慢病毒介导的Canstatin基因转移对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的:构建携带Canstatin基因的慢病毒载体,体外转染脐静脉血管内皮细胞ECV304,观察其体外培养的脐静脉血管内皮细胞增殖及凋亡的影响。方法:应用基因重组技术构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-Canstatin,通过酶切、测序验证Canstatin基因后,将pGC-FU-Canstatin质粒和包装质粒pHelper 1.0,pHelper 2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带Canstatin基因重组慢病毒GC-FU-Cansta-tin,并测定病毒滴度。将重组慢病毒转染靶细胞人脐静脉血管内皮细胞ECV304,通过Western blotting检测靶细胞中Canstatin的表达。采用MTT法观察Canstatin基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响。TUNEL染色、流式细胞仪AnnexinV/碘化丙啶双染法,检测慢病毒介导的Canstatin基因诱导脐静脉血管内皮细胞的凋亡。结果:pGC-FU-Canstatin中携有正确的Canstatin基因序列;pGC-FU-Cansta-tin和包装质粒pHelper 1.0,pHelper 2.0共转染包装细胞293T产生重组病毒GC-FU-Canstatin;检测病毒滴度为1×109TU/ml;Western blotting检测到Canstatin蛋白在靶细胞中持续表达。Canstatin(感染复数分别为25和50)作用72h后,ECV304细胞增殖数目显著少于PBS组和空载体组(P<0.01);TUNEL染色,以MOI为25的重组慢病毒GC-FU-Canstatin作用于人脐静脉血管内皮细胞ECV304细胞72h后,出现典型的凋亡形态学改变。以感染复数为25的GC-FU-Canstatin处理ECV304细胞72h后,细胞凋亡率为(21.63±1.32)%,PBS组为(2.87±0.76)%,空载体组为(2.66±0.69)%,转基因组与空载体组、PBS组相比差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论:慢病毒介导的Canstatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有促诱导作用。     

非病毒介导的基因转移

基因转移是研究基因功能和实现基因治疗的一个关键.基因转移必须安全、有效、稳定、特异、可控、经济、简便易行并可携带不同长度的DNA.目前,基因转移主要有病毒和非病毒介导的两种方式.本文结合心血管系统的基因治疗,介绍几种我们实验室创建的一些非病毒介导的基因转移方法.1. 基因缝线 基因缝线是将外源性DNA直接涂粘或通过Poylysine耦联到手术缝合线上,进行血管、肌肉和组织的缝合而实现基因转移的方式.应用pcDNA3/lacZ基因缝线,缝合血管、骨骼肌、心肌等器官可以实现高效基因转移,其表达量可较直接注射法高5～10倍,并可持续3个月以上.并且肌肉再生、组织缺血损伤可以促进外源性基因的表达.应用这种方法转移MTHFR基因,可以产生DNA抗体;应用基因缝线,携带尿激酶原的基因,给微小动脉进行血管缝合,可以防止吻合口的血栓形成和再狭窄.携带VEGF基因,给血管梗塞的大鼠、狗和猴进行血管外基因转移,可以促进血管内皮的生长、新生血管的形成和侧枝循环的建立,治疗梗塞性血管病.携带心钠素基因,可以使血中心钠素水平升高一倍以上,产生明显利钠、利尿和降低血压的作用,防治和延缓高血压的发生.应用这种方法,进行肌肉介导的基因转移,其外源基因仅在局部表达,而不累及远隔的组织和器官.     

慢病毒介导shRNA特异性沉默livin基因促进SPC-A1细胞凋亡

目的：建立慢病毒介导的livin基因沉默系统,探讨其对肺癌细胞凋亡的影响。方法：Livin shRNA慢病毒感染肺腺癌细胞株SPCA1沉默livin基因表达。应用PI染色经荧光镜下观察SPCA1细胞凋亡形态,流式细胞术检测SPCA1细胞凋亡率及亚二倍体峰形成,Realtime PCR及Western blotting方法检测livin和caspase 3表达的改变。结果：livin基因在肺腺癌细胞株SPCA1中持续高表达。经慢病毒介导shRNA使livin基因表达沉默后,镜下可见肺腺癌细胞出现典型凋亡形态特征,流式细胞术检测出现亚二倍体峰,细胞凋亡率较空白对照及阴性病毒对照细胞明显增加（8.21％ vs 0.08％, 0.13％;P<0.05）,RTPCR及Western blotting 检测结果显示,caspase 3 mRNA表达无改变,但cleavedcaspase 3蛋白表达上调。结论：慢病毒载体介导的shRNA能抑制肺腺癌细胞株SPCA1中livin基因的表达,从而促进SPCA1细胞凋亡。     

慢病毒介导的 HO-1基因沉默对人白血病K562细胞增殖与凋亡的影响

目的:研究沉默血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)基因对人慢性粒细胞性白血病(chronic myelogenous leu-kemia,CML)K562细胞增殖与凋亡的影响。方法:构建靶向HO-1基因的重组慢病毒Lv-siRNA-HO-1,将其感染K562细胞,荧光显微镜检测其最适感染复数(multipliciy of infection,MOI)。Western blotting检测Lv-siRNA-HO-1感染组、空载体Lv-Ctrl感染组及未感染组K562细胞中HO-1蛋白的表达,CCK-8法、流式细胞术分别检测各感染组K562细胞的增殖与凋亡。结果:成功构建靶向HO-1基因的干扰表达载体PSIH1-HO-1-siRNA,包装后形成重组慢病毒Lv-siRNA-HO-1,其有效感染K562细胞MOI值为6。与未感染组相比,Lv-siRNA-HO-1感染组K562细胞中HO-1蛋白的表达显著降低[(0.16±0.02)vs(0.70±0.02),P<0.01],K562细胞增殖活性也明显下降[(1.36±0.12)vs(2.02±0.17),P<0.01)],而K562细胞凋亡率则显著增加[(62.77±4.39)%vs(14.19±1.6)%,P<0.01]。结论:慢病毒介导的HO-1基因沉默能抑制人白血病K562细胞增殖和诱导其凋亡。     

腺病毒介导的FasL基因转移及对肺癌细胞生长和凋亡的影响

目的：探讨FasL基因对人肺癌的作用以及FasL基因治疗肺癌的可能性。方法：通过腺病毒载体介导FasL基因转移到低水平表达FasL的人肺腺癌细胞系A549,对FasL基因的表达、细胞生长的抑制和肿瘤生长模型的治疗效果进行分析。结果：外源性FasL基因在靶细胞高水平的表达显著抑制了A549的生长和集落形成，流式细胞仪检测显示细胞G1期阻滞并发生了凋亡。瘤内注射Ad-FasL对裸鼠体内移植瘤有一定的抑瘤作用。结论：FasL基因参与了肿瘤细胞凋亡的诱导，能抑制肺腺癌细胞的生长，因此本基础在肿瘤的基础治疗上有着广泛的应用前景。     

腺病毒介导的FasL基因转移及对胃癌细胞生长和凋亡的影响

目的：探讨FasL基因对人胃癌的作用以及FasL基因治疗胃癌的可能性。方法：通过腺病毒载体介导FasL基因转移到低水平表达FasL的人胃癌细胞系SGC－7901,对FasL基因的表达,细胞生长的抑制与机制和对肿瘤生长模型的治疗效果进行分析。结果：外源性FasL基因在靶细胞高水平的表达,显著抑制了SGC－7901的生长和集落形成,流式细胞仪检测显示细胞G1期阻滞并发生了凋亡。瘤内注射Ad-FasL对裸鼠体内移植瘤有一定的抑瘤作用。结论：FasL基因参与了肿瘤细胞凋亡的诱导,能抑制胃癌细胞的生长,因此该基因在肿瘤的基因治疗上有着广泛的应用前景。     

慢病毒载体及其对低分裂潜能细胞的基因转移

基因转移方法为基因治疗的关键.目前,在动物及人体试验中应用最广的病毒载体是来源于致瘤型反转录病毒为代表的简单的反转录病毒载体(RV),但该类载体不能有效地转染低分裂潜能细胞如终末分化的神经细胞、造血干细胞(HSC)、视网膜细胞、肝脏细胞、胰岛细胞等.     

靶向HOXA9基因shRNA慢病毒载体对U937细胞增殖与凋亡影响观察

目的：观察慢病毒介导的短发夹RNA（shorthairpinRNA,shRNA）沉默同源盒A9（homeoboxA9,HOXA9）基因对U937细胞增殖和凋亡的影响。方法：前期从4条针对HOXA9基因的RNA干扰（RNAinterference,RNAi）慢病毒载体中筛选出了l条敲减效率最高的包装成慢病毒H0xA9／GVll8RNAi—LV#2。实验分为对照组（control,CON）、阴性对照组（negativecontrol,NC）及敲减组（knockdown,KD）。HOXA9／GVll8RNAi-LV#2感染U937细胞5d后,FCM检测U937细胞感染效率,应用实时荧光定量PCR法检测HOXA9mRNA的沉默效率,蛋白质印迹法检测HOXA9蛋白的表达;MTT法和绘制细胞生长曲线检测细胞增殖抑制情况;FCM检测细胞凋亡及细胞周期;RT-PCR法检测细胞c-mycmRNA及p27mRNA表达情况。结果：慢病毒感染效率〉90％,KD组细胞中HOXA9mRNA的沉默效率〉55％,HOXA9蛋白的表达量明显减少,其中KD组相对表达水平达（0．223±0．024）,显著低于NC组（0．884±0．009）及CON组（0．891±0．013）,差异有统计学意义,F=1566．202,P〈0．001。MTT结果显示,KD组细胞的IR值为（40．469±1．756）％,明显高于NC组及CON组（F=1311．928,P〈0．001）,细胞生长曲线表明该组细胞生长速度减慢;FCM结果显示,KD组、NC组及CON组凋亡率分别为（26．762±2．245）％、（6．819±0．547）％和（6．113±0．349）％,KD组与NC组（q=25．501,P〈0．001）及CON组（q=26．418,P〈0．001）比较差异均有统计学意义,提示该载体显著增加细胞凋亡率;其细胞周期G0／G1期细胞比例较CON组及NC组明显增加,提示该载体使细胞周期阻滞于G0／G1期,F=27．769,P=0．001;RT-PCR结果表明,U937细胞KD组较CON组及NC组c-mycmRNA表达水平下降,p27mR—NA表达水平上升。结论：靶向HOXA9基因shRNA慢病毒载体能稳定沉默HOXA9表达,可显著抑制U937细胞增殖并促进其凋亡,同时可下调c-myc表达,上调p27表达,使细胞周期阻滞于G0／G1期。     

前列腺特异性启动子在慢病毒介导基因治疗中的研究进展

前列腺癌多发生于老年男性,其发病率和死亡率正在逐年上升。对于早期前列腺癌,采用阻断雄激素的去势治疗可以有效抑制肿瘤生长,但在治疗2～3年后大部分进展为去势抵抗性前列腺癌,这是导致患者死亡的主要原因。目前,对晚期尤其是去势抵抗性前列腺癌尚缺乏有效的治疗策略,随着生物技术的兴起与发展,针对恶性肿瘤的生物靶向治疗研究日趋深入和成熟,其中慢病毒介导的基因治疗成为研究的热点。运用特异性启动子调控相关基因的表达,可以进一步提高抗肿瘤的靶向性和安全性。本文就目前在基础研究中,前列腺特异性启动子在慢病毒介导下基因靶向治疗前列腺癌的研究现状进行综述。     

慢病毒介导的siRNA沉默Foxp1对肝癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的 探讨Foxp1对肝癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法 体外合成干扰Foxp1功能的小核酸片段（siRNA Foxp1）,通过重组技术将其插入到慢病毒三质粒系统的转移质粒中,利用包装细胞（293T）将三质粒系统组装为完整的反转录慢病毒载体（lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA）,感染高表达Foxp1的肝癌细胞株。同时构建不含有Foxp1-siRNA序列的直接三质粒系统包装的空病毒载体对照组。荧光显微镜观察慢病毒载体介导siRNA感染细胞的效果。Western blot和Real-time QPCR（RTQPCR）分别检测肝癌细胞中Foxp1蛋白表达和mRNA水平。CCK-8实验、流式细胞仪、细胞划痕愈合实验和侵袭小室实验分别检测细胞增殖、凋亡和迁移的改变。结果 与对照组细胞比较,肝癌细胞感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后,细胞中Foxp1蛋白和mRNA表达显著下降,增殖活性受到显著抑制,细胞凋亡明显增加,在二维空间和三维空间的迁移细胞显著减少（均P<0.01）。结论 Foxp1作为一种多功能转录因子,促进肝癌细胞的增殖和迁移,抑制其凋亡。     

慢病毒转染造血干细胞介导的肿瘤基因治疗的研究进展

肿瘤基因治疗是继手术、放化疗等传统治疗方法之后出现的一种全新的肿瘤治疗方法,并在科研和临床方面取得可喜的进展。如何将肿瘤治疗基因安全高效的转移到人体内,使治疗基因在人体内长期、稳定、高效的表达是当前基因治疗实践中所遇到的重大困难。造血干细胞(hematopoieticstemcells,HSCs)因具有自我更新和定向分化能力,治疗基因转染到造血干细胞内可长期、持续、有效的杀伤肿瘤达到治疗目的。这使的造血干细胞成为基因治疗研究中最令人兴奋的靶细胞。慢病毒载体(lentivirusvector,LV)能感染大部分处于静止期的造血干细胞,因此成为一种有效的感染HSCs和进行基因治疗的工具。本文就慢病毒携带肿瘤治疗基因转染HSCs治疗肿瘤方面做一综述。     

NHE1反义基因磁性纳米微粒对SGC-7901胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨NHE1反义基因磁性纳米微粒对SGC-7901胃癌细胞株增殖和凋亡的影响,探索胃癌基因治疗的新方法。方法:构建NHE1反义基因真核表达载体和NHE1反义基因磁性纳米微粒,将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中,比较观察细胞转染前后生长曲线、细胞周期和细胞凋亡率的变化。结果:氧化铁磁性纳米颗粒成功地将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中。NHE1反义基因能使SGC-7901胃癌细胞生长速度减慢、体外生长增殖能力降低,转染NHE1反义重组质粒的SGC-7901胃癌细胞增殖指数为34.73%,低于SGC-7901细胞的38.95%;NHE1反义基因使SGC-7901胃癌细胞凋亡率增加,转染NHE1反义重组质粒的SGC-7901胃癌细胞凋亡率为11.75%,显著高于SGC-7901胃癌细胞凋亡率(3.85%,P<0.01)。结论:NHE1反义基因磁性纳米微粒能抑制SGC-7901胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,具有良好的治疗效果,有一定的临床应用前景。     

NHE1反义基因磁性纳米微粒对SGC-7901胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨NHE1反义基因磁性纳米微粒对SGC-7901胃癌细胞株增殖和凋亡的影响，探索胃癌基因治疗的新方法。方法：构建NHE1反义基因真核表达载体和NHE1反义基因磁性纳米微粒，将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中，比较观察细胞转染前后生长曲线、细胞周期和细胞凋亡率的变化。结果：氧化铁磁性纳米颗粒成功地将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中。NHE1反义基因能使SGC-7901胃癌细胞生长速度减慢、体外生长增殖能力降低，转染NHE1反义重组质粒的SGC-7901胃癌细胞增殖指数为34．73％，低于SGC-7901细胞的38．95％；NHE1反义基因使SGC-7901胃癌细胞凋亡率增加，转染NHE1反义重组质粒的SGC-7901胃癌细胞凋亡率为11．75％，显著高于SGC-7901胃癌细胞凋亡率（3．85％，P〈0．01）。结论：NHEl反义基因磁性纳米微粒能抑制SGC-7901胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。具有良好的治疗效果，有一定的临床应用前景。     

双自杀基因CD和TK对K562细胞体内外杀伤作用的实验研究

目的:探讨双自杀基因CD和TK对K562细胞的体内外抑制作用及前体药物对肿瘤的杀伤作用。方法:将目的基因转染入K562细胞,MTT法观察细胞在体内外的增殖状况及5-FC/GCV对转染细胞的杀伤作用,电子显微镜观察其超微结构变化。将K562/CDgly TK和K562细胞接种于裸鼠皮下,观察各种肿瘤细胞在体内的成瘤情况及对前体药物治疗的敏感性。结果:单独使用GCV或5-FC对K562及K562/CDgly TK细胞产生明显的杀伤作用,联合应用该2种药物对肿瘤细胞的杀伤作用更强。将K562细胞和K562/CDgly TK细胞接种于小鼠皮下后小鼠成瘤率为100%,GCV或5-FC可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成,联合应用GCV和5-FC治疗K562/CDglyTK细胞在小鼠体内形成的肿瘤,较单独应用GCV和5-FC及对照组小鼠形成的肿瘤体积明显缩小,生存期也明显延长。结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有明显的抑制作用,可增加前体药物GCV和5-FC对瘤细胞的杀伤率。     

左炔诺孕酮对人子宫肌瘤细胞体外增殖与凋亡的影响

目的:建立稳定、成功率高的人子宫肌瘤细胞原代培养方法,探讨不同浓度左炔诺孕酮(levonorgestrel,LNG)对体外培养人子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法:分别采用酶解法和贴块法原代培养人子宫肌瘤细胞(uterine leiomyoma cell,UtLMC),以α-Actin单抗进行免疫组织化学染色鉴定原代细胞;细胞传代后,加入不同浓度左炔诺孕酮,H-E染色和透射电镜观察细胞的形态学改变,MTT法检测LNG对细胞增殖的调节作用,流式细胞术测定细胞凋亡率,RT-PCR技术分析LNG对人子宫肌瘤细胞凋亡相关基因Bcl-2、IGF-1及Survivin mRNA表达的影响。结果:酶解法和贴块法均成功获得UtLMC,经免疫组化鉴定,纯度达95%以上,并能稳定传12代;5μg/ml左炔诺孕酮对子宫肌瘤细胞无明显作用,当质量浓度达到10μg/ml时可显著抑制细胞增殖,并呈时间、剂量依赖;随着药物浓度的增加,细胞凋亡率亦逐渐升高,与对照组相比有显著性差异(P<0.05);10μg/ml和20μg/ml左炔诺孕酮作用UtLMC后,Bcl-2、IGF-1及Survivin mRNA表达下降。结论:酶解法和贴块法均能获得功能良好的人子宫肌瘤细胞,一定浓度的左炔诺孕酮可抑制其增殖并诱导凋亡,机制与下调Bcl-2、IGF-1及Survivin基因表达有关。     

凋亡抑制基因c-FLIPs对人肺腺癌细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨过表达凋亡抑制基因c-FLIPs重组腺病毒对人肺腺癌细胞增殖和凋亡的作用。方法:构建过表达凋亡抑制c-FLIPs的重组腺病毒Ad5 c-FLIPs,感染人肺腺癌细胞Calu-3。Real-time PCR检测感染前后c-FLIPs、Caspase-8,Caspase-10和Bcl-2的表达。MTT法检测细胞增殖。流式细胞仪检测感染Ad5 c-FLIPs后人肺腺癌细胞的凋亡情况。结果:成功构建过表达c-FLIPs重组腺病毒Ad5 c-FLIPs,real-time PCR检测凋亡抑制基因c-FLIPs在Calu-3细胞株高表达,过表达c-FLIPs基因,凋亡相关基因Caspase-8、Caspase-10和Bcl-2的表达明显降低。MTT法检测感染前后细胞增殖情况发现,过表达c-FLIPs基因可诱导细胞增殖,流式细胞仪分析经PI染色后的Calu-3细胞株,对照组和腺病毒感染组细胞的凋亡率分别为（55.17±9.68）%和（10.97±1.66）%,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:凋亡抑制基因c-FLIPs可明显诱导人肺腺癌细胞增殖并抑制凋亡。     

抑制Survivin基因对人卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨应用RNAi技术沉默Survivin基因对人卵巢癌SKOV3细胞的影响。方法:构建Survivin基因shRNA真核表达载体,转染人卵巢癌SKOV3细胞。RT-PCR及Western blot检测Survivin基因的表达,MTT实验、流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡的变化。结果:siRNA实验组细胞Survivin蛋白及mRNA表达水平明显下降,细胞增殖能力显著降低,细胞凋亡率显著升高。结论:应用RNAi技术沉默Survivin基因可以降低卵巢癌SKOV3细胞Survivin基因的表达,进而抑制肿瘤细胞的生长、增殖并诱导细胞凋亡。因此,Survivin基因可能成为抗肿瘤治疗的潜在靶点。     

慢病毒介导的Notch1基因沉默抑制软骨肉瘤SW1353细胞的增殖和侵袭

目的:探讨慢病毒介导的Notch1基因沉默对软骨肉瘤SW1353细胞增殖和侵袭的抑制作用及其机制。方法:将SW1353细胞分为对照组（未感染）、空载体组（LV-NC-shRNA慢病毒感染）和沉默组（LV-Notch1-shRNA慢病毒感染），RT-PCR和Western blot检测慢病毒的感染效果，MTT法和克隆形成实验检测各组细胞的增殖活力，Transwell小室实验检测细胞的侵袭能力，Western blot检测PCNA、MMP-2和p-AKT蛋白的表达。结果:LV-Notch1-shRNA慢病毒感染使SW1353细胞中Notch1 mRNA和Notch1、PCNA、MMP-2、p-AKT蛋白的表达均明显降低（P<0.05），显著抑制了SW1353细胞的增殖和侵袭能力（P<0.05）。结论:Notch1基因沉默可抑制软骨肉瘤SW1353细胞增殖和侵袭，其作用机制可能与下调PCNA、MMP-2和p-AKT蛋白表达有关。     

大黄酸通过抑制STAT3基因的表达调控骨肉瘤细胞的增殖和凋亡

目的:探讨大黄酸对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响及潜在的作用机制。方法:以人骨肉瘤MG-63细胞为研究对象,利用CCK-8实验检测大黄酸对MG-63细胞增殖的影响,并计算大黄酸作用48 h的半数抑制浓度（IC50）,采用该浓度进行后续的实验。转染STAT3 siRNA至MG-63细胞,qRT-PCR和Western blot检测分别在mRNA和蛋白水平上检测转染效果,采用CCK-8实验、克隆形成实验、流式细胞术验证大黄酸和STAT3 siRNA及其联合作用对MG-63细胞存活率、克隆形成、凋亡能力的影响,Western blot检测各组MG-63细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3的表达情况。结果:大黄酸能够呈浓度依赖性的抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖,干预48 h的IC50为46.05 μmol/L。大黄酸或STAT3 siRNA均能降低MG-63细胞中STAT3的表达,抑制MG-63细胞存活率,阻碍细胞克隆形成能力,促进细胞凋亡,上调细胞中Bax和Cleaved Caspase-3的表达,下调Bcl-2的表达;且二者联合效果更显著。结论:大黄酸通过抑制STAT3基因表达抑制骨肉瘤细胞增殖并促进细胞凋亡。