抑制c-myc基因表达对HL-60细胞表面分化抗原CD13、CD33的影响

目的:利用重组反义c-myc腺病毒载体(Ad-AS-c-myc)抑制HL-60细胞c-myc基因表达,检测细胞表面分化抗原CD13、CD33变化,了解抑制HL-60细胞c-myc表达,对细胞分化及分化抗原的影响。方法:重组Ad-AS-c-myc病毒按感染强度(MOI)为100的转染剂量,转染HL-60细胞。RT-PCR检测c-myc表达。流式细胞仪检测CD13、CD33阳性细胞率。同时对转染细胞行Wright’s染色,观察细胞形态变化。结果:Ad-AS-c-myc转染HL-60细胞后,c-myc基因表达降低,CD13阳性细胞率升高,CD33阳性细胞率降低。结论:抑制c-myc基因表达,使HL-60细胞CD13表达增强,CD33表达降低。细胞形态向成熟粒细胞方向分化。     

重组反义c-myc腺病毒对HL-60细胞PCNA表达及其生长影响的研究

目的:研究重组反义c-myc腺病毒(Ad-AS-c-myc)对人急性早幼粒HL-60细胞系的c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)表达及细胞生长抑制。方法:采用重组腺病毒Lac-Z(Ad-LacZ)及Ad-AS-c-myc联合多聚阳离子转染HL-60细胞,X-gal染色判断转染效率。采用MTT、RT-PCR及免疫细胞化学等方法进行研究。结果:多聚阳离子可提高腺病毒对HL-60细胞的转染,Ad-LacZ加入鱼精蛋白硫酸盐转染率达79.8%。Ad-AS-c-myc能抑制HL-60细胞c-myc基因在转录及蛋白水平的表达。Ad-AS-c-myc抑制HL-60细胞生长及活力(抑制率51%),细胞生长停滞后PCNA蛋白表达降低。结论:Ad-AS-c-myc对HL-60细胞具有使生长减缓、增殖能力降低作用,其生物学作用与HL-60细胞c-myc和PCNA的表达受抑有关。Ad-AS-c-myc在急性早幼粒白血病基因治疗中具有潜在的临床价值,其生物学活性与HL-60细胞c-myc和PCNA表达受抑有关。     

黄芩苷作用HL-60细胞前后c-myc基因表达的变化

 目的 研究中药黄芩苷（baicalin）对人髓系白血病细胞株HL-60细胞增生、凋亡的影响及探讨c-myc基因在其中的作用。方法 培养人髓系白血病细胞株HL-60细胞,应用MTT法绘制细胞生长曲线观察黄芩苷对HL-60细胞增生的影响;DNA凝胶电泳观察细胞凋亡;RT-PCR检测黄芩苷作用前后c-myc基因mRNA表达水平的变化;Western blot检测黄芩苷作用前后c-myc蛋白表达水平的变化。结果　细胞生长曲线结果示黄芩苷能明显抑制HL-60细胞增生,半数抑制浓度（IC50）约为20μmol／L,DNA 片段化的检出表明黄芩苷能有效诱导HL-60细胞凋亡;黄芩苷作用后HL-60细胞c-myc基因和蛋白的表达水平均下降,并且随作用时间延长,表达下降更明显。结论 黄芩苷能有效抑制HL-60细胞增生,诱导其凋亡,c-myc基因可能参与了黄芩苷抑制HL-60细胞增生和诱导凋亡的过程。     

携带反义c-myc的重组腺病毒安全性研究

目的　研究携带反义c myc的重组腺病毒 (Ad ASmyc)潜在的副作用 ,评价其安全性 ,为其进一步进入临床试验提供依据。方法　用Ad ASmyc感染HeLa细胞 ,制备细胞提取液后反复两次感染HeLa细胞 ,观察Ad ASmyc的繁殖、扩增 ,以及对HeLa细胞的作用 ,RT PCR检测其DNA的转录 ;确定Ad ASmyc对作为正常细胞的人胚肺二倍体细胞 2BS的感染能力 ,绘制细胞生长曲线 ,观察Ad ASmyc对正常细胞的毒性 ;给Balb/c小鼠腹腔注射重组腺病毒后 ,每日观察一般状况 ,化验肝、肾功能 ,PCR检测Ad ASmyc在重要脏器中的分布 ,显微镜观察重要脏器的病理学变化。结果　Ad ASmyc是一复制缺陷型腺病毒 ,它能高效感染 2BS细胞 ,但并不影响其生长 ,小鼠体内应用后 ,无急性毒性症状发生 ,在肝、肾、胃、脾内可检测到腺病毒的分布。但在注射 10 9pfu第 6天、第 12天的小鼠肝组织内可观察到轻微炎症。结论　Ad ASmyc应用是安全的 ,可以进入临床试验。     

CD13、CD33在BCR-ABL+急性淋巴细胞白血病患者骨髓中的表达及其与临床特征和预后的相关性

目的:探讨髓系抗原CD13、CD33在BCR-ABL+急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）患者骨髓中的表达及其与临床特征和预后的相关性。方法:应用实时荧光定量聚合酶链反应（real time quantitative-polymerase chain reaction,RQ-PCR）检测119例初诊ALL患者骨髓BCR-ABL表达水平。用流式细胞学检查检测ALL的抗原表达水平。对照分析单纯BCR-ABL+患者中CD13+和CD13-以及CD33+和CD33-患者在初次诱导缓解率（initial-induction remission rate,CR1）和总生存率（overall survival rate,OS）的区别。结果:在BCR-ABL+ 的ALL患者中,初诊时CD13+患者较CD13-患者具有较低的首次诱导缓解率,差异具统计学意义（P＜0.05）,但CD33+患者较CD33-患者首次诱导缓解率无统计学差异。CD13+组及CD33+的OS显著低于CD13-组及CD33-组（P＜0.05）。结论:BCR-ABL+ALL患者中CD13+及CD33+提示预后不良。     

三尖杉酯碱诱导HL-60细胞分化时对c-myc原癌基因表达的影响

 本文报告了小剂量三尖杉酯碱对HL-60细胞的分化诱导作用和c-myc蛋白质表达的影响，并探讨了相互间的关系。证明小剂量三尖杉酯碱除可抑制HL-60细胞增殖外，还可诱导其向单系及粒系定向分化，并使c-myc蛋白质的表达程度下降，二者呈负相关，这一结果提示，c-myc原癌基因表达的变化可能是三尖杉酯碱诱导HL-60细胞分化的机制之一。     

siRNA对HL-60细胞c-myc蛋白表达的影响

 目的　研究小干扰RNA（siRNA）对白血病细胞c-myc蛋白表达的影响,探寻白血病基因治疗的新方法。方法　应用针对c-myc的siRNA转染HL-60细胞,分别收集转染后24、48和72 h细胞及对照组细胞,提取细胞总蛋白,用Western blotting方法检测c-myc蛋白的表达情况。结果　与对照组相比,转染c-myc siRNA后,细胞c-myc蛋白表达水平明显下降,且c-myc蛋白含量随作用时间的延长而逐渐降低,转染24 h后c-myc 蛋白含量下降约42 %,48 h下降66 %,72 h下降78 %;单因素方差分析显示与对照组相比,差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论　c-myc siRNA能降低HL-60细胞c-myc蛋白的表达,其作用具有序列特异性和时间依赖性,有望成为白血病靶向基因治疗的新工具。     

靶向CD33 的CAR修饰的NK92 细胞对CD33+急性髓系白血病细胞的杀伤作用

[摘要] 目的：根据抗CD33-scFv 序列构建CD33-CAR 修饰的NK92 细胞,探讨其对CD33+ 急性髓系白血病（acute myeloidleukemia,AML）细胞的杀伤作用。方法：通过基因合成以及分子克隆技术获得抗CD33-CAR片段,然后将其构建到慢病毒载体上,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染NK92 细胞,用流式细胞术检测细胞转染效率并通过嘌呤霉素筛选得到稳定表达抗CD33-CAR的细胞系CD33-CAR-NK92,利用钙黄绿素释放法检测该细胞的杀伤作用,ELISA法检测细胞因子IFN-γ 分泌的变化。结果：成功构建pCDH-CD33-CAR 重组慢病毒质粒,慢病毒转导后约18.7%的NK92 细胞表达CD33-CAR（命名为CD33-CARNK92细胞）,嘌呤霉素筛选后表达CD33-CAR的NK92 细胞比例约86.3%。CD33-CAR-NK92 细胞对CD33+AML细胞MOLM-13的杀伤作用明显高于未被基因修饰的NK92 细胞（P<0.01）,而两者对CD33-肿瘤细胞JURKAT 的杀伤作用没有明显差异（P>0.05）。效靶比为2∶1 共培养6 h 后,经CD33-CAR修饰的NK92 细胞相比未被基因修饰的NK92 细胞IFN-γ 的分泌水平明显升高[ （190.97±11.52）vs（88.41±2.75）pg/ml, P<0.01]。结论：CD33-CAR-NK92 细胞能特异性识别CD33 抗原并杀伤CD33+AML细胞,其杀伤作用显著高于未被基因修饰的NK92 细胞,为进一步开展靶向CD33 的CAR-NK92 细胞治疗AML的临床转化奠定了实验基础。     

反义c-myc重组腺病毒的构建及其抗骨肉瘤细胞的作用

背景与目的:c-myc原癌基因在细胞的增殖调节中发挥重要作用,研究表明c-myc在骨肉瘤中常常扩增和过表达,而且具有促进细胞转化和诱导转移的特性。本文构建表达反义c-myc的重组腺病毒,并探讨其对不同p53基因型的骨肉瘤细胞系MG-63(P53缺失型)、U2OS(p53野生型)的影响。方法:应用基因重组技术构建表达反义c-myc的重组腺病毒(Ad-As-c-myc),并在体外转染MG-63、U2OS细胞,采用蛋白免疫印迹(Westernblot)、吖啶橙染色、RT-PCR、流式细胞仪(FCM)等方法检测或观察其对细胞c-mycmRNA表达、瘤细胞体外增殖、凋亡及细胞周期的影响。结果:成功构建Ad-As-c-myc,滴度可达2×109pfu/ml,体外转染MG-63、U2OS细胞后可明显抑制细胞的体外增殖,而且对携带野生型p53的U2OS更敏感。Ad-As-c-myc转染48h后可降低c-mycmRNA表达。吖啶橙染色及FCM检测证实,转染Ad-As-c-myc可诱导骨肉瘤细胞凋亡,细胞周期分析显示转染Ad-As-c-myc的MG-63细胞出现G2/M期阻滞,而U2OS细胞出现G1期阻滞。结论:腺病毒介导反义的c-myc能以p53依赖或非依赖性途径诱导骨肉瘤细胞凋亡,并抑制骨肉瘤细胞的增殖。     

Rotenone, a mitochondrial NADH dehydrogenase inhibitor, induces cell surface expression of CD 13 and CD38 and apoptosis in HL-60 cells

We previously demonstrated that the mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 2 (ND2) gene was overexpressed in human acute myelogenous leukemia (AML) cells. Since this finding suggested that ND2 gene expression was related to myeloid differentiation, we here investigated the effects of rotenone, a specific NADH dehydrogenase inhibitor, on HL-60 cell growth, differentiation and death. Fifty nM rotenone inhibited the growth of HL-60 cells and caused an increase in the cell population in the Gz +M phase. In the quantitative comparison of myeloid antigen, the expression of CD13 and CD38 were relatively increased in the rotenone-treated cells. These findings suggest that the inhibition of NADH dehydrogenase changes the cell cycle and induces some specific surface antigens of HL-60 cells. On the other hand, the expression of ND2 gene remained unchanged after the rotenone treatment, suggesting the rotenone-mediated mitochondrial inhibition did not affect the mitochondrial gene expression. Five pM rotenone strongly inhibited the cellular proliferation. Electron microscopy and an electrophoretic analysis of DNA showed that the majority of the HL-60 cells were induced into typical apoptosis within 24-48 hours. On the basis of this and other studies, we believe that mitochondrial function is directly involved in both cellular differentiation and apoptotic cell death.     

拓扑替康抑制HL-60细胞增生和诱导凋亡机制与c-myc的关系

目的探讨拓扑替康（TPT）抑制白血病细胞的作用机制。方法采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学方法,检测TPT作用后c—myc mRNA及其蛋白的表达情况。结果0．15μmol／L TPT作用HL-60细胞12h后,HL-60细胞c—myc mRNA表达为0．17±0．03,与空白对照组的1．11±0．25相比明显降低,差异具有统计学意义（P〈0．05）。HL-60细胞c—myc蛋白表达阳性细胞百分率为19．67％,较空白对照组的68．33％明显降低,差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论拓扑替康抑制HL-60细胞增生和诱导凋亡可能是通过c—myc途径起作用的。     

c-myc特异性siRNA 对HL-60细胞作用的研究

目的研究针对c-myc基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对白血病细胞株HL-60细胞增殖及c-myc蛋白表达的影响,探讨应用siRNA进行白血病基因治疗的可能性。方法制备特异性对应c-myc基因的siRNA转染HL-60细胞,倒置显微镜观察细胞形态学改变,MTT法检测细胞增殖状态,免疫细胞化学染色法检测c-myc蛋白表达的改变。结果siRNA转染HL-60细胞后,细胞生长受抑,增殖能力减弱,其增殖抑制作用于转染后48h、72h最明显,增殖抑制率分别为53.2%和51.5%;免疫细胞化学染色结果显示c-myc蛋白阳性率从空白组(76.67±4.35)%下降至(23.33±3.56)%。结论针对c-myc基因的siRNA对HL-60细胞增殖及c-myc蛋白表达有明显抑制作用,有望为白血病提供新的治疗途径。     

Relationship of c-myc expression to differentiation and proliferation of HL-60 cells

We have compared changes in c-myc expression in HL-60 promyelocytic leukemia cells induced to differentiate by dimethyl sulfoxide or growth inhibited in an undifferentiated state. Under these conditions, c-myc expression did not correlate with the proportion of proliferating cells. The kinetics of the decrease in c-myc expression upon differentiation induction is paralleled closely by an increasing proportion of histochemically detected differentiated myeloid cells and by a decrease in clonogenic potential but not by changes in the proportion of proliferating cells. Changes in c-myc expression subsequent to differentiation induction can therefore be directly related to the differentiation process rather than to a cell cycle-related phenomenon.     

Differential effect of 6-ethylmercaptopurine on c-myc expression in wild-type and HGPRT-deficient HL-60 cells

Summary A variety of compounds inhibit the growth and induce differentiation of human promyelocytic leukemia (HL-60) cells. HL-60 subclones that lack the purine salvage enzyme hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transferase (HGPRT) can also be induced to differentiate with purine analogs. Mechanisms by which purine analogs induce differentiation offer unique possibilities for cancer chemotherapy. We have studied the effect of the purine analog 6-ethylmercaptopurine (e⁶MP) on the growth and induction of differentiation in both wild-type and HGPRT-deficient HL-60 cells. We have previously shown that e⁶MP inhibits cell growth in both wild-type and HGPRT-deficient HL-60 cells without activation through salvage pathways [8]. In this report we evaluate the effect of e⁶MP on c-myc mRNA expression. c-Myc mRNA, which is amplified in HL-60 cells, has been shown to play a role in the induction of granulocytic differentiation in HL-60 cells. e⁶MP transiently down-regulates c-myc mRNA in wild-type cells but has no efect on c-myc mRNA expression in HGPRT-deficient HL-60 cells. Despite the differential effects of e⁶MP on c-myc mRNA, both wild-type and HGPRT-deficient HL-60 cells appear to engage in terminal differentiation. The morphological changes and nonspecific esterase activity induced by e⁶MP suggest differentiation down the monocytic pathway. However, early monocytic markers such as the rapid induction of c-fos and the stabilization of c-fms mRNA are not observed. In addition, e⁶MP inhibits TPA-induced monocytic/macrophage differentiation as characterized by stabilization of c-fms mRNA and cellular adherence.Abbreviations e⁶MP 6-ethylmercaptopurine - 6-TG 6-thioguanine - MP 6-mercaptopurine - 8-AzaG 8-azaguanine - FBS fetal bovine serum - HGPRT hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Supported by grant CH-396 (R.W.T., M.R.G.) from the American Cancer Society, developmental grant IN16Y (B.T.F.) from the American Cancer Society, and grant P30-CA-16058-15 [OSUCCC] from the National Cancer Institute, Department of Health and Human Services     

急性淋巴细胞白血病伴CD13表达免疫表型分析

目的：探讨急性淋巴细胞白血病（acutelymphocytic leukemia,ALL）伴CD13表达的免疫表型特点,对包括CD33在内的其他抗原进行相关性分析.方法：对85例初诊ALL患者进行免疫学分型,以是否表达My把B-ALL和T-ALL分为My＋ALL和My-ALL,进行组间分析.结果：全部85例B-ALL和T-ALL患者均高表达B系和T系相关抗原（100%,100%）.所有的B-ALL均不表达T-ALL相关抗原,所有T-ALL均不表达B-ALL相关抗原.CD13的表达率为31%（B-ALL31.4%,T-ALL 28.6%）.My＋B-ALL和My＋T-ALL患者的CD13阳性细胞的中位数高于My-B-ALL和My-T-ALL患者,P值分别为0.013和0.04.My＋B-ALL患者的CD15阳性细胞的中位数高于My-B-ALL患者,P=0.000 1.结论：白血病免疫分型对于白血病的诊断、治疗和预后判断均有很大帮助,其在临床诊断中的推广将有助于患者的诊断和治疗.CD13在My＋ALL中表达较高（31%）,白血病细胞在恶性演变过程中不同时期表现出特征反映,其临床意义有待于重新评价.