多药耐药基因转染人骨髓间充质干细胞对其化疗保护作用的研究

目的:慢病毒介导的多药耐药基因(mdr1)转染人骨髓间充质干细胞(hBMSCs),探讨其对化疗药物的耐受性。方法:采用percoll密度离心法自骨髓中分离MSCs并进行纯化和扩增,流式细胞仪鉴定。克隆mdr1基因,构建慢病毒载体,命名为TG-005-mdr1/tap。脂质体转染法转染携带mdr1基因的逆转录病毒载体导入293T包装细胞,获得的病毒上清感染hMSCs,GTP荧光技术和western-blot检测mdr1基因的表达,MTT法检测hMSCs对化疗药物的耐受性。结果:成功构建携带mdr1基因的慢病毒载体,采用GTP荧光技术检测慢病毒转染率达83.44%,western-blot检测mdr1编码产物P-pg蛋白高表达,转染后hMSCs对化疗药物的耐受性明显高于对照组。结论:转染mdr1基因后的hMSCs具有化疗耐受性,可为化疗骨髓防护提供新思路。     

慢病毒载体介导IL-24基因转导人骨髓间充质干细胞的实验研究

背景与目的 以人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)作为抑癌基因IL-24的细胞载体的研究目前未见报道.应用Gateway法构建共表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和IL-24基因的慢病毒载体,探讨其对hBMSCs的转导情况,为今后肿瘤的基因治疗奠定基础.方法 应用DNA重组技术构建含有IL-24和EGFP基因的慢病毒表达载体,并与慢病毒包装系统(ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix)共转染293FT细胞,收集上清,纯化浓缩,测定重组病毒的滴度.取重组慢病毒感染hBMSCs,通过嘌呤霉素筛选并纯化hBMSCs,应用实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)及ELISA法分别检测hBMSCs中IL-24mRNA及IL-24蛋白水平的表达情况.结果 成功构建了共表达IL-24和EGFP基因的重组慢病毒载体,经包装、纯化及浓缩,病毒滴度为7.25× 107 PFU/mL.重组慢病毒转导hBMSCs后,通过筛选获得纯化,转导效率可达到100％.qPCR检测示:转导组IL-24 mRNA表达明显高于未转导组(P＜0.05);ELISA法检测显示转导组hBMSCs上清液IL-24蛋白表达40 μg/L,未转导组为阴性.结论 构建的携带IL-24基因的重组慢病毒载体可有效转导hBMSCs,表达IL-24蛋白.     

逆转录病毒载体介导MDR1基因转染人外周血造血干细胞的研究

目的：多药耐药基因（ＭＤＲ１）的异常扩增和过度表达是肿瘤细胞产生多药抗药性的重要原因之一。本研究试图将ＭＤＲ１导入骨髓或外周血造知干细胞并使入获得耐药表型,以用于减轻大剂量化疗对造血细胞的毒性。方法：应用反转录病毒载体ｐＨａＭＤＲ１／Ａ将ＭＤＲ１阳性。ＰＣＲ法检测转染细胞所 ＣＦＵ－ＧＭ落集中,外源ＭＤＲ１阳性比例为１／４;而未转染细胞所形成的ＣＦＵ－ＧＭ集匀为阴性。集落形成试验证明,转染和非转染     

多药耐药基因转导对人造血祖细胞的化疗保护作用

耐药患者的增加是目前临床治疗恶性肿瘤面临的主要问题。多药耐药基因(ｍｄｒ1)编码的相对分子质量为170000的跨膜糖蛋白(Ｐ170),可将多种化疗药物如泰素(Ｔａｘｏｌ)、阿霉素(Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ)、长春新碱(ＶＣＲ)、鬼臼乙叉甙(ＶＰ16)等排出细胞外,从而避免药物对细胞的损害。正常骨髓造血干祖细胞ｍｄｒ1基因表达水平极低,因而对化疗极其敏感。将ｍｄｒ1基因导入骨髓造血细胞可避免或减轻肿瘤化疗对骨髓的毒性,从而提高肿瘤治疗效果。本研究旨在探讨将ｍｄｒ1基因导入人ＣＤ34 细胞的转导效率及对造血祖细胞耐受化疗药物的保护作用…     

不同重组病毒载体在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染效率及基因表达

目的：探讨不同的重组病毒载体对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）的转染效率和外源基因表达水平,为利用骨髓间充质干细胞进行细胞和基因治疗提供实验依据。方法：采用淋巴细胞分离液、密度梯度离心及体外培养方法分离rMSCs,流式细胞仪检测细胞表面CD11b、CD45和CD90的表达鉴定细胞类型。进一步用携带绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的重组Ad5-EGFP、Ad5F35-EGFP、rAAV1/2-EGFP、rAAV2-EGFP及Lentivirus-EGFP转染体外培养的rMSCs,荧光显微镜观察、流式细胞仪检测EGFP阳性率和荧光强度。结果：rMSCs细胞表面CD11b、CD45和CD90阳性率分别为（14.1±3.3）%、（1.1±0.4）%和（82.3±5.7）%。Ad5-EGFP按10、100和1000MOI转染rMSCs,2d后流式细胞仪检测,EGFP阳性率分别为（33.6±2.7）%、（88.6±1.0）%及（99.9±0.1）%,荧光强度为4.4±0.3、39.8±1.5及811.4±3.9;Ad5F35-EGFP按10、100和1000MOI转染rMSCs,2d后阳性率分别为（96.9±0.4）%、（99.9±0.1）%及（99.7±0.1）%,荧光平均强度为369.3±14.8、895.4±7.5及703.2±38.4;rAAV1/2-EGFP及rAAV2-EGFP按1×104和1×105vg/细胞转染rMSCs,6d后阳性率分别为（0.94±0.31）%及（1.30±0.36）%,和（2.16±0.38）%及（3.90±0.33）%;LV-EGFP按30（TU/细胞）转染rMSCs,6d后阳性率为（60.5±3.2）%,荧光强度为27.0±3.6。结论：Ad5、Ad5F35及LV能够有效转染体外培养的rMSCs并表达外源基因,转染效率与病毒的用量间存在量效关系。     

骨髓间充质干细胞在胶质瘤研究中的应用

骨髓间充质干细胞(MSC)在体内具有向肿瘤部位定向迁移能力,是比较理想的基因治疗"细胞载体".通过转染或转导的方法,在体外使MSC携带目的 基因,并获得稳定表达,然后将它们移植到宿主体内,发挥治疗作用.这种先体外后体内的过程在胶质瘤等多个系统肿瘤中进行了研究,获得阳性结果.MSC移植的安全性值得关注,其中与宿主肿瘤细胞...     

肿瘤的造血干细胞多药耐药基因治疗研究进展

造血干细胞具有多系分化潜能及自我更新能力，其生命周期长，是基因转移的理想靶细胞。这种转基因的造血干细胞可在造血组织中长期稳定表达目的产物，而较成熟的祖细胞作为靶细胞时其基因表达相对短暂。将多药耐药（ＭＤＲ１）基因转移至造血干细胞，在体内存在抗癌药物时具有选择优势，可提高化疗剂量，保护骨髓不受高剂量化疗药物损伤。本文从以下几个方面综述造血干细胞ＭＤＲ基因疗法的原理、临床应用方案及其前景。     

骨髓间充质干细胞体内外对胃癌细胞的趋向性

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cell,hBMSC)对胃癌细胞的趋化性,为将MSC研发成为胃癌基因治疗载体提供实验依据.方法:骨髓培养法分离培养hBMSC并进行流式细胞术鉴定.Transwell实验检测hBMSC对胃癌MKN45细胞和人成纤维细胞(human fibroblast,hFB)的趋化能力.建立MKN45细胞裸鼠移植瘤模型,感染Lenti-EGFP(MOI为50)的hBMSC或hFB细胞经尾静脉注射入荷瘤小鼠,荧光显微镜下观察移植瘤组织及各脏器GFP的表达.结果:培养第3代的hBMSC细胞CD44、CD105阳性率为(96.7±1.84)％、(98.1±0.95)％,而CD34、CD45表达阴性.hBMSC细胞向MKN45细胞的趋化能力明显强于胃上皮细胞GES-1组及空白对照细胞[(239.5-54.3)vs(43.57±4.6)、(37.3±4.7)个,P＜0.01],且hBMSC向MKN45细胞的趋化能力明显强于hFB细胞向MKN45细胞的趋化能力[(239.5 ±54.3)vs(27.7 ±16.7),P＜0.01].与hFB相比,hBMSC对胃癌移植瘤组织具有明显趋向性;hBMSC组移植瘤组织内可见GFP表达,移植瘤小鼠部分肝脏(20％)及肺脏(20％)有GFP表达,但较移植瘤组织内GFP表达率和强度均低(P＜0.05).结论:hBMSC在体内外对胃癌细胞均有特异性趋化作用,有望研发为胃癌基因治疗的良好载体.     

骨髓间充质干细胞在异基因骨髓移植中的研究进展

骨髓间充质干细胞(MSCs)是骨髓基质细胞的前体细胞,分泌多种造血相关因子,表达多种黏附因子,同时具有免疫调节功能,在造血微环境发挥重要作用.因此,利用MSCs做滋养层,体外扩增造血干细胞(HSC),临床联合移植MSCs和HSC,提高造血重建的能力,减少或减轻移植物抗宿主病(GVHD)的发生,具有很广阔的研究前景.     

骨髓间充质干细胞在异基因骨髓移植中的研究进展

骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓基质细胞的前体细胞,分泌多种造血相关因子,表达多种黏附因子,同时具有免疫调节功能,在造血微环境发挥重要作用。因此,利用MSCs做滋养层,体外扩增造血干细胞（HSC）,临床联合移植MSCs和HSC,提高造血重建的能力,减少或减轻移植物抗宿主病（GVHD）的发生,具有很广阔的研究前景。     

TNF-α增强多药耐药基因1 对骨髓保护的研究*

目的:探讨通过采用肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha ,TNF-α）预处理靶细胞,增强腺病毒转染小鼠单个核细胞的效率,从而增强多药耐药基因保护骨髓的能力,实现化疗中对骨髓的保护。方法:采用AdEasy-1 腺病毒载体系统重组表达MDR1 的重组腺病毒Ad-MDR 1,通过Ad5-MDR 1 感染不同浓度TNF-α 预处理后的小鼠单个核细胞,荧光倒置显微镜结合流式细胞仪监测转染率,RT-PCR 及Western blot检测TNF-α 干预后MDR1基因在靶细胞中的表达。结果:最适浓度TNF-α 预处理后,流式细胞仪检测TNF-α 预处理组腺病毒转染率（26.26%）明显高于未处理组（11.96%）;RT-PCR 和Western blot检测TNF-α 预处理组MDR1 mRNA 和P-糖蛋白（P-gp）的表达均明显高于未处理组。结论:适合浓度的TNF-α 可以明显增强腺病毒对小鼠单个核细胞的转染率,增强多药耐药基因在靶细胞中的表达,实现化疗中对骨髓的有效保护。      

骨髓间充质干细胞在造血干细胞移植中的应用研究

造血干细胞移植(HSCT)后,干细胞的成活、分化、增殖及造血功能的恢复,影响治疗的效果,移植过程中难免会遇到诸多问题。如造血微环境的破坏,干细胞归巢问题及移植后的移植物抗宿主反应(GVHR)均影响移植成败。近年研究发现骨髓间充质干细胞(MSC)为造血微环境的重要组成成分,可分泌多种细胞因子,能够促进造血,加速干细胞归巢,还能参与免疫反应,降低T淋巴细胞反应。而MSC的这些特性恰好可以减少HSC中的以上问题。因此,国内外已将HSC与MSC共移植治疗恶性肿瘤应用于临床,并取得了良好的临床效果。     

食管癌多药耐药基因和多药耐药相关蛋白基因的研究

目的：探讨食管癌组织中多药耐药基因（ｍｄｒ－１）和多药耐药相关蛋白基因（ｍｒｐ）表达的意义。方法：运用逆转录－多聚酶链反应（ＰＴ－ＰＣＲ）技术检测了３２全 管癌患者的癌组织标本及癌旁组织中ｍｄｒ－１、ｍｒｐ表达,分析其与肿瘤分化程度,浸润深度及淋巴结转移的关系。结果：３２例食管癌组织中ｍｄｒ－１、ｍｒｐ表达的阳性率均高于癌旁组织（Ｐ〈０．０１,Ｐ〈０．０２５）,两基因的表达水平也显著高于癌旁组织（     

多药耐药基因的检测

多药耐药（ＭＤＲ）现象是恶性肿瘤化疗失败的常见原因。人体内ＭＤＲ１表达的低水平,不均匀、变异性及广泛性,给ＭＤＲＩ基因检测及解释带来困难。目前理想的检测方法是联合分析糖蛋白（Ｐ－ｇｐ）水平（如ＩＨＣ）、ｍＲＮＡ（如ＰＴ－ＰＣＲ或ｍＲＮＡ原位杂交）及Ｐ－ｇｐ功能（药物或杂料排出）的多参检验,同时应用合适的标准化系列细胞株作为参照,只有建立能被广泛接受且简单可靠的定位及定量检测ＭＤＲ１基因的方法,才能     

多药耐药基因在人体肿瘤组织中的检测及其意义

目的：探讨多药耐药基因产物p170糖蛋白在人体肿瘤组织中的表达及意义。方法：采用免疫组化LSAB法，对人体144例肿瘤做了p170检测。结果：人体多数肿瘤表达p170，表达率为64．58％(93／144)。其中高表达的肿瘤有大肠癌(45／73)、乳腺癌(17／l9)、甲状腺癌(5／6)、胃癌(6／l3)、膀胱癌(3／3)、食管癌(3／4)、卵巢癌(2／2)等。表达率与性别、年龄、淋巴结转移无明显关系。结论：多数人体肿瘤组织内存在多药耐药基因。开展该项检测对化疗药物的选择、效果的判断及预后具有重要的意义。     

肺癌化疗多药耐药与逆转策略

恶性肿瘤化疗失败的主要原因是多药耐药的发生。研究表明,多药耐药的机制十分复杂,P-gp、TopoⅡ、GST-π、金属硫蛋白(metallothionein,MT)及p53基因突变等是肺癌产生多药耐药的物质基础。本文重点介绍非小细胞肺癌耐药因子及耐药逆转的对策,以指导临床化疗药物的筛选及治疗方案的优化,有助于提高肺癌患者的生存期和生存率。     

间充质干细胞在骨肉瘤发生发展中的作用研究进展

骨肉瘤是一种骨组织来源的恶性程度极高的恶性肿瘤,其具体的发生机制尚在探索之中。在骨肉瘤的发生和发展过程中,不仅肿瘤细胞本身发挥着重要作用,肿瘤微环境的作用同样不可忽略。多项研究证实肿瘤微环境中的间充质干细胞(MSC)参与了骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、转移和耐药。此外,由于MSC具有强大的自我更新能力和多向分化潜能,利用这些重要特性可以将MSC应用于临床,为肿瘤的治疗提供新的方案。本文主要对MSC在骨肉瘤发生发展中的研究进展及临床应用前景作一综述。     

肿瘤干细胞与肿瘤多药耐药相关性研究

肿瘤的多药耐药机制有多种,其中认为最主要的机制是由ABC转运蛋白介导的。随着干细胞研究的深入,有专家认为肿瘤的复发和转移是肿瘤干细胞逃脱药物杀伤作用的结果。肿瘤的多药耐药性可能是干细胞赋予肿瘤的能力。     

转染人突变dhfr基因的小鼠骨髓细胞对小鼠造血功能的长期保护作用

目的:将转染了人突变dhfr基因的第二代小鼠骨髓,移植给经致死剂量照射的第三代小鼠,观察该基因对小鼠造血功能的长期保护作用.方法:分离存活的第二代小鼠骨髓有核细胞,直接移植给经致死剂量照射的同系小鼠,以MTX筛选,观察小鼠血象和生存率变化,PCR和Southem印迹杂交分析目的基因在小鼠染色体DNA中的整合与表达情况.结果:在大剂量MTX筛选下,实验组小鼠造血功能逐渐恢复,对照组3周内全部死亡.实验组生存率和生存期明显高于对照组,但较前两代生存率低.PCR和Southern印迹分析结果提示,实验组脾脏和肝脏组织中均检测到前病毒标志基因neo~R和dhfr基因的特异务带.结论:转染了人突变dhfr基因的第二代小鼠骨髓,能有效地重建经致死剂量照射的第三代小鼠造血功能.保护骨髓免遭大剂量MTX所致的严重骨髓抑制,dhfr基因在小鼠基因组DNA中的稳定整合是这种长期保护作用的物质基础.