率高达95％。HBsAg表达受抑制情况与HBV DNA复制受抑制的程度相似，其中C2、C1和S2对HBsAg的抑制作用较强。结论 针对HBV四个开放性读码框进行RNA干扰对HBV复制和抗原表达均有抑制作用，其中P1和C2分别对HBV复制和表达的抑制效率较高。     

携带IFN-5α基因的HBV DNA质粒构建及其表达

目的构建携带人IFN-5α基因的X基因缺陷的HBV DNA真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法在pBR322-B-HBV质粒(含adr Ⅰ型HBV DNA)中插入人工合成片段破坏其HBV—X基因区，再与IFN-5α片段连接，最后克隆入真核表达载体pcCNA3，获得携带人IFN-5α基因的X基因缺陷的HBV DNA真核表达质粒pcDNA3-KN-F1F2-IFN-5α。同时构建两组对照质粒，即连接完整HBV DNA的真核表达质粒和连接X基因缺陷的HBV DNA真核表达质粒，将上述3种质粒以脂质体法同时转染HepG2细胞，G418筛选出稳定表达系统后选用荧光定量PCR法、ELISA法、RT-PCR法检测3种包装病毒。的复制表达以及IFN-5α的表达水平。结果获得目的真核表达质粒pcDNA3-KN—F1F2-IFN-5α；目的质粒转染HepG2细胞后其包装病毒的复制表达水平均较两个对照组降低；插入的IFN-5α片段可以在mRNA以及蛋白质水平表达。结论成功构建携带人IFN-5α基因的X基因缺陷的HBVDNA真核表达质粒，并能在HepG2真核细胞中表达。     

靶向乙型肝炎病毒X区的siRNAs对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用

目的观察siRNA对HBV基因表达和复制的抑制情况。方法针对HBVX区设计并化学合成4条siRNAs,观察在不同浓度下对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用。结果 siRNA在30nmoL/L浓度时,4种siRNA对HepG2.2.15细胞HbsAg和HBeAg无明显的抑制作用(P0.05);在60nmoL/L和90nmoL/L浓度下,siR-NA-1和siRNA-4有明显的抑制作用(P0.05),他们对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为41%和43%;siRNA能降低HepG2.2.15细胞HBVDNA的拷贝数。结论化学合成的siRNAs可以有效地抑制HBV基因的表达和复制。     

RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)核心区为靶位，构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体pSilencer3．1-Hlhygro，体外观察siRNA抗HBV的效果。方法 以HepG2 2．2．15细胞为靶细胞，利用脂质体Metafectene与表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-Hlhygro共转染，用定量聚合酶链反应检测细胞上清液中DNA，用逆转录聚合酶链反应检测HBV C-mRNA。结果 成功构建了表达siRNA的转录质粒载体，两条siRNA均可抑制HBV的复制，而且与siRNA浓度成正相关。结论 靶向HBV核心区的siRNA能抑制HBV的复制。     

肽核酸抑制HBV复制与表达的体外研究

合成肽核酸(PNA)片段,由OligofectamineTm转染至HepG2.2.15细胞与HBV各编码区保守区域相结合。用ELISA方法测定HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg滴度,PCR测定HBV DNA含量。通过计算抑制百分率,筛选有效PNA片段。结果在500 mol/L浓度下,PG3 HBsAg、HBeAg、HBV DNA表达抑制率分别为51.03%、55.38%、20.10%;PG6 HBsAg、HBeAg、HBV DNA表达抑制率分别为47.00%、43.10%、51.03%。表明PNA可由OligofectamineTm转染至HepG2.2.15细胞,从而抑制HBV的复制和抗原系统的表达。     

MxA基因真核表达载体构建及体外抗HBV作用研究

目的克隆人类MxA基因,探索其细胞内直接抗HBV作用,以便寻求HBV及其他病毒感染的新的基因治疗靶点。方法以pHMG—MxA质粒载体为基础,构建人类MxA基因表达质粒,采用人HBV—DNA转染的2．2．15细胞株作为研究对象,以不同浓度的MxA基因转染进行干预培养,lamivudine（3TC）阳性对照,同时设立空白对照,观察对HBV表达和复制的影响。结果经过酶切鉴定证明重组MxA基因表达质粒pcDNA—MxA构建正确,转染2．2．15细胞后呈现出明显抑制HBV复制和表达作用,且与转染剂量有关;3TC组也见MxA的表达增高,HBV—DNA复制受到明显抑制。结论抗病毒基因MxA具有细胞内抗HBV的复制及抑制病毒抗原基因的表达作用。     

SUMO特异性蛋白酶3在HBV复制中的作用机制

目的初步探讨SUMO特异性蛋白酶3(SENP3)在HBV感染中的作用机制。方法体外培养HepG2.2.15细胞,或利用HBV转基因小鼠肝脏组织,通过表达SiRNA干扰等,经蛋白质印迹、实时PCR、免疫组织化学染色等实验技术,检测SENP3在HBV感染细胞模型中的表达。结果 HBV DNA与其PBMC中SENP3的含量呈反比。健康对照组PBMC中SENP3的平均蛋白水平是CHB患者的7.4倍(P0.05)。HBV转基因小鼠肝脏中SENP3表达显著降低,小鼠肝脏组织中AKT磷酸化水平增高,是健康对照组的4.1倍(P0.01)。SENP3在HBV DNA全基因重组质粒转染的HepG2受体细胞(HepG2.2.15)中表达量显著低于未转染HBV DNA的HepG2细胞。与HepG2细胞相比,HepG2.2.15细胞中AKT磷酸化水平显著增高,其含量平均是HepG2细胞的5.2倍(P0.01);在HepG2.2.15细胞中转染SENP3质粒使其过表达,则AKT磷酸化水平降低,HBV DNA含量降低,并与SENP3质粒浓度呈负相关性;分别向HepG2.2.15细胞转染100ng和500ng的SENP3质粒,则细胞中HBV DNA含量由对照组中的7.983.03×106 IU/mL降低至3.45×106 IU/mL和1.92×106 IU/mL;应用siRNA干扰SENP3在HepG2.2.15细胞中的表达,则Akt磷酸化水平升高,其浓度是对照组的5.6倍(P0.01)。结论机体HBV DNA载量与SENP3的表达量呈负相关,SENP3可通过抑制肝细胞AKT磷酸化水平,降低HBV DNA载量。     

热休克蛋白90抑制剂17-AAG对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的探讨热休克蛋白90(HSP90)是否参与肝细胞转化生长因子(TGF)β信号通路的活化,以及HSP90对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法 HSP90抑制剂17-AAG作用HepG2细胞,提取细胞总RNA,实时定量RT-PCR检测TGFβ下游信号分子PAI-1的表达。HepG2细胞用17-AAG预处理2 h,同时用TGFβ或TβR抑制剂SB431542作用后,将HBV复制型质粒HBV1.3转染细胞,第4 d提取HBV核心颗粒,Southern Blot检测HBV复制中间体,ELISA检测上清HBsAg的表达。结果 17-AAG能够下调HepG2细胞PAI-1的表达,HepG2细胞内HBV复制中间体表达水平明显降低,HBsAg的表达亦受到抑制,但上调或阻断TGFβ信号通路对HBV复制影响不明显。结论 HSP90参与肝细胞内TGFβ信号通路的活化,其抑制剂17-AAG能够抑制HBV的复制与蛋白表达,但该抑制作用与TGFβ信号通路活化无关。     

HepG2与HepG2．2．15细胞中P53表达及活性的比较

目的探讨HBV对抑癌基因P53表达及活性的影响。方法选用HepG2及转染了HBV表达质粒的HepG2．2．15细胞，采用Western blotting法检测两种细胞P53的表达状况；磷酸钙法将报告基因质粒PG13-CAT和P21-LUC分别转染细胞，通过检测报告基因的表达观察各细胞中P53的活性。结果HepG2．2．15细胞中P53蛋白表达水平高于HepG2细胞，而且两种报告基因的表达在HepG2．2．15细胞中也较高。结论HBV在肝癌细胞内的复制对P53的表达及功能具有一定的增强作用。     

不同HBV标志物模式的乙型肝炎患者HBV表面大蛋白的检测及与HBVDNA水平的相关性

目的通过检测乙型肝炎病毒标志物（HBVM：HBsAg／抗-HBs、HBeAg／抗一HBe、抗一HBc）不同模式的乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒外膜大蛋白（HBV—LP）、乙型肝炎病毒前s1抗原（HBVpreSl）、HBVDNA,探讨HBV—LP与HBVDNA及HBVM模式间的关系,研究HBV—LP用于乙型肝炎患者临床诊治的意义。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对HBV—LP、HBVpreS1和HBVM进行检测;采用荧光定量PCR方法对HBVDNA进行检测。结果乙型肝炎患者大蛋白检测结果与HBVDNA检测结果差异无统计学意义（X^2=1．97,P〉0．05）。HBV—LPA值随HBVDNA拷贝数的增加呈上升趋势,二者之间存在良好的相关性（r=0．565,P〈0．01）,在不同HBVDNA拷贝数组别间,HBV—LPA值差异有统计学意义（F=9．23,P〈0．01）。结论HBV—LP是反应HBV感染者体内病毒复制程度的良好的血清免疫学指标,血清中的HBV—LP与HBVDNA具有较好的相关性,特别是可作为HBeAg阴性患者体内监测病毒复制及预后判断的良好的血清学指标。     

HBsAb阳性隐匿性HBV感染者血清、肝组织HBV全基因序列分析

目的 了解HBsAb阳性隐匿性HBV感染者血清和肝组织中的HBV基因序列,并比较其差异性.方法 以1例长期随访HBsAb阳性隐匿性HBV感染者作为研究对象,用多种试剂盒检测其血清HBsAg、HBsAb,提取外周血血清和肝组织HBV DNA进行全基因组分段扩增,行序列测定及同源性比较.结果 多种试剂盒检测均提示该例患者HBsAg阴性、HBsAb阳性;血清HBV DNA为103～ 105拷贝/mL;血清和肝组织来源的HBV DNA全基因测序完全相同,均为3 215个碱基、B基因型,与参照序列核苷酸同源性为98.82％,各编码区均没有缺失或移码突变,不同编码区的核苷酸序列同源性为98.37％～ 100％,氨基酸序列同源性为98.18％～ 100％,在S区存在几种变异如PreS1的Q80H、S的C64Y、E164G、L175S,但前S区、“a”决定簇、1 762/1 764、1 896位点均未见变异.结论 HBsAb阳性隐匿性HBV感染者血清和肝组织来源的HBV基因序列无明显差异.     

Molecular and Serological Characterization of Hepatitis B Virus (HBV)-Positive Samples with Very Low or Undetectable Levels of HBV Surface Antigen

Background: Gaps remain in the detection of nucleic acid test (NAT) yield and occult hepatitis B virus (HBV) infection (OBI) by current HBV surface antigen (HBsAg) assays. The lack of detection may be due to HBsAg levels below current assay detection limits, mutations affecting HBsAg assays or HBsAg levels, or the masking of HBsAg by antibody to HBsAg (anti-HBs). In this study, we evaluate the incremental detection of NAT yield and OBI from five diverse geographic areas by an improved sensitivity HBsAg assay and characterize the samples relative to the viral load, anti-HBs status, and PreS1–S2–S mutations. Included is a comparison population with HBV DNA levels comparable to OBI, but with readily detectable HBsAg (High Surface–Low DNA, HSLD). Methods: A total of 347 samples collected from the USA, South Africa, Spain, Cameroon, Vietnam, and Cote D’Ivoire representing NAT yield (HBsAg(−), antibody to HBV core antigen (anti-HBc)(−), HBV DNA(+), N = 131), OBI (HBsAg(−), anti-HBc(+), HBV DNA(+), N = 188), and HSLD (HBsAg(+), anti-HBc(+), HBV DNA(+), N = 28) were tested with ARCHITECT HBsAg NEXT (HBsAgNx) (sensitivity 0.005 IU/mL). The sequencing of the PreS1–S2–S genes from a subset of 177 samples was performed to determine the genotype and assess amino acid variability, particularly in anti-HBs(+) samples. Results: HBsAgNx detected 44/131 (33.6%) NAT yield and 42/188 (22.3%) OBI samples. Mean HBV DNA levels for NAT yield and OBI samples were lower in HBsAgNx(−) (50.3 and 25.9 IU/mL) than in HBsAgNx(+) samples (384.1 and 139.5 IU/mL). Anti-HBs ≥ 10 mIU/mL was present in 28.6% HBsAgNx(+) and 45.2% HBsAgNx(−) OBI, and in 3.6% HSLD samples. The genotypes were A1, A2, B, C, D, E, F, and H. There was no significant difference between HBsAgNx(−) and HBsAgNx(+) in the proportion of samples harboring substitutions or in the mean number of substitutions per sample in PreS1, PreS2, or S for the NAT yield or OBI (p range: 0.1231 to >0.9999). A total of 21/27 (77.8%) of HBsAgNx(+) OBI carried S escape mutations, insertions, or stop codons. HSLD had more PreS1 and fewer S substitutions compared to both HBsAgNx(−) and HBsAgNx(+) OBI. Mutations/deletions associated with impaired HBsAg secretion were observed in the OBI group. Conclusions: HBsAgNx provides the improved detection of NAT yield and OBI samples. Samples that remain undetected by HBsAgNx have exceptionally low HBsAg levels below the assay detection limit, likely due to low viremia or the suppression of HBsAg expression by host and viral factors.     

替比夫定对HBV携带者病毒血清学和肝脏病理学的影响

目的观察HBV携带者经替比夫定治疗后病毒血清学和肝脏病理学的改变情况。方法将42例HBV携带者分成两组,观察组单用替比夫定100 mg/d口服,疗程一年以上,对照组单用苦参素胶囊口服,疗程6个月。观察两组治疗前及治疗后6个月肝脏病理组织学及HBVM、HBVDNA、肝纤维化指标的改变情况。结果治疗6个月后,观察组肝组织改善程度明显优于对照组（P〈0.05）,观察组肝组织炎症活动指数由治疗前的（7.8±3.8）分下降至治疗后的（4.5±4.2）分（t=7.358,P〈0.01）,HBVM、HBVDNA、血清纤维化指标与对照组比较也显著改善（P〈0.01或〈0.05）。结论替比夫定对HBV携带者近期疗效显著,临床上肝功能正常的HBV携带者可进行规范的抗病毒治疗。     

乙型肝炎病毒母婴传播阻断的共识与争议

慢性乙型肝炎因其严重的不良临床结局如肝硬化或肝细胞癌而成为严重的公共卫生问题,而母婴传播是导致慢性HBV感染的最主要原因。尽管HBV阳性孕妇所生的新生儿在出生后24h之内应用了乙型肝炎疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）进行联合免疫阻断,仍然有大约10％左右的新生儿感染了HBV,特别是高病毒载量的孕妇。本文将就HBV母婴传播的特点、目前在阻断措施方面达成的共识和存在的争议进行论述。     

乙型肝炎病毒前C区变异与慢性乙型肝炎病理改变的相关性

目的 探讨慢性乙型肝炎中乙型肝炎病毒（HBV）前C区1896突变与肝组织病理的关系。方法 对173例慢性乙型肝炎患者进行肝活检,观察肝组织病理分级（G）和分期（S）情况,同时检测乙型肝炎病毒的e系统状态和HBV前c区1896阳性患者（20％）;随着肝组织炎症活动度和纤维化程度的进展,变异株检出率似乎有增加趋势,但无统计学意义（P＝0．98和P=0．052)。结论 HBV前C区变异在HBeAg阴性组高于HBeAg阳性组;未发现HBV前C1896变异与慢性乙型肝炎的炎症分级和纤维化分期有相关关系。     

乙型肝炎患者血清HBeAg和抗-HBe与HBV DNA定量的关系

目的分析比较HBV血清标志物HBe Ag与抗-HBe同时阳性、同时阴性及单独阳性患者的病毒复制情况。方法采用电化学发光法检测HBV血清标志物,从中筛选出HBe Ag与抗-HBe同时阳性或均为阴性以及HBe Ag单独阳性或抗-HBe单独阳性的标本,检测该类标本HBV DNA定量值。计数资料组间比较采用χ2检验。结果检测447例患者HBV血清标志物,所有患者HBs Ag均为阳性。HBe Ag与抗-HBe同时阳性患者32例,阳性率为7.16%,其中HBV DNA5×102拷贝/ml占84.38%,5×102拷贝/mlHBV DNA1×104拷贝/ml占12.50%,1×104拷贝/mlHBV DNA1×107拷贝/ml占3.13%;HBe Ag与抗-HBe同时阳性组的HBV DNA含量分布低于HBe Ag单独阳性组,差异有统计学意义(χ2=13.21,P0.01);抗-HBe阳性组的HBV DNA含量分布低于抗-HBe阴性组(χ2=74.12,P0.01);HBe Ag阴性的患者218例,HBV DNA1×104拷贝/ml共9例(4.13%)。结论HBe Ag与抗-HBe同时阳性过去认为是不常见模式,但临床上并不少见,且病毒复制处于较高水平的仍占一定比例;当抗-HBe出现后,病毒复制减弱。血清HBe Ag阴性情况下,部分患者病毒仍存在较高水平复制。因此,HBe Ag存在与否不能作为抗病毒、疗效评价、传染性强弱的依据。     

HBsAg Loss as a Treatment Endpoint for Chronic HBV Infection: HBV Cure

Despite the availability of effective vaccines and antiviral therapy over the past two to three decades, chronic hepatitis B virus (HBV) infection remains a major global health threat as a leading cause of cirrhosis and liver cancer. Functional HBV cure defined as hepatitis B surface antigen (HBsAg) loss and undetectable serum HBV DNA is associated with improved clinical outcomes in patients with chronic HBV infection. However, spontaneous loss of HBsAg is rare and occurs in only 1% of all HBsAg-positive individuals annually. Furthermore, the rate of functional cure with currently available antiviral therapy is even lower, <1% patients on treatment per year. Nonetheless, HBsAg loss has become the new target or therapeutic endpoint for antiviral treatment. Recently, there has been much excitement surrounding the development of novel antiviral agents such as small interfering RNA (siRNA), core assembly modulators (CAMs), nucleic acid polymers (NAPs) among others, which may be used in combination with nucleos(t)ide analogs and possibly immunomodulatory therapies to achieve functional cure in a significant proportion of patients with chronic hepatitis B. Novel assays with improved sensitivity for detection of very low levels of HBsAg and to determine the source of HBsAg production will also be required to measure efficacy of newer antiviral treatments for HBV cure. In this narrative review, we will define HBV cure, discuss various sources of HBsAg production, evaluate rates of HBsAg loss with current and future antiviral agents, review clinical factors associated with spontaneous HBsAg loss, and explore clinical implications of functional cure.     

HBV动物模型研究进展

HBV感染动物模型是研究HBV致病机制、筛选新型有效抗HBV药物和治疗方法的重要工具,然而HBV感染具有高度组织特异性以及种属特异性,这给HBV感染动物模型的建立带来了困难。近年来,随着分子生物学、实验动物学、病毒学及免疫学等相关学科技术的进步,HBV感染或复制动物模型取得了明显进展。目前应用于HBV(包括与HBV具有相似特性的动物肝炎病毒)研究的动物模型主要包括黑猩猩、树鼩、土拨鼠及鸭HBV感染模型,HBV转基因小鼠、高压水动力注射介导的小鼠HBV复制模型和重组腺相关病毒载体介导的小鼠HBV复制模型,以及人源化人-鼠嵌合肝脏HBV感染模型,此外,钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白转基因小鼠感染模型是近年的研究热点。本文就上述HBV动物模型的研究进展进行综述。