抗肿瘤药物敏感实验试剂盒的建立及其稳定性的观察

目的:为了对MTT法抗肿瘤药物敏感试验方法进行规范,制备成试剂盒,并对试剂盒的稳定性进行了观察。方法:试剂盒组成:(1)预加抗肿瘤药物的细胞培养板,将各种抗肿瘤药物稀释到工作浓度后加入48孔细胞培养板中,冷冻干燥,真空包装。(2)淋巴细胞分离液。(3)含10%牛血清的DMEM培养基。(4)5%的MTT溶液。(5)GKN溶液。以新鲜加抗肿瘤药物的细胞培养板为对照,测定试剂盒的稳定性。结果:由冷冻干燥、真空包装的预加药的细胞培养板组成的试剂盒保存6个月和12个月后,与对照组比较,结果没有显著性差异(P>0.05)。结论:该试剂盒操作简便,稳定性好,利于临床推广使用。     

ＭＴＴ法抗肿瘤药敏试验影响因素的探讨

目的：对于采用ＭＴＴ法进行抗肿瘤药物敏感试验过程中的多种影响因素进行分析,观察抗肿瘤药物包被板的稳定性。方法：分离人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）,用ＭＴＴ法测定抗肿瘤药物敏感性,观察红细胞、血小板、３种ＤＭＳＯ及不同浓度ＭＴＴ对实验结果的影响;监测肿瘤药物包被板的稳定性。结果：一定浓度范围的红细胞和血小板均可影响实验结果;进口和国产分析纯的ＤＭＳＯ与ＭＴＴ的呈色反应是一致的,吸光度（Ａ值）与ＭＴＴ呈浓度依赖性;冷冻干燥的抗肿瘤药物包被板的稳定性优于未经冷冻干燥的药物包被板。结论：明确实验过程中多种影响因素,有助于规范ＭＴＴ法体外抗肿瘤药敏试验。     

MTT法体外检测脑胶质瘤对化疗药物的敏感性及预见性化疗的疗效分析

背景与目的：个体化化疗是脑胶质瘤重要的辅助治疗方法之一，本研究应用四氮唑盐比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT检测脑胶质瘤细胞体外对化疗药物的敏感性，为胶质瘤的个体化化疗提供参考，并根据药敏结果采用替尼泊苷（VM-26）与尼莫司汀（ACNU）分别联合顺铂（CDDP）进行胶质瘤的化疗，评价其疗效。方法：39例胶质瘤进行原代细胞培养，采用MTT法检测胶质瘤对常用八种化疗药物的敏感性，并根据试验结果将患者分为两组进行化疗（VM26-CDDP组和ACNU．CDDP组）．按WHO实体瘤疗效评价标准评价疗效。结果：39例患者中37例获得检测结果．体外培养成功率达94．9％。37例胶质瘤细胞体外对八种化疗药物的敏感性从高到低依次为：VM-26〉ACNU〉Taxol〉TMZ〉CDDP〉BCNU〉VCR〉Fotemustine。胶质瘤的病理级别及初发、复发对药物敏感性无显著性影响。35例患者接受化疗，共进行119个周期的化疗，ACNU组58个周期，VM．26组61个周期。其中无完全缓解（completeresponse,CR）病例，VM-26组部分缓解（partialresponse，PR）1例（5．6％），稳定（stabledisease，SD）14例（77．8％），进展（progressivedisease，PD）3例（16．6％），客观有效率（CR＋PR）为5．6％，疾病控制率（CR＋PR＋SD）为83．4％；ACNU组部分缓解1例（5．9％1，稳定（SD）14例（82.3％），进展2例（11．1％），客观有效率为5．9％，疾病控制率为88．2％。VM-26组患者中位无进展生存期（PFS）Ⅱ级为10．60个月（95％CI：7．21—15．46），Ⅲ、Ⅳ级为3．2个月（95％CI：2．3—5．20），中位总生存（0S）Ⅱ级为13-33个月f95％CI：10．21—16．46），Ⅱ、Ⅳ级为7．29个月（95％Ch4．92—9．651；ACNU组中位无进展生存期（PFS）Ⅱ级为9．70个月（95％Ch7．23—14．77），Ⅲ、Ⅳ级为3．5个月f95％CI：2．24—5．06），中位总生存（os）Ⅱ级为14．09个月（95％C1：10．88—16．12），Ⅲ、Ⅳ级为6．20个月f95％C1：5．94—8．49）。结论：MTT检测可以作为胶质瘤体外药实试验的一种方法，MTT体外药敏实验对排除无效药物、筛选敏感药物。提高胶质瘤的化疗效果．具有一定的参考价值。根据药敏结果选择VM-26和ACNU联合CDDP化疗可取得较好的总反应率和疾病控制率。     

MTT法检测平阳霉素对肿瘤细胞的药物活性研究

本文选用两种细胞株：人肝癌BEL7402和肺腺癌L-342细胞，利用MTT法检测平阳霉素对两株细胞药物敏感性的探讨。将每毫升含10^5个细胞的培养液胺（1/2）^n(n=0～7)梯度稀释，种于96孔板（100μl/孔），5%CO2，37℃，培养34h,加MTT20μl（母液2mg/ml);再37℃培养4h,加DMSO100μl溶解，测570nmOD值，     

肺癌诊断试剂盒的研制

目的 利用特异性与灵敏性较高的神经元特异烯醇化酶（NSE）、细胞角蛋白21-1片段（CYFRA21-1）肺癌相关标志物,研制肺癌双显色的体外联合诊断酶联免疫反应（ELISA）试剂盒。方法 将NSE、CYFRA21-1两种抗体按一定比例组合包被到酶标板的板底制成试剂盒。分别以NSE、CYFRA21-1抗原为研究对象,对包被液、包被时间、包被温度因素进行考察,以试剂盒的稳定性、灵敏度、准确性为指标进行结果 分析。结果 NSE、CYFRA21-1肺癌双显色ELISA诊断试剂盒4 ℃放置时有效期为6个月。试剂盒灵敏度为83.8%（129/154）,特异度为53.8%（57/106）,准确性为71.5%（186/260）,受试者工作特征曲线（ROC）曲线下面积Az为0.90,各项指标均较单独的NSE、CYFRA21-1明显提高。结论 成功制备双显色ELISA肺癌诊断试剂盒,该试剂盒可提高肺癌检查的准确性、灵敏度,降低假阳性率,具有开发为新型肺癌诊断试剂盒的条件。     

人非小细胞肺癌体外抗肿瘤药物敏感性的实验研究

目的 通过检测非小细胞肺癌(non-small-cell-lung-cancer,NSCLC)患者的术后标本探讨NSCLC对临床常用的5种抗肿瘤药物的敏感性,为指导临床个体化治疗提供依据。方法 自2007年11月—2008年11月,对60例NSCLC术后新鲜标本采用肿瘤细胞原代培养技术,同时应用药敏(MTT法)检测其对临床常用于治疗NSCLC的5种抗肿瘤药物(诺维本、健择、泰索帝、泰素、顺铂)的抑制率和敏感性。结果 60例NSCLC术后新鲜标本MTT法的临床总体评价率为96.67%(58/60)。不同抗肿瘤药物个体间的药物敏感性存在着明显差异;结论 (1)不同个体的肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感程度存在着异质性,临床应根据药敏结果,选择相对敏感的抗肿瘤药物,制定个体化治疗方案,以提高治疗疗效;(2)MTT法的临床总体评价率令人满意,可在实际工作中应用推广。     

重组人p53腺病毒联合化疗对复发性卵巢癌临床疗效的评价

目的：探讨重组人p53腺病毒注射液（rAd-p53）联合静脉化疗对复发性上皮性卵巢癌（recurrent epithelial ovarian carcinoma,REOC）的临床疗效。方法：选取甘肃省妇幼保健院妇产科2007年7月至2011年12月住院的49例REOC患者,其中25例在静脉化疗基础上加用rAd-p53治疗（联合组）,24例单纯进行静脉化疗（化疗组）,比较两组患者近期、远期疗效及药物的不良反应。结果：3个疗程治疗后,联合组CA125下降正常率高于化疗组（68.0% vs 33.3%,P=0.02）;疾病控制率两组分别为92.0%与87.5%,差异无统计学意义（χ2=1.03,P=0.59）。随访5~41个月（中位时间26个月）,两组患者总生存期无明显差异（18.8个月vs 13.9个月,P=0.051）。患者使用rAd-p53未发现严重的不良反应。结论：rAd-p53联合化疗对于复发性REOC患者似乎有一定受益,无明显的不良反应,结果尚需要进一步在临床应用中得以验证。     

106. 胃癌原代培养体外抗肿瘤药物敏感实验

目的：肿瘤药敏试验在恶性肿瘤化疗中起着越来越重要的作用。为了提高化疗效果,实现“个体化”化疗方案,本文采用MTT分析比色法,比较观察了30例胃癌手术标本原代培养细胞对临床常用的7种化疗药物的敏感性。旨为临床胃癌手术患者选择有效安全的化疗药物提供实验依据。30例肿瘤标本均取自手术切除的新鲜组织,制成含活瘤细胞数为1×105／ml悬液,接种于96孔培养板内。实验组与对照组再分别加入不同浓度的化疗药物或1640培养液,每组设3个复孔。置37℃、5%CO2湿性培养箱中培养48 h后,每孔加MTT（5 mg/ml）10 μl,继续培养6 h,加终止液SDS 100 μl／孔,过夜后在自动酶标仪吸收波长570 nm条件测定各孔的光密度OD值。根据下列公式计算抑制率：抑制率（％）＝（1-实验孔平均OD值／对照孔平均OD值）×100％。抑制率≥50％为高度敏感(++);≥30％为敏感（＋）;≤29％为不敏感(-);30例标本中,有2例因细胞生长不良未能进行药敏评价。其余28例标本中,有4例(14.29%)标本对7种药物均敏感,有3例（10．72%)对7种药物均不敏感;本实验结果表明：不同个体间药敏结果存在很大差异。敏感程度依次为：丝裂霉素78．55%（22例）,5-氟脲嘧啶75％(21例）、顺铂71．44％（20例）、足叶乙甙46.43%（13例）、阿霉素42．86％（12例）、阿糖胞苷36．71％（10例）、长春新碱25％（7例)。由于个体肿瘤细胞生物学特性的差异,使不同癌瘤对同一种药物敏感性不一样,同一种癌瘤对不同化疗药物的敏感也相差甚远。这与临床常见的不同病人采用同一药物、同一剂量治疗而效果悬殊很大是相符合的。因此通过MTT比色法检测可用来指导临床个体化针对性化疗,对进一步提高胃癌综合治疗效果,有较重要的临床价值。     

蒸馏水与其化疗药物溶液对胃癌MGC-803细胞作用1分钟的灭活效果比较

目的：观察常温蒸馏水、温热蒸馏水和常温蒸馏水加不同化疗药的溶液短时间（1分钟）作用于胃癌细胞MGC-803的结果，从中筛选出能杀灭癌细胞的最低冲洗浓度，为临床胃癌术野的蒸馏水化疗药物冲洗提供实验依据。方法：选取常见胃癌细胞MGC-803为实验对象，以蒸馏水（DW）、43℃温热蒸馏水（HDW）和常用化疗药阿霉素（ADM）、顺铂（DDP）、5-氟尿嘧啶（5-FU）与蒸馏水混合溶液作为干预方法，分别以不同浓度（DW＋ADM/DDP/5-FU：10/10/50μg/ml、20/20/100μg/ml、40/40/200μg/ml、80/80/400μg/ml、160/160/800μg/ml、320/320/1600μg/ml、640/640/3200μg/ml）的水溶液作用细胞1分钟并用培养液继续培养72小时后进行细胞形态学及MTT实验。结果：蒸馏水化疗药溶液相对于单纯蒸馏水和温热蒸馏水对胃癌细胞具有更强的杀伤作用，结果具有统计学意义（P＜0．01）；筛选出3种化疗药物的最低完全抑制浓度（抑制率＞90％），分别为：ADM 160μg/ml、DDP 320μg/ml、5-FU 1600μg/ml。结论：蒸馏水化疗药溶液相比于单纯蒸馏水及温热蒸馏水可明显增加对胃癌细胞的杀伤作用，筛选出的蒸馏水化疗药溶液最低浓度可对临床胃癌手术以及其他癌症手术术野冲洗液的选择提供一定的实验依据。     

结肠癌肝转移肝动脉介入治疗的局限性

目的 分析结肠癌肝转移行肝动脉介入治疗后的疗效,探讨介入治疗的局限性。方法 对75例结肠癌肝转移行肝动脉介入治疗后患者进行分析,分别就肿瘤结节单发或多发、合并其它脏器转移与否、肿瘤积压供多寡、单纯灌注或灌注加栓塞、单纯介入治疗或结合全身化疗等方面对患者的中位生存期进行比较。化疗药物选用表阿霉素（E-ADM）或顺铂（PDD）、丝裂霉素（MMC）、甲酰四氢叶酸钙（CF）、氟尿嘧啶（5-FU）联合方案,或加超液化碘油（LUF）栓塞。结果 近期疗效以CT作为评价手段,有效率（CR PR）为45.3%,中位生存期20.0个月。有效者（CR PR）中位生存期为27.5个月,1年生存率为100%;无效者（无变化 进展：NC PD）平均生存期为16.0个月,1年生存率为65.0%。全组1、2、3、4、5年生存率分别为87.0%、48.1%、27.4%、22.4%、16.8%。肝单发转移、未合并其它脏器转移、肿瘤多血供加栓塞治疗、结合全身化疗者中位生存期较长。结论 经肝动脉介入治疗结肠癌肝转移是目前较为有效的治疗方法之一,但须根据病情制订治疗方案并结合全身化疗进一步提高疗效。     

能量限制对肝癌细胞ＨeｐＧ２增殖和化疗药物顺铂作用的影响

目的　观察能量限制对肝癌细胞系ＨｅｐＧ２增殖的影响以及能量限制后化疗药物顺铂对ＨｅｐＧ２细胞增殖抑制和凋亡诱导作用的影响。方法　分别在高糖（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）和低糖（５ｍｍｏｌ／Ｌ）环境中培养肝癌细胞系ＨｅｐＧ２,应用葡萄糖检测试剂盒检测细胞内葡萄糖浓度的差异;应用ＭＴＴ和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力的差异;应用流式细胞仪检测高、低剂量化疗药顺铂对细胞周期和凋亡的影响。结果　与高糖环境培养的细胞相比,低糖环境培养的细胞其胞内葡萄糖浓度降低（P＜０.０５）、增殖能力减弱（Ｐ＜０.０５）;流式细胞仪分析结果显示,低剂量顺铂组低糖环境下ＨｅｐＧ２细胞周期阻滞在Ｓ期的百分比增高,高剂量顺铂组低糖环境下ＨｅｐＧ２细胞的凋亡率增加（P＜０.0５）。结论　能量限制可抑制肝癌细胞系ＨｅｐＧ２的增殖,并可增强化疗药物顺铂对ＨｅｐＧ２细胞的增殖抑制和凋亡诱导效应。     

MTT肿瘤药物敏感试验的方法学研究

目的：对MTT法肿瘤药物敏感试验的方法进行选择,旨在建立一种MTT肿瘤药敏试验的规范化操作流程。方法：MTT法测定K562细胞对抗癌药卡铂与紫杉醇的敏感性实验及其影响因素。结果：在每孔K562细胞数为5×10^3（浓度为5×10^4个/ml）、药物作用时间48h、MTT20μl作用6h、单波长570nm处测OD值时,药物对肿瘤细胞的抑制率较高,实验效果较好。结论：规范化的MTT肿瘤药敏试验可以为临床医师开展和实现化疗个体化提供较为可靠的实验依据。     

DNA甲基化转移酶抑制剂和组蛋白脱乙酰化酶抑制剂的体外抗肿瘤作用

目的：通过在体外分别对DNA甲基化转移酶（DNAmethyhransferase，DNMT）抑制剂5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza-C）和组蛋白脱乙酰化酶（histoneseacetylase，HDAC）抑制剂苯丁酸钠（sodium phenylbutyrate，SPB）单独及联合用药于人大肠癌细胞LoVo和人肝癌细胞Hep3B的抗肿瘤作用的观察，探讨DNMT抑制剂和HDAC抑制剂联合用药的可能性。方法：使用MTT法测定5-aza—C和SPB单独用药或联合用药的抗癌活性，用抑制浓度的分数之和（asum of fractional inhibitory concentration，SFIC）值及等效剂量分析方法（Isobologram）评价5-aza—C和SPB联合用药的作用性质。结果：5-aza—C和SPB联用时，LoVo细胞及Hep3B细胞得到的SFIC值均小于1．0，等效剂量分析图的形状呈现凹型，都表明了5-aza—C和SPB联用时两者之间具有明显的增效作用。结论：DNMT抑制剂5aza—C和HDAC抑制剂SPB联合应用于抗肿瘤临床是很有前景的。     

伊立替康、奥沙利铂及氟尿嘧啶对人大肠癌LoVo细胞株作用的实验研究

目的：研究国产盐酸伊立替康（CPT-11）、奥沙利铂（L-OHP）及氟尿嘧啶（5-FU）对人大肠癌细胞株LoVo的生长抑制作用。方法：采用MTT法观察上述药物单药应用、两药及三药同时或序贯联合应用对大肠癌LoVo细胞生长的影响，评价药物联合应用的效果。结果：单药应用、两药联合及三药联合应用均对大肠癌LoVo细胞有显著的抑制作用（P〈0．05）；两药联合应用均优于各自单药的抑制效果，CPT-11联合L-OHP弱于CPT-11或L-OHP与5-FU联合的抑制效果（P〈0．05），由L-OHP到CPT-11小剂量序贯联合具有明显的协同作用；三药联合应用的抑制效果显著优于两药联合（P〈0．05），由5-FU＋L-OHP到5-FU＋CPT-11的序贯联合应用与三药同步联合应用无显著性差异（P〉0．05），但由5-FU＋CPT-11到5-FU＋L-OHP序贯应用时明显低于三药同步应用的效果（P〈0．05），且三药全量及半量联合应用效果差异无显著性（P〉0．05）。结论：由5-FU＋L-OHP到5-FU＋CPT-11的小剂量序贯联合应用具有高效协同抑制大肠癌细胞株LoVo的作用，可为临床难治性和复发性大肠癌患者的化疗及小剂量序贯化疗提供参考。     

Apollon siRNA对慢性髓系白血病K562细胞株阿糖胞苷敏感性影响研究

目的：研究小干扰RNA（RNAi）技术沉默凋亡抑制蛋白Apollon基因联合小剂量阿糖胞苷（Ara-C）对K562细胞化疗敏感性的影响。方法：构建pGPHI-GFP-Neo-Apollon真核表达载体,经阳离子脂质体转染K562细胞,实验分为RNAi组、阴性质粒组、细胞对照组、Ara-C组和RNAi＋Ara-C组5组,采用RT-PCR和细胞免疫荧光检测干扰效果。RNAi与小剂量Ara-C单独和联合应用后,采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：RT-PCR结果显示,实验组Apollon mRNA的相对表达量为（27.622±0.057）%,与细胞对照组（89.770±0.028）%和阴性对照组（84.868±0.057）%相比明显降低,差异有统计学意义,F=57.573,P=0.012。细胞免疫荧光检测结果显示,实验组细胞Apollon蛋白的荧光强度为（15.96±1.71）%,明显低于细胞对照组（35.36±2.90）%和阴性对照组（34.97±2.65）%,差异有统计学意义,F=71.063,P=0.013。重组载体和（或）10μg/mL Ara-C作用于K562细胞24、48和72h后,RNAi组和RNAi＋Ara-C组K562细胞增殖抑制率（IR%）明显增高,随着作用时间的延长,抑制效果越明显。流式细胞术结果显示,RNAi＋Ara-C组细胞凋亡率为（30.816±1.06）%,明显高于细胞对照组（4.803±0.112）%、阴性对照组（4.566±0.205）%和Ara-C组（11.61±0.604）%及RNAi组（20.226±0.986）%,差异有统计学意义,F=138.57,P〈0.001。结论：靶向Apollon RNAi联合小剂量Ara-C能有效抑制K562细胞增殖并促进其凋亡,显著减少Ara-C使用剂量,明显提高了K562细胞对Ara-C的敏感性。     

榄香烯乳诱导线粒体凋亡途径逆转肺癌A549/DDP细胞株耐药

目的：探讨榄香烯乳（ elemene,ELE）逆转人肺腺癌耐顺铂（ cisplatin,DDP）细胞A549/DDP的耐药性及作用机制。方法：采用MTT法检测榄香烯乳单用的细胞毒作用及与DDP合用时耐药逆转作用。荧光探针JC-1结合激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化。DCFH-DA荧光探针结合流式细胞仪检测细胞内活性氧（ reactive oxygen species,ROS）水平。用谷胱甘肽试剂盒结合分光光度法检测计算GSH/（ GSSG﹢GSH）比值。蛋白质印迹法检测胞质中Cyto C、Pro-caspase-3、Caspase-3和Bcl-2家族蛋白表达情况。结果：不同浓度榄香烯乳抑制A549/DDP细胞株生长,呈时间-剂量依赖性效应,联合顺铂能提高A549/DDP细胞株对顺铂的敏感性而逆转耐药。不同浓度榄香烯乳联合顺铂使A549/DDP细胞株线粒体膜电位下降,ROS浓度增加,GSH/（ GSSG﹢GSH）比值降低,上调胞质中Cyto C、Caspase-3、Bad蛋白表达,下调Pro-caspase-3、Bcl-2蛋白表达。结论：榄香烯乳逆转A549/DDP细胞株耐药性可能与其损伤线粒体膜,活化胞内氧化还原体系,诱导线粒体凋亡路径有关。     

非小细胞肺癌患者外周血细胞化疗药物敏感性及其临床意义的研究

目的：通过非小细胞肺癌外周血淋巴细胞和粒细胞体外培养,对其常用的化疗药物进行敏感性检测,以筛选出最佳的化疗方案。方法：应用MTT吸光度法测定32例非小细胞肺癌患者外周血标本对临床常用的4种化疗药物及其组成的2个联合化疗方案的敏感性或耐药性,比较其差异。结果：非小细胞肺癌化疗敏感性个体差异较大,联合化疗药物的敏感性明显优于单药。各药物对淋巴细胞和粒细胞的平均抑制率由高到低的顺序一致,各用药方案间比较均存在差异,部分有显著性差异（P〈0.01）。结论：外周血有核细胞体外药敏试验或耐药试验对临床肿瘤化疗用药有一定的预见性和指导性,对非小细胞肺癌患者进行化疗时,应尽量个体化用药并选择联合用药方案。     

微囊藻毒素-LR对PC12细胞氧化性损伤作用的实验研究

目的:探讨微囊藻毒素-LR(microcystins-LR,MC-LR)对PC12细胞的毒性作用及其机制。方法:用MC-LR对PC12细胞进行染毒,以MTT法测定其对细胞的毒性作用;同时通过测定细胞培养液和细胞内的氧化应激指标初步判断MC-LR对细胞的氧化损伤作用。结果:MC-LR染毒12、24、48 h,对PC12细胞的半数抑制浓度(IC_(50))分别是89.06、47.24、33.13μg/L。MC-LR染毒24h后,细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性升高。当染毒浓度大于等于10μg/L时,细胞中生成丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量随着染毒浓度的增加逐渐升高(P0.05);过氧化氢酶(CAT)含量的变化和SOD具有一致性。而谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量与对照组相比未见显著差异(P0.05)。结论:MC-LR可以抑制PC12细胞的增殖能力和引起细胞膜损伤,并发生氧化损伤作用。