HRM法检测肺癌EGFR基因突变

目的:HRM法检测中国不同区域肺癌患者的EGFR基因突变,统计突变类型间比率,为临床EGFR-TKI分子靶向治疗提供依据,并验证HRM法的临床适用性。方法:收集2010年手术切除的肺癌石蜡标本253例,HRM法检测EGFR基因突变情况,并用基因测序法进行验证。结果:在253例肺癌标本中,HRM法检测出EGFR基因突变率为42%,与基因测序法检测出的突变率40%无显著性差异,并检测出2例T790M突变,11例多点突变和2例E18新位点突变。将本实验中收集的东部地区和非东部地区肺癌患者的EGFR基因突变率相比较,无显著性差异。经实验验证,HRM法的灵敏度高于基因测序的灵敏度,且HRM法的特异性为100%。结论:HRM技术具有高灵敏度、高特异性和高准确率等特点,且比基因测序法更简单方便,成本更低,适合在临床开展。明确EGFR突变类型十分必要,可以为临床可否运用EGFR-TKI分子靶向治疗提供重要依据。本实验中收集的肺癌标本EGFR基因突变不存在地域差异。     

HRM方法检测肺腺癌患者癌性胸水上清液EGFR基因突变的临床意义

目的:探讨应用HRM方法检测肺腺癌患者癌性胸水上清液EGFR基因突变状况及EGFR酪氨酸激酶受体抑制剂治疗的可行性。方法:收集43例肺腺癌患者癌性胸水上清液标本,提取DNA,应用HRM方法检测EGFR基因第18、19、20、21外显子突变状况。统计分析HRM方法与基因测序法检测EGFR突变率的差异。结果:43例肺腺癌患者癌性胸水上清液中,HRM法检测EGFR基因突变共17例,总突变率为39.53%,其中第19外显子突变14例,第21外显子突变3例。基因测序结果显示:EGFR突变14例,总突变率为32.56%,均为第19外显子突变。HRM方法检测第21外显子突变阳性的患者其基因测序结果均为阴性。这可能与HRM方法检测的灵敏度优于测序方法有关。两者突变率差异无统计学意义（P>0.05）。结论:对难以获取组织标本的肺腺癌患者而言,应用HRM方法检测其癌性胸水上清液,是了解其EGFR基因突变状况的可靠途径,对临床筛查靶向治疗药物具有一定的参考价值。     

高分辨率熔解曲线技术检测非小细胞肺癌患者胸水中EGFR基因突变

目的探讨高分辨率熔解曲线(HRM)技术对非小细胞肺癌(NSCLC)患者胸水标本EGFR基因突变进行检测的可行性及临床意义。方法采用高分辨率熔解曲线技术检测30例非小细胞肺癌患者胸水标本EGFR基因18-21外显子基因突变,并与Sanger测序法检测结果进行对比分析。结果HRM法检测胸水中EGFR基因18-21外显子突变总检出率为26.67%(8/30),Sanger测序法检测突变总检出率为23.33%(7/30)。HRM法与Sanger测序法相比,敏感性为100%,特异性为95.83%,阳性预测值为88.89%,阴性预测值为100%。结论运用HRM技术对非小细胞肺癌患者胸水进行EGFR基因突变检测方法可行,适宜推广。     

改良的内切酶突变体富集法检测肺癌标本中EGFR基因突变

背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变是肺癌靶向药物疗效的可靠预测指标,因此基因突变的检测具有非常重要的临床意义。本研究建立使用常规实验仪器、高灵敏度、简便的检测表皮生长因子受体突变的方法,以利于临床中快速的检测EGFR基因突变。方法采用改良的内切酶法富集法检测251例肺腺癌DNA标本中EGFR基因外显子19缺失突变和21(L858R)点突变,并与直接测序进行比较。利用混合突变/野生型EGFR基因的细胞系测定改良方法的灵敏度。结果在251例腺癌标本DNA中使用测序法检测出EGFR外显子19突变46例、外显子21突变26例。采用改良的突变体富集法检另外测出外显子19突变78例、外显子21突变57例,总突变率53.8%。灵敏度检测显示对于外显子19和21,新方法的检测灵敏度达0.5%。结论本方法具有简便、经济、灵敏度高等特点,便于临床快速筛查非小细胞肺癌病理组织中的EGFR基因突变。     

高分辨率熔解曲线分析技术检测EGFR基因突变方法的建立及其初步临床应用

目的建立高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)分析技术检测表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变的方法,并探讨其的临床应用价值。方法建立HRM技术检测EGFR基因突变方法,并用其检测200例非小细胞肺癌患者肿瘤石蜡包埋标本,并与测序法的结果进行比较。结果所建HRM检测方法 Tm与ct值的CV值均较小,重复性好。HRM法检测标本EGFR基因突变的结果与测序法相比,突变总检出率分别为40.0%和37.0%,敏感性为100%,特异性>95%。结论 HRM法检测EGFR基因突变,敏感性高,特异性强,重复性好,操作简便,节约时间,成本低,适用于临床。     

高分辨率熔解曲线技术检测结直肠癌患者KRAS基因突变

目的探讨高分辨率熔解曲线技术(HRM)检测结直肠癌患者KRAS基因突变的可行性及其临床意义。方法采用HRM技术检测60例结直肠癌患者石蜡包埋组织标本KRAS基因2号外显子12和13位密码子突变,并与Sanger测序法检测结果进行对比分析。结果 HRM法检测结直肠癌患者KRAS基因2号外显子12和13位密码子突变检出率为36.67%(22/60),Sanger测序法检测突变检出率为33.33%(20/60)。HRM法检测突变检出率高于Sanger测序法,HRM法检测敏感性为100%,特异性为95.24%。结论 HRM法检测KRAS基因突变,灵敏度高,敏感性和特异性好,具有操作简便、节约时间、成本低的特点,方法可行。     

非小细胞肺癌原发灶与淋巴结转移灶中KRAS和EGFR基因状态的比较及其临床意义

  目的  比较表皮生长因子受体(EGFR)基因和KRAS基因在非小细胞肺癌原发灶及其淋巴结转移灶之间突变状态的差异, 并分析其与吉非替尼治疗非小细胞肺癌(NSCLC)疗效之间的关系。   方法  收集天津医科大学附属肿瘤医院2010年5月至2010年11月间手术切除的80例NSCLC病例标本, 利用直接测序和实时荧光定量PCR的方法分别检测原发灶和相应淋巴结转移灶中EGFR基因第18、19、20、21外显子及KRAS基因第12、13密码子的突变情况; 其中5例在淋巴结转移灶中检出EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)敏感型基因突变的患者接受了吉非替尼的新辅助靶向治疗。   结果  80例患者中, 检出原发灶携带KRAS和EGFR基因突变分别为1例和21例, 检出转移灶携带KRAS和EGFR基因突变分别为7例和26例; 分别有6例(7.50%)和7例(8.75%)患者其KRAS和EGFR基因状态在原发灶和转移灶之间不一致。直接测序法和实时荧光定量PCR法的检测结果一致。在5例接受吉非替尼治疗的患者中仅1例原发病灶中未检出EGFR-TKI敏感型基因突变, 并表现为疾病进展。   结论  部分NSCLC患者中KRAS和EGFR的基因状态在肿瘤转移过程中会发生改变, 在给予患者靶向治疗时不应忽视这一现象的存在。实时荧光定量PCR法比直接测序法更适用于临床的快速检测工作。      

特异引物双扩增实时PCR法和Sanger DNA测序法检测肺癌组织中表皮生长因子受体基因突变

目的 探讨特异引物双环探针扩增实时PCR技术表皮生长因子受体(EGFR)检测方法(ADx-EGFR实时PCR法)和Sanger DNA测序法在肺癌EGFR基因体细胞突变检测中的临床价值.方法 收集肺癌组织石蜡切片208例,分别采用ADx-EGFR实时PCR法和Sanger DNA测序法检测肺癌组织中EGFR基因外显子18、19、20、21的突变类型,计算其突变率,分析两种检测方法检测EGFR基因突变的一致性.结果 208例肺癌组织中,ADx-EGFR实时PCR法成功检测208例,检出EGFR基因突变40例,突变检出率为19.2％;Sanger DNA测序法成功检测196例,检出突变22例,突变检出率为11.2％.肺癌组织中主要以外显子19缺失和外显子21上的L858R的点突变为主,分别占4.8％ (10/208)和11.6％ (23/208),其余的突变类型少见.结论 对于甲醛固定石蜡包埋组织而言,ADx-EGFR实时PCR法检测EGFR基因成功率和突变检出率均高于Sanger DNA测序法,可成为临床上检测肿瘤EGFR基因突变的方法.     

变性高效液相色谱技术检测非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变的研究

 目的　探讨采用变性高效液相色谱（DHPLC）技术检测表皮生长因子受体（EGFR）基因突变的优势。方法　应用DHPLC技术检测49例非小细胞肺癌（NSCLC）患者EGFR基因第19与21外显子突变情况,并应用DNA直接测序法验证DHPLC检测基因突变的准确性。结果　49例NSCLC患者中,应用DHPLC检测出13例EGFR基因突变;其中第19外显子缺失突变10例（76.92 %）;第21外显子替代突变3例（23.08 %）。DNA直接测序法突变检测结果与DHPLC一致,DHPLC检测EGFR基因突变灵敏度为100 %。结论　DHPLC技术可以快速、准确、大规模筛选EGFR基因突变。     

EGFR突变对NSCLC预后的影响

目的 探讨EGFR基因突变对非小细胞肺癌患者临床特征,预后的价值,揭示OS≥3生存的的影响因素。 目的 回顾性分析2013-01-01至2018-06-30南京医科大学附属肿瘤医院接受个体化治疗的349例NSCLC患者的临床资料。对应收集的石蜡包埋组织标本,采用HRM法,检测组织中EGFR基因第18、19、20、21外显子的突变状态,χ2分析EGFR基因突变与患者临床病理参数的相关性,Kaplan-Meier方法和χ2分析随访完整的249例EGFR基因突变情况对生存的影响,揭示OS≥3生存的的影响因素。 目的 在349例NSCLC肺癌患者中,EGFR基因突变率为50.4%,EGFR基因主要高突变人群是女性腺癌患者。在249例随访完整的患者中,女性,EGFR基因的总突变和21突变,能显著提高PFS和OS,差异具有统计学意义(P 目的 EGFR基因的总突变和21突变的患者均能明显延长生存期。尤其是TNM分期早,女性,21突变的患者,都可以针对性尝试靶向治疗,提高生存时间。     

Direct serum and tissue assay for EGFR mutation in non-small cell lung cancer by high-resolution melting analysis

Biological therapy with epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKIs) have noted promising outcomes for patients with non-small cell lung carcinoma (NSCLC), especially those with mutated EGFR. Tissue EGFR gene mutation testing can predict the benefit of taking a first-line EGFR-TKI, thus, allowing the physician to prescribe the most suitable therapy. Unfortunately, most lung cancer patients, especially NSCLC patients present with advanced disease that is surgically unresectable. The goal of this study was to develop high-resolution melting (HRM) assays to detect EGFR mutations in exons 18 to 21, compare their sensitivity and concordance to direct sequencing, and evaluate the feasibility and reliability of serum as a tissue alternate for routine EGFR mutation screening. EGFR mutations of 126 Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE), 47 fresh frozen tissues and from 47 matched pre-operation serum specimens of NSCLC patients were screened by the HRM assays. EGFR mutations by HRM were confirmed through sequencing. We found 78 EGFR mutations in 70 FFPE tissues, 25 EGFR mutations in 24 fresh frozen tissues, with a mutation rate of 55.56% (70/126) and 51.06% (24/47), respectively. Most mutations were correctly identified by sequencing. EGFR mutations were detected in 22 serum samples from 24 tissue EGFR mutation-positive patients. The concordance rate between serum and tissue in EGFR mutation screening was 91.67%. We conclude that the HRM assay can provide convincing and valuable results both for serum and tissues samples, thus, it is suitable for routine serum EGFR mutation screening for NSCLC patients, especially those surgically unresectable.     

Study of the Correlation of EGFR and K-RAS Gene Mutations with Its Protein Expression in Non-small Cell Lung Cancer

OBJECTIVE To investigate gene mutations of epidermal growth factor receptor (EGFR) and K-RAS (Kirsten rat sarcoma viral oncogene) in Chinese patients with non-small cell lung cancer (NSCLC), and study the correlation with its protein expression and its clinical significance on gefitinib. METHODS Detect the EGFR and K-RAS gene mutations status by gene sequencing and use the method of Immunohistochemistry to detect EGFR and K-RAS protein expression. RESULTS The frequency of EGFR mutations was 33%, mainly located in exon 19 and exon 21. The frequency of K-RAS mutations was 5.5%, mainly located in codon 12. There was no case which both had EGFR and K-RAS mutations, suggesting a mutually exclusive relationship between the two. EGFR mutations are more common in adenocarcinomas (particularly those with bronchioloalveolar features), nonsmokers and females. 16% were detected EGFR positive expression and had no correlation with EGFR mutation (P > 0.05), but had significant correlation with mutation in exon 19 (P < 0.05). The frequency of K-RAS positive expression was 52.5% and had no correlation with K-RAS mutation (P > 0.05). Twelve (8 cases were protein-negative) out of 15 gefitinib-treated NSCLC patients with disease control carry EGFR mutations. CONCLUSION EGFR protein expression has some correlation with exon 19 mutations. Combined detection of EGFR and K-RAS gene mutations can help clinicians to choose patients who may benefit from EGFR tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) and to predict the response and prognosis of gefitinib.     

EGFR mutations, gene amplification, and protein expression and KRAS mutations in primary and metastatic tumors of nonsmall cell lung cancers and their clinical implications: a meta-analysis

A meta-analysis was performed to determine EGFR mutations, gene amplification, and protein expression and KRAS mutations in primary and metastatic nonsmall cell lung cancer (NSCLC). We found that KRAS gene mutation frequencies were higher in primary than in metastatic tumors. There was no significant difference in EGFR mutation frequency between the primary and metastatic tumors. These results suggest that KRAS mutations in primary NSCLC foci may be a more accurate biomarker than in metastases to reflect KRAS mutation status. Combined detection of EGFR and KRAS mutations in primary NSCLC foci appears to be an optimal approach for first-line EGFR-TKI therapy.     

EGFR第一内含子（CA）n双核苷酸重复多态性和基因突变与肺癌分子靶向治疗的反应

目的：对肺癌组织EGFR基因突变和第一内含子（CA）n双核苷酸重复多态性与分子靶向药物治疗反应相关性进行初步研究。方法：用基因测序的方法检测了观察组共116例肺癌体细胞标本;对照组20例肺癌患者血液标本。对全部标本的EGFR基因18、19、21外显子,以及其中48例第一内含子（CA）n重复序列进行基因测序分析并随访了45例肺癌患者分子靶向药物（易瑞沙）治疗情况。结果：观察组116例标本中共发现20例（17．25％）EGFR基因突变,其中17例为外显子突变,3例为内含子杂合突变。对照组20例肺癌患者血液标本均未发现突变。肺腺癌的突变率为21．62％,比鳞癌（8．33％）、其它类型癌（11．11％）略高,但无统计学差异。EGFR基因突变在女性患者中（7／36,19．45％）所占比例比男性患者（13／80,16．25％）略高,但无统计学差异。观察组中,随访外显子突变患者眼用易瑞沙的有效率（包5％）显著高于未突变者（0％）（P〈0．01）,疾病控制率（100％）高于未突变组（44．4％）（P〈0．05）.外显子突变患者服用易瑞沙治疗的疾病控制率（100％）高于未服用者（40％）（P〈0．05）。内含子杂合的3例中有2例服用易瑞沙,有效率为0％,疾病控制率50％。观察组与对照组有23例（CA）n短重复（CA≤16）（47．9％）,25例（CA）n长重复（CA〉16）（52．1％）。EGFR第一内含子（CA）n重复片段长短与基因突变无明显相关,OR（OddsRatio）〈2。观察组中,16例突变患者与18例未突变患者（CA）n重复片段的长短与分子靶向药物治疗有效率、疾病控制率均无统计学差异（P〉0．05）。结论：EGFR基因突变组患者分子靶向药物治疗有效率（62．5％vs0）、疾病控制率（100％VS44．4％）要明显优于无突变组。在肺癌中,EGFR基因体细胞突变是决定表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性的最重要的因素。（CA）n重复片段长短与EGFR基因突变无明显相关。分析突变因素关联的（CA）n短重复患者与（CA）n长重复患者的分子靶向药物治疗有效率、疾病控制率无统计学差异。由于部分未突变肺癌患者使用易瑞沙出现一定的疾病控制率,有关分子靶向药物疗效与（CA）n重复的关系有待进一步单因素研究。     

盐酸埃克替尼治疗EGFR突变晚期肺腺癌的预后因素分析

目的 探讨晚期肺腺癌表皮生长因子受体（EGFR）突变患者应用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）盐酸埃克替尼片治疗与预后的关系。方法 入组河北省胸科医院基因检测提示EGFR19、21基因突变且接受盐酸埃克替尼片治疗的晚期肺腺癌患者,分析其临床特征、EGFR基因突变亚型及不同位点与预后的关系。结果 全组共纳入101例晚期肺腺癌患者,EGFR基因19外显子缺失突变（EGFR Del19）58例,21外显子点突变（EGFR L858R）43例。全组患者客观缓解率达63.4%,中位无疾病进展时间（mPFS）和中位生存时间（mOS）分别为13个月和27个月。EGFR Del19对比EGFRL858R及EGFR19突变746~750位点对比其他突变位点的患者mPFS和mOS均增高。多因素分析显示,转移部位数和有无胸膜转移为OS的独立影响因素（P=0.027, P=0.041）,转移部位数≤3和无胸膜转移组患者的mOS分别为29个月和27个月。结论 盐酸埃克替尼片治疗晚期肺腺癌患者EGFR不同突变亚型和位点总生存差异不显著,转移部位数≤3和无胸膜转移的患者总生存期更长。     

NSCLC EGFR突变与吸烟的交互作用及其与miR-221表达的相关性

目的:分析NSCLC EGFR突变与吸烟等因素的交互作用,及其与miR-221表达的相关性,为肺癌分子机制研究提供线索和依据。方法:采用高分辨熔解曲线法（high resolution melting,HRM）进行EGFR突变检测,以EGFR突变阳性为病例组,野生型为对照组,logistic回归分析EGFR突变与吸烟等因素在肺癌中的交互作用,Spearman分析EGFR突变与miR-221表达的相关性。结果:吸烟者相对于不吸烟者,EGFR突变差异具有统计学意义（P=0.034）,不吸烟者EGFR突变率较高。性别、年龄、饮酒、组织学类型、肿瘤直径、TNM分期、分化程度、肿瘤家族史以及心脑血管疾病史与EGFR突变无统计学关系（P＞0.05）;NSCLC EGFR突变与吸烟、饮酒、肿瘤家族史以及心脑血管疾病史对肺癌的发生不存在相乘交互作用;miR-221表达在NSCLC组织明显高于非癌肺组织,差异有统计学意义（P=0.017）;EGFR突变与miR-221表达无相关性（r=-0.034,P=0.858）。结论:NSCLC EGFR突变与吸烟、饮酒、肿瘤家族史及心脑血管疾病史均不存在相乘交互作用,miR-221表达在NSCLC组织中高于非癌病人肺组织,与EGFR突变无相关性。