Fascin真核表达载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的:构建fascin基因的pcDNA3.1(+)表达载体pcDNA3.1(+)-fascin,将其转染肺癌A549细胞,观察其表达,并检测转染前后细胞内F-肌动蛋白(F-actin)的变化。方法:应用RT-PCR从Hela细胞中扩增fascin基因,酶切后和真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,获得重组表达载体pcDNA3.1(+)-fascin。经酶切、电泳,DNA测序鉴定后,将其及对照空载体转染肺癌A549细胞,采用Western blotting检测fascin在A549细胞中的表达情况;免疫荧光染色后采用激光共聚焦显微镜观察fascin对F-actin的影响。结果:成功克隆fascin基因片段,并将其重组到pcDNA3.1(+)载体中,经酶切及DNA测序鉴定正确。pcDNA3.1(+)-fascin转染A549细胞,Western blotting鉴定转染后fascin在A549细胞中高表达。激光共聚焦显示fascin基因能够在A549细胞内促进F-actin形成丝状突出。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-fascin真核表达载体,并将其转染肺癌A549细胞;激光共聚焦观察显示fascin能够促进A549细胞内F-actin形成丝状突出,可能是促进A549细胞转移的结构基础之一。     

姜黄素逆转电离辐射诱导的非小细胞肺癌A549细胞上皮间质转化

目的 探讨姜黄素对电离辐射诱导的非小细胞肺癌A549细胞上皮间质转化的影响。方法 用电离辐射诱导A549细胞发生上皮间质转化,将其命名为A549R。CCK8法检测细胞增殖;Western blot检测姜黄素对A549R上皮/间质标志物表达的影响;划痕实验及Transwell实验检测姜黄素对A549R细胞迁移能力的影响。结果 A549R细胞经姜黄素处理后,细胞形态由纺锤形转变为椭圆形上皮形态;E-cadherin表达下调,pan-Keratin表达上调,Vimentin、Twist表达显著下调,N-cadherin表达水平无明显变化;划痕愈合面积随姜黄素浓度的升高而显著下降;A549R细胞迁移能力随姜黄素浓度的升高而显著下降。结论 姜黄素通过下调E-cadherin、Vimentin、Twist的表达,并上调Keratin的表达,从而逆转电离辐射诱导A549细胞发生上皮间质转化。     

氯喹靶向溶酶体增加非小细胞肺癌A549细胞对紫杉醇的敏感性

目的:探讨靶向溶酶体药物氯喹对非小细胞肺癌A549细胞对紫杉醇的化疗敏感性的影响.方法:以紫杉醇及氯喹作用于A549细胞,Lyso-Tracker Red DND-99进行细胞内溶酶体染色,采用荧光显微镜观察细胞内溶酶体变化,应用MTT比色法比较药物对A549细胞的生长抑制作用.结果:在紫杉醇作用的A549细胞浆内可观...     

马钱子碱抑制非小细胞肺癌A549细胞生长并增强顺铂敏感性

摘 要：［目的］ 评估马钱子碱对非小细胞肺癌A549细胞的增殖、侵袭和迁移的影响,并探讨其增强化疗敏感性。［方法］ 采用NSCLC细胞系A549为研究对象,分别采用CCK-8法、集落形成实验和细胞侵袭、迁移实验检测马钱子碱对A549细胞活力、侵袭和迁移的影响;应用Western blot检测马钱子碱对PTEN、Akt和p-Akt蛋白表达影响。［结果］ 马钱子碱或顺铂单独有效抑制细胞生长、细胞集落的发育以及细胞的侵袭和迁移（P<0.05）,并且马钱子碱和DDP联合处理对细胞的抑制作用强于单独的化合物（P<0.05）。Western blot分析结果显示,在A549细胞中,马钱子碱（20μg/ml）处理增加PTEN蛋白的表达（P<0.05）减少了p-Akt蛋白表达（P<0.05）,并且hsa-miR-21 minic可部分抑制马钱子碱对PTEN蛋白表达的促进作用。［结论］ 马钱子碱可抑制肺癌的进展,增强抗癌药物顺铂对肺癌细胞的作用。     

APE1表达变化对人非小细胞肺癌细胞A549增殖的影响

目的:探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)对人非小细胞肺癌细胞A549增殖能力的影响,为肺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法:使用脂质体转染法将重组表达质粒pSIREN-RetroQ-APE1-shRNA和pOZN-HA-APE1导入A549细胞,免疫印迹检测APE1表达情况。MTT、平板克隆实验、免疫印迹检测APE1对非小细胞肺癌细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果:重组载体pSIREN-RetroQ-APE1-shRNA转染细胞后,显著抑制A549细胞中APE1蛋白的表达,与对照组相比,增殖速率明显下降(P＜0.05),平板克隆形成显著减少(P＜0.05),并阻止细胞周期G0/G1期向S期转化,降低CDK2表达。而过表达APE1可增加A549细胞活力,促进细胞增殖,促进细胞周期G0/G1期向S期转化。结论:APE1表达下调对非小细胞肺癌细胞A549生长具有抑制作用,为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。     

肺癌A549细胞上皮-间质转化及其对微小RNA表达的影响

目的 探讨肺癌A549细胞上皮-间质转化(EMT)对微小RNA(miRNA)表达的影响.方法 采用不同浓度的转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肺癌A549细胞发生EMT,应用相差显微镜观察A549细胞形态学变化,采用Western blot法检测EMT相关标记蛋白表达的变化,应用miRNA芯片检测EMT前后miRNA表达的变化,应用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCT)验证芯片结果的可靠性.结果 肺癌A549细胞发生EMT后,细胞形态拉长,细胞间连接变得疏松.肺癌A549细胞发生EMT后,上皮标记蛋白E-钙黏附素(E-cadherin)表达降低,而间质标记波形蛋白(Vimentin)和纤维连接蛋白(Fibronectin)表达上调.miRNA芯片获得51个miRNA在诱导前后有统计学意义(P＜0.05),且表达差异在2倍以上.18个表达上调,33个表达下调,其中mir-33a和mir-193a-3p的表达经诱导后分别下调了92.8%和86.5%;荧光定量RT-PCR检测mir-33a和mir-193a-3p的表达经诱导后分别下调了73.1%和56.6%.结论 EMT可影响肺癌A549细胞中miRNA的表达变化,miRNA可能通过EMT调节肺癌侵袭转移.

Abstract：

Objective To investigate the effect of epithelial-mesenchymal transition (EMT) on the expression of microRNAs (miRNAs) in lung cancer A549 cells. Methods Transforming growth factor beta1 (TGF-β1) in different concentrations was used to induce EMT in lung cancer A549 cells. The morphological changes were observed under phase-contrnst microscope. The changes of EMT-related proteins were analyzed by Western blot. The changes of miRNAs expression after EMT were detected by microRNA (miRNA) array. Real time quantitative RT-PCR was applied to verify the reliability of miRNA array results.Results The lung cancer A549 cells became elongated and the cell-cell junction became loose after EMT.The epithelial protein marker E-cadherin was down-regulated and the mesenchymal protein markers vimentin and fibronectin up-regulated. There were 51 miRNAs showing statistically significunt changes of expression more than double (P ＜ 0. 05 ) after EMT. Among them 18 were up-regulated and 33 down-regulated. Of them, mir-33a was down-regulated by 92.8% and mir-193a-3p by 86.5%. Real time quantitative RT-PCR showed that mir-33a was down-regulated by 73.1% and mir-193a-3p by 56.6%. Conclusion Epithelial-mesenchymal trnsition has effects on the expression of miRNAs, and miRNAs may regulate the invasion and metastasis of lung cancer cells via EMT.     

斑蝥素诱导人肺癌A549细胞凋亡及其分子机制的研究

目的探讨斑蝥素诱导人肺癌A549细胞的凋亡作用及其分子机制。方法采用MTT法检测斑蝥素对A549细胞的增殖抑制作用;以光镜、电镜、流式细胞仪、Annexin V—FITC标记法和DNA凝胶电泳检测细胞凋亡;以蛋白印迹法分析斑蝥素对bcl-2、Bax和Survivin蛋白表达的影响。结果斑蝥素能抑制A549细胞的增殖;斑蝥素处理A549细胞后,光镜与电镜下可见到明显的凋亡细胞;细胞周期的G1期前有低于二倍体细胞的凋亡峰;Annexin V-FITC标记法的定量检测进一步证实了斑蝥素诱导细胞凋亡的作用;DNA凝胶电泳显示出典型的凋亡细胞特征;蛋白印迹检测表明斑蝥素可使Bax表达升高,bcl-2和Survivin表达下降。结论斑蝥素能显著抑制A549细胞增殖,诱导细胞凋亡,并主要通过调节Bax、bcl-2和Survivin等蛋白的表达来实现。     

非小细胞肺癌细胞分泌蛋白谱的鉴定

目的筛选非小细胞肺癌潜在的早期诊断标志物，对非小细胞肺癌细胞系A549的分泌蛋白进行鉴定。方法收集A549细胞培养上清中的蛋白进行蛋白双向电泳，应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS）及生物信息学鉴定A549凝胶上特有的蛋白质点。结果鉴定出人属的蛋白质点17个，包括α肌动蛋白，γ肌动蛋白，α烯醇酶（ENO1），锰-超氧化物歧化酶（MnSOD），谷胱甘肽S转移酶P（GSTP1—1），Dihydrodiol dehydrogenase 2（DDH），磷酸甘油酸变位酶1（PGAM1），葡萄糖依赖性胰岛素释放肽受体（GIPR），肽基脯氨基顺反异构酶（PPIA），磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP），蛋白基因产物9．5（PGP9．5），Peroxiredoxin1（PDX1），Galectin-1及专利蛋白WO0222660等。结论该研究为非小细胞肺癌早期诊断标志物的筛选提供了新的方法和候选分子。     

X射线对人肺癌A549细胞Bmi-1表达的影响

目的：研究X射线照射对人肺癌A549细胞株中Bmi-1 mRNA和蛋白表达的影响。方法：用不同剂量（0、2、4、6Gy）的X射线照射体外培养的人肺癌A549细胞株,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测照射0、6、12、24、48和72 h后Bmi-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果：与对照组比较,2、4、6 Gy X射线照射A549细胞后48 h内Bmi-1 mRNA表达升高,差异均有统计学意义（P〈0.05）;（2 Gy 48 h组除外）,2 Gy组照射后6 h、4 Gy组12 h、6 Gy组24 h升高最显著（P〈0.05）。照射后48 h内蛋白表达升高（4Gy除外）,48 h后蛋白表达逐渐下降,至72 h时接近未照射组水平。各时间点（除4 Gy 48 h和72 h外）的蛋白表达与对照组相比差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：在本实验条件下,2～6 Gy剂量X射线照射48 h内可使人肺癌A549细胞Bmi-1表达升高,之后表达逐渐降低。     

ADAM9基因干涉对非小细胞肺癌细胞（A549）体外及体内增殖的影响

目的:探讨解聚素金属蛋白酶9(ADAM9)基因对非小细胞肺癌细胞（A549）增殖的影响。方法:采用RT-PCR、免疫细胞化学、Western blot及ELISA法检测ADAM9基因在A549细胞中的表达;采用MTT法检测不同浓度ADAM9基因对A549细胞体外增殖及变化的影响; 观察不同浓度ADAM9基因干涉A549细胞在裸鼠体内成瘤后生长情况。结果:ADAM9基因在A549细胞中主要表达于细胞间质和细胞浆中,在细胞膜中的表达较少;人ADAM9基因对A549细胞干涉后,其增殖活性与对照组对比显著增强(P＜0.01);人ADAM9基因对A549裸鼠体内成瘤后干涉显示,ADAM9基因对移植瘤增生促进较对照组显著（P＜0.05）。结论:人ADAM9基因对A549细胞体外干涉及其体内成瘤后干涉结果均有促进作用。     

RNA干扰沉默 NS 基因对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究RNA干扰沉默核干细胞因子（nucleostemin, NS ）基因表达对人肺腺癌A549细胞株增殖和凋亡的影响。方法：向A549细胞内分别转染靶向 NS 基因的siRNA表达载体pcDNA4/C-NS-silencer和空载体pcDNA4/C vector作为silencer组和vector组,以不转染质粒的A549细胞为normal组,Real-time PCR检测转染pcDNA4/C-NS-silencer对A549细胞内 NS 基因表达的影响。CCK-8法检测沉默 NS 基因对A549细胞增殖的影响,流式细胞术检测对细胞周期的影响,Hoechst33258核染色法和流式细胞术检测对细胞凋亡的影响。结果： Silencer组 NS 基因表达较vector组和normal组明显被抑制（0.166±0.024 vs 0.497±0.022、0.505±0.032, 均 P <0.01）;Silencer组A549细胞增殖活性显著低于vector组和normal组 (0.518±0107 vs 0.855±0.102、0.832±0.158,均 P <0.05);Silencer组A549细胞周期阻滞于G0/G1期;Silencer组细胞核皱缩呈致密浓染,染色质碎裂呈块状并有边集现象,且细胞凋亡率较vector组与normal组显著增高\[(34.80±6.77)% vs (9.70±150)%, (8.16±2.01)%, P <0.01\]。 结论： RNA干扰沉默 NS 基因可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖,促进细胞凋亡。     

Testin在非小细胞肺癌组织和细胞株中的表达及其对癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨Testin基因(TES)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织和细胞株中的表达及其对人肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响.方法:收集2015年1月至2015年12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院手术切除的27例NSCLC患者的癌组织及癌旁组织标本,用Western blotting法检测癌组织和癌旁组织,以及正常人胚肺成纤维细胞株MRC5和肺癌细胞株A427、A549、H1299、LK2、PC9和SW900中TES蛋白的表达水平.应用短发卡RNA(shRNA)瞬时转染肺癌细胞株A549干扰TES基因的表达,并进一步检测TES低表达对A549细胞增殖、迁移、侵袭以及凋亡的影响,同时检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Cas-pase-3的表达.结果:在NSCLC组织和细胞株中TES蛋白的表达明显下降(均P＜0.05).shTES干扰A549细胞后,TES mRNA和蛋白表达水平均显著下降(均P＜0.05).抑制TES表达显著增强A549细胞的增殖[(2.75±0.04) vs (1.79±0.06),P＜0.05]、迁移[(52.3±2.6)％s(19.7±1.4)%,P＜0.05]和侵袭能力[(31.2±3.9)％vs(14.5±4.1)％,P＜0.05],同时降低了细胞凋亡率[(8.2±1.1)％s(23.1±1.7)％,P＜0.05].TES低表达使A549细胞Bax和Caspase-3蛋白表达明显下降(P＜0.05)、Bcl-2蛋白表达明显升高(P＜0.05).结论:TES在NSCLC组织中呈低表达,TES表达下调具有促进肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡等生物学效应,其有可能成为肺癌治疗一个新靶点.     

Gab2对人肺癌细胞A549侵袭能力影响及其机制的探讨

目的:探讨Grb2协同结合蛋白2(Grb2binding protein-2,Gab2)对人肺癌A549细胞体外迁移和侵袭的影响及其机制。方法:将质粒pGCsilencerU6/GFP/Neo-RNAi-Gab2#1、pGCsilencerU6/GFP/Neo-RNAi-Gab2#2和对照空载质粒转染到A549细胞中,建立Gab2低表达的siGab2/A549#1、siGab2/A549#2细胞和对照SCR/A549细胞。应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测小分子干扰RNA(siRNA)干扰Gab2表达后的基因和蛋白表达水平。趋化运动实验检测细胞的迁移能力;体外侵袭实验检测细胞的侵袭能力;蛋白质印迹法检测siRNA干扰Gab2表达后,A549细胞在胰岛素样生长因子-1(insulinlike growth factor-1,IGF-1)刺激下基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metal-loproteinase-9,MMP-9)的表达及磷酸化Akt(pAkt)、磷酸化人雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamy-cin,pmTOR)的活化情况。结果:siRNA干扰Gab2表达后,RT-PCR测定A549细胞Gab2mRNA相对表达量为1.340±0.009,Scr/A549细胞为1.201±0.074,siGab2#1/A549细胞为0.315±0.008,siGab2#2/A549细胞为0.289±0.007。蛋白印迹法检测A549细胞Gab2蛋白表达量为0.205±0.003,Scr/A549细胞为0.241±0.004,siGab2#1/A549细胞为0.128±0.002,siGab2#2/A549细胞为0.066±0.001。siGab2#2/A549细胞与A549细胞比较Gab2基因表达显著降低,t=168.032,P<0.001;Gab2蛋白表达也显著降低,t=64.352,P<0.001。siGab2#2/A549细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于SCR/A549细胞,t值分别为5.101和10.812,P值分别为0.029和0.002。在IGF-1刺激下,siGab2/A549细胞的MMP-2、MMP-9蛋白的表达量不再有明显变化,t值分别为-2.051和-2.652,P值分别为0.054和0.064。siGab2/A549细胞中pAkt、pmTOR的活化也显著抑制。结论:Gab2可能通过调节Akt/mTOR信号通路,促进A549细胞的侵袭能力。     

NET-1 shRNA抑制肺癌细胞A549中NET-1表达及对癌细胞增殖的影响

目的:探讨转染PSilencer4.1 - NET -1 shRNA进入肺癌细胞株A549后对细胞中NET -1基因的表达及细胞增殖的影响.方法:转染PSilencer4.1 - NET -1 shRNA进入肺癌细胞株A549,同时设立空转染对照组与空白组,Western blot检测细胞NET -1蛋白,逆转录聚合酶链反应(RT - PCR)检测癌细胞中NET -1mRNA的含量,WST -8法检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期的相关变化.结果:PSilencer4.1 - NET-1 shRNA转染组中NET -1 mRNA的含量及细胞NET -1蛋白与对照组比较明显降低,实验组细胞的增殖明显慢于对照组与空白组,癌细胞阻滞在G1期占63.24％,S期细胞比例明显下降,与对照组比较均有统计学意义(P＜0.05).结论:肺癌细胞中NET -1持续低表达可导致癌细胞增殖抑制、生长减慢,在肺癌患者的预后判断中有一定的参考价值.     

Effect of Withaferin A on A549 Cellular Proliferation and Apoptosis in Non-small Cell Lung Cancer

Objective: To explore the effect of Withaferin A on A549 cellular proliferation and apoptosis in non-smallcell lung cancer (NSCLC). Materials and Methods: NSCLC cell line A549 was selected to explore the effect ofWithaferin A on A549 cellular proliferation, apoptosis and the PI3K/Akt signal pathway capable of regulatingtumor biological behavior by assessment of cellular proliferation, cellular apoptotic rates and cellular cyclingas well as by immuno-blotting. Results: Withaferin A could inhibit A549 cellular proliferation and the controlrate was dosage-dependent (P<0.05), which also increased time-dependently with the same dosage of WithaferinA (P<0.05). The apoptotic indexes in A549 cells treated with 0, 2.5, 5.0, 10.0 and 20.0 μmol·L-1 Withaferin Afor 48 h were significantly different (P<0.05). In addition, the apoptotic rates of each group in both early andadvanced stages were higher than those in 0 μmol·L-1 (P<0.05), which were evidently higher after 48 h thanthose after 24 h (P<0.05). A549 cells treated by Withaferin A for 48 h were markedly lower in Bcl-2 level andobviously higher in Bax and cleaved caspase-3 levels than those treated by 0 μmol·L-1 Withaferin A (P<0.05), andthere were significant differences among 5, 10 and 20 μmol·L-1 Withaferin A (P<0.05). The ratios of A549 cellstreated by Withaferin A for 48 h in G0/G1 stage were higher than those in 0 μmol·L-1 , while those in S and G2/Mstages were obviously lower than those in G2/M stage, and there were significant differences in 5.0, 10.0 and 20.0μmol·L-1 Withaferin A (P<0.05). Additionally, p-Akt/Akt values were in reverse association with dosage, and thedifferences were significant (P<0.05). Conclusion: Withaferin A can inhibit the proliferation and apoptosis ofA549 cells by suppressing activation of the PI3K/Akt pathways.     

肺腺癌A549细胞抗失巢凋亡相关基因的确认及C8orf4基因的表达

目的：比较抗失巢凋亡及正常贴壁生长肺腺癌A549细胞基因组表达差异,从中筛选肺癌抗失巢凋亡相关基因,并探讨C8orf4基因的高表达及其对失巢凋亡的正性调剂作用意义。方法：建立抗失巢凋亡肺癌A549细胞系;用基因芯片技术检测其与正常贴壁生长A549细胞的差异基因,利用NCBI Pubmed数据库筛选出肺癌细胞抗失巢凋亡相关的基因,找出差异表达倍数最大的基因,运用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术及蛋白质印迹技术测定其表达。结果：共检测到表达差异的基因745个,筛选出63个与肺癌细胞抗失巢凋亡相关的基因,C8orf4基因差异表达倍数最大,在脱落培养A549细胞中C8orF4基因及其编码蛋白表达明显高于贴壁培养A549细胞,P〈0.02。结论：基因芯片技术为筛选肺癌抗失巢凋亡相关基因提供了有效方法,C8ORF4基因可能参与调控肺癌细胞抗失巢凋亡过程。