慢病毒介导COX-2基因的shRNA对子宫内膜癌侵袭力的影响

目的:探讨慢病毒介导COX-2基因的shRNA对子宫内膜癌HEC-1B细胞侵袭力的影响。方法:设计、合成4对针对COX-2基因shRNA的寡核苷酸序列,分别构建质粒,转染293T细胞,据其对COX-2的抑制率,筛选最有效的COX-2基因RNAi靶序列,设计并合成其shRNA的双链DNA Oligo,与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的pGCL-GFP线性化载体连接产生重组慢病毒质粒LV-COX-2-ShRNA,并行PCR和测序鉴定。将LV-COX-2-ShRNA,pHelper 1.0和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平采用逐孔稀释滴度法测定病毒滴度。重组慢病毒感染人子宫内膜癌HEC-1B细胞,行RT-PCR和western-blot验证COX-2基因的沉默效果,用Transwell侵袭试验检测HEC-1B细胞体外侵袭力的改变。结果:成功构建COX-2基因RNA干扰慢病毒载体并获得相应的慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×107Tu/ml。和对照组相比,RNA干扰组HEC-1B细胞COX-2基因的mRNA水平和蛋白水平的抑制率分别为61.87%和67.48%;其穿过人工基底膜的平均数为16.6,明显少于空白对照组50.2及非特异性siRNA感染组47.2,侵袭抑制率为64.8%(P<0.01)。结论:RNA干扰可有效抑制HEC-1B细胞的侵袭能力。     

Skp2RNA干扰慢病毒载体对子宫内膜癌HEC-1-A细胞生长的影响

[目的]构建S期激酶相关蛋白2（Skp2）特异性RNA干扰慢病毒表达载体,观察其对子宫内膜癌HEC-1-A细胞中Skp2表达的影响,研究Skp2基因沉默对HEC-1-A细胞生长的抑制作用。[方法]构建针对Skp2基因的慢病毒LV—shRNA载体,转染HEC-1-A细胞,倒置荧光显微镜观察GFP的转染效率,半定量RT—PCR和Western blotting检测各组细胞Skp2基因表达,细胞计数分析Skp2RNA干扰对HEC-1-A细胞增殖的影响。f结果]重组病毒质粒经PCR和测序证实准确连接。转染慢病毒载体的HEC-1-A细胞较之转染阴性对照载体的细胞,其Skp2的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降,而且细胞增殖明显受到抑制。[结论]利用RNA干扰技术,可有效下调Skp2基因的表达,并在体外抑制子宫内膜癌HEC—1—A细胞的生长。Skp2有望成为子宫内膜癌辅助基因治疗的潜在靶点。     

COX-2与子宫内膜癌的关系

目的 研究子宫内膜癌中环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达及其与临床病理因素的关系。探讨COX-2在子宫内膜癌发生、发展中的作用。方法 采用免疫组织化学S-P法检测20例正常子宫内膜、20例不典型增生子宫内膜、45例子宫内膜癌等3组标本的COX-2蛋白表达水平。结果 正常子宫内膜、不典型增生内膜及子宫内膜癌组织中率分别为15.0％（3／20）、50.0％（10／20）、77．8％（35／45），由正常子宫内膜至子宫内膜癌的进展过程中，COX-2的阳性表达率呈现逐渐增高的趋势。COX-2阳性表达率与子宫内膜癌的分期、淋巴结转移、肌层浸润深度、病理类型无明显相关性。高分化内膜癌COX-2阳性表达率（89.3％）高于中低分化内膜癌（58．8％），P〈0．05。结论 COX-2在子宫内膜癌发生、发展中起着重要的作用。COX-2表达上调可能是子宫内膜癌形成中的早期事件。     

COX-2及NF-κB p65在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨COX-2及NF-κB p65在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义.方法 选择正常子宫内膜组织者60例(对照组),子宫内膜癌60例(观察组),两组都进行COX-2及NF-κB p65的表达检测,同时进行了相关性分析.结果 对照组COX-2阳性表达率为3.3%,观察组为55.0%.对照组NF-κB p65阳性表达率为23.3%,观察组为63.3%,对比差异都有统计学意义(P<0.05).在观察组中,随着子宫内膜癌的病理分期增加、分化程度的减少、淋巴结转移的发生,COX-2、NF-κB p65的阳性表达率都呈现增高的趋势,对比差异都有统计学意义(P<0.05).Spearman等级相关分析结果显示COX-2与NF-κB p65的表达呈正相关(γ=0.307,P<0.05).结论 COX-2、NF-κB p65在子宫内膜癌中呈现高表达状况,且分化程度低、分期晚、发生转移者高于分化程度高、分期早、未发生转移者,两者在子宫内膜癌发生发展中起共同促进作用.     

慢病毒介导的LKB1基因在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的表达

目的：探讨慢病毒系统介导的LKB1基因在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的过表达,为进一步研究LKB1基因在子宫内膜癌的作用机制奠定基础。方法以PCR扩增LKB1克隆质粒获得全长cDNA,将LKB1 cDNA链接到慢病毒载体pWPI,构建慢病毒表达质粒LKB1/pWPI。通过与包装质粒pCMV-Dr8.74和pMD2.G共转染293T细胞进行病毒包装,用包装成功后的病毒液感染子宫内膜癌HEC-1A细胞,以荧光定量PCR、Western blot法检测HEC-1A细胞中LKB1的相对表达量。结果成功扩增LKB1全长cDNA和构建LKB1重组慢病毒表达载体LKB1/pWPI。转染包装293T细胞后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞HEC-1A。转染后HEC-1A-LKB1-pWPI细胞中LKB1的表达率明显高于亲本细胞和空白对照细胞（P〈0.01）。结论成功构建携带LKB1基因的慢病毒表达载体,包装病毒后能有效地感染子宫内膜癌HEC-1A细胞,为进一步探讨LKB1基因在子宫内膜癌中的生物学效应奠定了基础。     

HER-2/neu COX-2 PGE2 P450arom在子宫内膜癌组织的表达及其相关性研究

探讨子宫内膜腺癌组织中HER-2/neu、COX-2、PGE2、P450arom 4种生物学指标的表达,分析这4种生物学指标表达强度之间相关性及与临床病理因素的相关性。方法:应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HER-2/neu、COX-2、P450arom及PGE2在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生和子宫内膜腺癌组织中的表达情况。结果:HER-2/neu、COX-2、P450arom及PGE2在癌组织中表达高于非癌组织,有显著性差异（P<0.01）。癌组织中HER-2/neu与COX-2、P450arom表达强度呈正相关（r值分别为0.931,0.934,P<0.05）,COX-2与P450arom表达强度亦呈正相关（r=0.908,P<0.05）。COX-2mRNA和PGE2表达强度变化呈正相关（r=0.552,P<0.05）。结论:HER-2/neu、COX-2、P450arom及PGE2可能存在协同作用,共同促进子宫内膜腺癌的发生发展。      

人子宫内膜癌组织COX-2和CD44V6及Bcl-2表达临床意义分析

目的:探讨人子宫内膜癌组织中环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、CD44V6及Bcl-2的表达状况及其临床意义。方法:使用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测55例人子宫内膜癌组织及36例癌旁组织中COX-2、CD44V6及Bcl-2蛋白表达。结果:子宫内膜癌组织中COX-2、CD44V6和Bcl-2蛋白的表达率分别为(39.06±18.51)%、(36.73±2.97)%和(12.52±5.23)%,癌旁组织中分别为(2.85±1.42)%、(2.93±1.78)%和(3.07±1.66)%。三者在癌组织中的表达明显高于癌旁组织,差异有统计学意义,P<0.05。COX-2及CD44V6表达与人子宫内膜癌患者的年龄(P=0.08)、病理分级(P=0.11)无关,而与肿瘤的分期及淋巴结转移有关,P<0.05。Bcl-2蛋白表达与患者年龄、病理分级、临床分期及淋巴结转移均无关,P>0.05。COX-2与CD44V6蛋白表达正相关,r=0.507,P<0.01;COX-2及CD44V6与Bcl-2蛋白表达无关。结论:人子宫内膜癌组织中COX-2和CD44V6高表达的患者更易发生浸润、转移,且两者有正协同作用。Bcl-2与人子宫内膜癌的发生有一定关系。     

shRNA沉默COX-2基因表达对人肝癌细胞生物学特性的影响

背景与目的:环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在肝癌组织中呈高表达,参与肝癌的发生发展.本研究探讨COX-2短发夹状RNA(shrt hairpin RNA,shRNA)对人肝癌细胞株HepG2中COX-2表达及细胞粘附侵袭力的影响.方法:以人COX-2 mRNA编码区中两条不同序列作为RNA干扰靶点,分别构建两个以绿色荧光蛋白GFP为报告基因的shRNA真核表达载体质粒WBH1和WBH2,应用阳离子脂质体转染HepG2细胞,分别观察转染后24 h、48 h、72 h和96 h COX-2 mRNA和蛋白表达的变化,检测抑制效果.MTT法观察HepG2细胞与Matrigel胶粘附性的变化.Transwell小室实验以穿过人工基底膜的细胞数量评估HepG2细胞体外侵袭力的变化.结果:质粒在HepG2细胞的转染率约为60%.质粒WBH1导人细胞24 h、48 h、72 h和96 h后,COX-2mRNA表达抑制率分别为18.5%、88.6%、52.8%和42.4%(P＜0.01),蛋白表达抑制率分别为10.3%、80.5%、45.3%和39.0%(P＜0.01).转染WBH2质粒的HepG2细胞COX-2表达无明显变化(P＞0.05).转染后48 h,转染WBH1质粒的HepG2细胞与Matrigel胶的粘附率为(6.0±0.4)%,与空白对照组(11.4±0.2)%相比明显下降(P＜0.01),抑制率为47.4%.转染WBH1质粒的细胞穿膜数为(8.2±1.5),与空白对照组(22.8±1.7)相比有显著性差异(P＜0.01),抑制率为63.7%.转染WBH2质粒的HepG2细胞粘附率和穿膜细胞数均无明显变化(P＞0.05).结论:shRNA真核表达载体明显干扰HepG2细胞的COX-2表达,能有效抑制HepG2细胞的体外粘附侵袭力.     

慢病毒介导的αB-晶状体蛋白基因沉默对子宫内膜癌ISK细胞增殖和迁移能力的影响

目的:研究αB-晶状体蛋白(CRYAB)基因在子宫内膜癌增殖和迁移中发挥的作用.方法:利用慢病毒介导的RNA干扰技术,沉默子宫内膜癌ISK细胞系CRYAB基因.通过CCK-8、Transwell和细胞划痕实验分别检测CRYAB基因沉默后细胞增殖和迁移能力的变化.结果:Real-time PCR和Western blot结果均表明成功构建稳定转染的细胞株.CCK-8实验结果显示CRYAB病毒转染组与对照组相比,细胞的增殖能力显著降低(P<0.05);Transwell迁移实验和细胞划痕实验结果显示,病毒转染组的细胞迁移率明显低于对照组(P<0.01).结论:慢病毒干扰载体能有效抑制CRYAB基因在子宫内膜癌细胞系ISK中的表达,进而抑制细胞增殖和迁移.证实CRYAB在子宫内膜癌侵袭和转移中发挥重要作用.     

沉默CDK7对子宫内膜癌细胞顺铂敏感性的影响

  目的   研究沉默CDK7对子宫内膜癌细胞HEC-1-A顺铂化疗敏感性的影响。   方法   根据CDK7的基因序列设计合成不同的CDK7 siRNA片段并转染子宫内膜癌细胞HEC-1-A,通过实时定量PCR和Western blot验证RNA干扰的效果后,选择效果最优的CDK7 siRNA片段特异性沉默子宫内膜癌细胞中CDK7的表达,采用MTT细胞毒性实验、流式细胞仪及Hochest/PI双染色荧光显微镜技术检测转染前后该细胞系对化疗药物顺铂敏感性的变化。   结果   共选择了4个位点设计CDK7 siRNA并成功转染子宫内膜癌细胞系HEC-1-A,实时定量PCR及Western blot验证了各组的干扰作用,证实CDK7-423干扰效果最强,达70%以上。选择CDK7-423转染HEC-1-A,MTT细胞毒性实验结果发现在CDK7表达被抑制后,DDP的IC₅₀由45.122 g/mL降为3.200 g/mL,细胞毒性显著增高（P < 0.05）。流式细胞仪检测结果:CDK7低表达组细胞平均凋亡率细胞为37.57%,与高表达组细胞（11.66 %）相比,凋亡率明显增加（P < 0.05）。Hochest/PI双染色荧光显微镜下可见CDK7低表达组HEC-1-A细胞与亲代细胞比较,凋亡小体明显增多。   结论   通过CDK7 siRNA转染下调子宫内膜癌细胞中CDK7的表达以后,可以明显增强子宫内膜癌细胞对DDP的化疗敏感性,使子宫内膜癌细胞凋亡增加。CDK7可作为子宫内膜癌治疗的新靶点进行更加深入的研究。      

环氧合酶-2、前列腺素E2在大肠腺瘤和腺癌组织中的表达

目的:研究COX-2、PGE2在大肠腺瘤和腺癌组织中的表达和意义。方法:选取组织标本118例,其中正常大肠黏膜30例,大肠腺瘤43例,大肠腺癌组织45例。Real Time PCR法检测组织中COX-2mRNA的表达,免疫组织化Elivision法检测组织中COX-2的蛋白表达,放射免疫法测定组织中PGE2含量。结果:COX-2在大肠腺癌组织中的mRNA的表达、阳性表达率及光密度值分别高于大肠腺瘤及正常黏膜组(P<0.05);且大肠腺瘤组高于正常黏膜组(P<0.05)。大肠腺癌组织PGE2含量高于大肠腺瘤及正常大肠黏膜(P<0.01);且大肠腺瘤高于正常大肠黏膜(P<0.01)。结论:大肠黏膜癌变过程中COX-2表达增高,PGE2合成增多。     

鼻咽癌组织中COX-2表达与树突状细胞浸润的相关性研究

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)在鼻咽癌(NPC)组织中的表达及其与树突状细胞(DCs)浸润的关系.方法 采用免疫组化S-P法检测32例NPC组织中COX-2表达及其与DCs浸润程度的关系.结果 COX-2在NPC组织中的阳性表达率为87.5%,正常鼻咽黏膜组织中的阳性表达率为6.25%,差异有统计学意义(P<0....     

CHK1和CHK2 shRNA转染对食管癌细胞照射后G2期阻滞的影响

目的 观察RNA干扰细胞周期检测点激酶CHK1和CHK2表达对食管癌细胞照射后G2期阻滞的影响。方法 CHK1和CHK2基因各选择4段序列分别设计合成短发卡状RNA（shRNA）,分别与pENTR^TM／U6质粒连接后转染Eca109食管癌细胞。采用Western blotting检测CHK1和CHK2蛋白表达,RT-PCR检测其mRNA表达,流式细胞仪检测5Cy照射后细胞周期变化,克隆法检测5Cy照射后细胞存活率。结果 CHK1和CHK2基因各成功建立4个序列的shRNA连接质粒,转染Eca109细胞后均使其蛋白表达降低。用抑制效果最好的CHKI和CHK2shRNA转染Eca109细胞后,其mRNA表达下降;在转染后72h,子一代细胞CHK1和CHK2蛋白仍明显降低,并使5Cy照射后1h的CHK2-T68磷酸化水平降低,而对CHK1-S345磷酸化水平无明显影响。CHK1 shRNA转染的Ecal09细胞在5Gy照射后12h时,明显减轻G2期阻滞程度;转染后72h和5Cy照射后12h,子一代Eca109细胞G2期阻滞仍明显低于单纯5Gy照射组;而CHK2shRNA转染不影响照射后C2期阻滞。CHK1和CHK2shRNA转染可降低5Gy照射后Eca109细胞存活率。结论 shRNA转染对CHK1和CHK2蛋白表达的抑制效应至少可以持续3d,且可传递给子代细胞;CHK1 shRNA转染可以减轻Eca109细胞照射后G2期阻滞,增加放射敏感性。     

腺病毒介导的cox-2反义RNA对食管癌细胞株生长的影响

目的：构建表达人环氧化酶－2（cyclooxygenase-2,cox-2)反义RNA的腺病毒载体,研究其对人食管癌细胞生长的影响。方法：把人cox-2基因的cDNA片段反向克隆于穿梭质粒pHCMVSP1A的CMV启动子之下,获得pAd-AShcox-2,通过脂质体与pJM17共转染293细胞,经同源重组产生编码cox-2反义RNA的重组腺病毒－Ad-AShcox-2,PCR鉴定为阳性克隆并大量扩增,转染食管癌细胞EC9706,用生长细胞计数,3H－TdR掺入及免疫细胞化学的方法,研究对食管癌细胞生长,cox-2表达,DNA合成的影响,结果：成功构建编码cox-2反义RNA的重组腺病毒Ad-AShcox-2,病毒感染EC9706后,cox-2表达降低,3H－TdR掺入量减少,与对照组比较P＜0．001,同时发现食管癌细胞的生长受抑制,结论：减少cox-2的表达可能是治疗食管癌的一种新途径。     

Impact of Co-transfection with Livin and Survivin shRNA Expression Vectors on Biological Behavior of HepG2 Cells

Objective: To construct short hairpin RNA (shRNA) eukaryotic expression vectors targeting Livin andSurvivin genes, and to explore the impact of co-transfection of Livin and Survivin shRNA expression vectors onthe biological behavior of HepG2 cells. Methods: shRNA eukaryotic expression vectors pSD11-Livin and pSD11-Survivin were designed and constructed then transfected into HepG2 cells separately or in combination. mRNAand protein expression in transfected cells was assessed by quantitative fluorescence PCR and Western blotting,respectively. Cell proliferation was measured by MTT assay and cell apoptosis by TUNEL assay. Results: TheLivin and Survivin shRNA eukaryotic expression vectors were successfully constructed and transfected intoHepG2 cells. The relative mRNA expression levels of Livin and Survivin in HepG2 cells co-transfected withpSD11-Livin and pSD11-Survivin were 0.12 ± 0.02 and 0.33 ±0.13, respectively, which was significantly lower thanlevels in cells transfected with either pSD11-Livin or pSD11-Survivin (P<0.05). The relative protein expressionlevels of Livin and Survivin in the co-transfected cells were also significantly decreased compared to singletransfection(P<0.05). The inhibition rate of cell growth in the co-transfection group was higher than that in thesingle-transfection groups at 48 h, 60 h, or 72 h after transfection (P<0.01). The apoptotic rate increased to thegreatest extent in the co-transfection group relative to any other group (P<0.05). Conclusions: Co-transfectionwith pSD11-Livin and pSD11-Survivin was more efficient than transfection with either vector alone in reducingthe mRNA and protein expression of Livin and Survivin genes in HepG2 cells. Co-transfection also inhibited theproliferation of transfected cells more than the other groups, and induced cellular apoptosis more effectively.     

胃癌及胃溃疡组织中环氧合酶2的表达

目的　探讨环氧合酶 2 (cyclooxygenase 2 ,COX 2 )蛋白在胃癌组织、正常胃黏膜组织以及胃溃疡组织中的表达及其意义。方法　应用免疫组化方法 (SP法 )检测 3 6例胃癌组织及其癌旁正常胃黏膜组织以及 12例胃溃疡组织中COX 2蛋白的表达。结果　胃癌组织中COX 2蛋白的表达水平显著高于癌旁正常胃黏膜及胃溃疡组织 ,差异具有显著性 (P <0 0 1) ;有淋巴结转移的胃癌组织中COX 2蛋白的表达水平高于无淋巴结转移者 ,差异具有显著性 (P <0 0 5 ) ;Ⅲ Ⅳ期胃癌组织的COX 2蛋白的阳性表达水平明显高于Ⅰ Ⅱ期 ,差异具有显著意义 (P <0 0 5 )。结论　COX 2蛋白的过表达参与了胃癌的演进。     

siRNA靶向沉默胃癌MKN45细胞COX-2基因对Notch基因表达的影响

目的：探讨siRNA靶向沉默COX-2基因表达对人胃癌MKN45细胞增殖和凋亡能力的影响和相关机制研究。方法：通过COX-2小干扰RNA转染胃癌细胞MKN45为实验组,转染siRNA control为阴性对照组,以未转染细胞为空白组,转染48h后,RT-PCR法检测靶向沉默COX-2基因的效果以及Notch信号通路相关基因的表达水平,MTT法检测各组MKN45细胞的增殖能力,流式细胞术分析各组细胞凋亡,Western blot检测COX-2,N1ICD,N2ICD和Hes-1蛋白表达水平。结果：靶向沉默COX-2基因可明显抑制MKN45细胞增殖和提高凋亡率。靶向沉默COX-2基因可明显下调COX-2和Hes-1 mRNA 水平,而对Notch1和Notch2 mRNA水平无明显影响。靶向沉默COX-2基因可明显下调COX-2,N1ICD,N2ICD和Hes-1蛋白表达水平。结论：靶向沉默COX-2基因可抑制胃癌细胞MKN45增殖和促进凋亡,可能是通过抑制Notch信号通路实现的。     

RNA interference of pax2 inhibits growth of transplanted human endometrial cancer cells in nude mice

The development of human endometrial carcinoma(HEC) is a complex pathologic process involves several oncogenes and tumor suppressor genes.The full-length paired-box gene 2(pax2),a recently discovered oncogene,promotes cell proliferation and growth and inhibits apoptosis of HEC cells.Here,we examined the effect of pax2 small interfering RNA(siRNA) on the growth of transplanted HEC cells in nude mice.The expression of Pax2 in 21 cases of normal endometrium and 38 cases of HEC was examined by immohistochemistr...     

Cisplatin and vinorelbine in advanced and/or metastatic adenocarcinoma of the endometrium: A new highly active chemotherapeutic regimen

Purpose:To date the systemic treatment of recurrent and/ormetastatic adenocarcinoma of the endometrium (EAC), using bothchemotherapy and hormonotherapy (HT), is far from satisfactory. Thesignificant activity of vinorelbine (VNR), a relatively newsemisynthetic vinca alkaloid, demonstrated in advanced breast cancer,bronchial adenocarcinoma, and in head and neck cancer, prompted us tocarry out a phase II trial employing the combination of cisplatin andVNR in a pluri-institutional series of patients with recurrent and/ormetastatic EAC. Patients and methods:Thirty-fivepatients affected by recurrent and/or metastatic EAC have been treatedwith CDDP 80 mg/m² on day 1 plus VNR 25 mg/m² i.v.bolus on days 1 + 8. This cycle was repeated every 21 days. After threecycles patients were restaged for objective response. Analysis ofresponse rate and duration, overall survival, and toxicity pattern werethe main aims of the study. Results:Twenty out ofthirty-five patients achieved a major objective response for an overallresponse rate of 57% (95% confidence limits (CL):39%–74%). Four patients had a complete response(11%; 95% CL: 3%–27%) with a medianprogression-free survival (PFS) of eight hundred fourteen days, whilesixteen patients had a partial response (46%; 95% CL:29%–63%) with a median PFS of one hundredeighty-four days. Six patients had stable disease and nine progressed.All patients who achieved a clinical complete response had only a singlesite of disease at entry, but no association was noted between number ofinvolved sites and likehood of achieving PR. Median overall survival was240 days, while that of patients with complete and partial response was855 and 300 days, respectively. Treatment was quite well tolerated withfew cases of grade 3–4 myelosuppression. Alopecia was virtuallyabsent and neurotoxicity was mild. One patient complained of an acutepain syndrome at the tumor site. Conclusions:The CDDP +VNR regimen is quite active against recurrent and/or metastaticendometrial adenocarcinoma, at least in terms of objective response ratewhich is among the highest ever reported in medical literature. However,duration of objective response and median overall survival are in thedisappointing range reported for other regimens. In our opinion the CDDPplus VNR regimen is good enough to be compared to theanthracycline-based regimens and may represent the basis for futuredevelopment of newer active polychemotherapeutic schedules.