人结肠癌ccl227细胞肿瘤球生长特性及裸鼠移植瘤形成研究

目的:研究人结肠癌ccl227细胞肿瘤球的生长特性及裸鼠移植瘤形成。方法:将培养在SSM中的ccl227细胞移入含有生长因子的SFM中接种在低吸附6孔培养板,观察肿瘤球的生长情况。将肿瘤球移回到SSM中,接种在培养皿中,观察肿瘤球的分化。96孔板接种检测ccl227细胞和肿瘤球细胞的克隆形成率。不同数量的ccl227细胞和肿瘤球细胞分别接种裸小鼠,观察移植瘤形成。结果:在SFM及低吸附的培养条件下观察到了肿瘤球的形成,呈悬浮状态,细胞圆而小。被移回到SSM中的肿瘤球,细胞逐渐贴壁、伸展。4.2%ccl227细胞形成克隆,13.5%肿瘤球细胞形成克隆。在裸小鼠移植中,高于106的ccl227细胞产生了移植瘤,而移植肿瘤球细胞仅需103个细胞。结论:在SFM培养条件下,ccl227细胞肿瘤球细胞可富集,血清可促进肿瘤球细胞分化。ccl227肿瘤球细胞比非肿瘤球细胞具有更强的致瘤性。     

人结肠癌ccl227细胞系肿瘤干细胞生长特性研究

目的：研究体外培养条件下人结肠癌ccl227细胞系肿瘤干细胞的生长特性。方法：用荧光染料Hoechst33342染色培养在SSM和SFM中的ccl227细胞,荧光显微镜观察SP细胞。用6孔板接种的方法绘制ccl227细胞的生长曲线。显微镜观察肿瘤球的生长。结果：在两种培养条件下均观察到ccl227细胞系中存在浅染和拒染的SP细胞。生长曲线显示在两种培养条件下,ccl227细胞的繁殖能力不同。在玻璃培养瓶和低吸附6孔板中均可以培育出肿瘤球,但形态有些不同。结论：SSM和SFM培养条件下,ccl227细胞中均存在SP细胞;在SFM中,ccl227细胞增殖缓慢;SFM可培育出富含肿瘤干细胞的肿瘤球。在低吸附条件下,更易形成悬浮的肿瘤球。     

人胃癌HGC-27细胞及其肿瘤球细胞裸小鼠皮下移植的研究

目的:研究人胃癌HGC-27细胞及其肿瘤球细胞在裸小鼠皮下产生肿瘤的能力。方法:用DMEM培养液(SSM)培养HGC-27细胞。用含有生长因子的DMEM/F12培养液(SFM)在低吸附6孔培养板中诱导肿瘤球的生长。分别将溶于200μL PBS的1×102、1×103、1×104、1×105、1×106和1×107肿瘤细胞或肿瘤球细胞注射到裸小鼠皮下。常规方法制作组织切片。结果:在SSM培养液中HGC-27细胞呈贴壁、伸展状态生长。在SFM及低吸附的培养条件下观察到了肿瘤球的形成,呈悬浮状态。注射了1×106、1×107肿瘤细胞的裸小鼠产生了移植瘤,注射了1×104、1×105、1×106和1×107肿瘤球细胞的裸小鼠产生了移植瘤。移植瘤组织癌细胞间连接疏松,瘤细胞分化程度低。结论:HGC-27肿瘤球细胞比非肿瘤球HGC-27细胞具有更强的致瘤能力。     

人结肠癌ccl227细胞系肿瘤干细胞生长特性研究

目的:研究体外培养条件下人结肠癌cc l227细胞系肿瘤干细胞的生长特性。方法:用荧光染料Hoechst33342染色培养在SSM和SFM中的cc l227细胞,荧光显微镜观察SP细胞。用6孔板接种的方法绘制cc l227细胞的生长曲线。显微镜观察肿瘤球的生长。结果:在两种培养条件下均观察到cc l227细胞系中存在浅染和拒染的SP细胞。生长曲线显示在两种培养条件下,cc l227细胞的繁殖能力不同。在玻璃培养瓶和低吸附6孔板中均可以培育出肿瘤球,但形态有些不同。结论:SSM和SFM培养条件下,cc l227细胞中均存在SP细胞;在SFM中,cc l227细胞增殖缓慢;SFM可培育出富含肿瘤干细胞的肿瘤球。在低吸附条件下,更易形成悬浮的肿瘤球。     

小鼠乳腺癌4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞的富集和鉴定

目的：无血清培养基(serum-free medium, SFM)悬浮培养小鼠乳腺癌细胞株4T1,富集并鉴定4T1细胞株中肿瘤干细胞样细胞。方法：通过含EGF、bFGF和B27等细胞因子的SFM培养富集4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞,将其接种于含血清培养基（serum-supplemented medium, SSM),观察4T1肿瘤干细胞样细胞分化情况。应用细胞表面标志CD44+CD24-/low和Hoechst 33342染色法检测4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞的比例,小鼠致瘤实验验证不同培养条件下4T1肿瘤干细胞样细胞的致瘤能力。结果：4T1细胞在SFM中能够存活、增殖,并形成细胞球,细胞球可连续传代,若重新接种于SSM中可贴壁分化。4T1细胞球中CD44+CD24-/low细胞比例为6.4%~68.9%,侧群 (side population,SP) 细胞比例为7.3%~61.2%,均显著高于SSM中培养的4T1细胞（P<0.05）;随着SFM中细胞球传代次数增加,CD44+CD24-/low细胞和SP细胞的比例逐渐升高。小鼠致瘤实验结果显示,富集了肿瘤干细胞的细胞球比常规培养4T1细胞的致瘤性更强。结论：乳腺癌4T1细胞可在含多种生长因子的SFM中悬浮生长并形成细胞球,4T1细胞中含有的乳腺癌干细胞样细胞可通过SFM培养法富集。     

人胃癌细胞系HGC-27肿瘤球细胞干样特性研究

目的:探讨体外培养条件下人胃癌细胞系HGC-27肿瘤球细胞的干样特性.方法:SFM培养人胃癌细胞系HGC-27的肿瘤球,细胞计数绘制HGC-27细胞和肿瘤球细胞的生长曲线,96孔培养板接种计算细胞的克隆形成能力.结果:成功培养出HGC-27细胞的肿瘤球.生长曲线和克隆形成实验显示,肿瘤球细胞的增殖和克隆形成能力高于HGC-27细胞.结论:HGC-27细胞可以培养成肿瘤球细胞,肿瘤球细胞比HGC-27细胞更具有干样特性.     

人结肠癌ccl227细胞及其肿瘤球细胞信号通路β-catenin表达的研究

目的:研究信号通路β-连环蛋白(β-catenin)在人结肠癌ccl227细胞及其肿瘤球细胞中的表达。方法:培养ccl227细胞及其肿瘤球,分别提取ccl227细胞和肿瘤球细胞的总RNA,设计引物,使用RT-PCR方法检测β-catenin在ccl227细胞和肿瘤球细胞中的转录,使用蛋白质印迹法检测β-catenin在2种细胞中的翻译。结果:RT-PCR方法检测显示,ccl227细胞和肿瘤球细胞的β-catenin的表达结果均为阳性,电泳条带亮度相近。蛋白质印迹法检测显示,ccl227细胞β-catenin为阴性,肿瘤球细胞β-catenin为阳性。结论:ccl227细胞中β-catenin的转录水平与肿瘤球细胞相近,但2种细胞中β-catenin检测结果相差很大,说明存在转录后调节。     

人结肠癌CCL187细胞肿瘤球细胞干细胞特性研究

目的：研究体外培养条件下人结肠癌CCL187细胞系肿瘤球细胞的干细胞特性。方法：用无血清培养液和低吸附6孔培养板培养CCL187细胞,显微镜观察肿瘤球形成,荧光染料Hoechst33342染色观察干样细胞,用24孔培养板接种绘制CCL187细胞和肿瘤球细胞的生长曲线,顺铂和依托泊苷处理检测两种细胞抵抗化疗的能力。结果：CCL187细胞在无血清培养条件下可形成肿瘤球,肿瘤球细胞中存在浅染的干样细胞。两种细胞的生长曲线显示肿瘤球细胞的自我繁殖能力大于CCL187细胞。化疗药物处理显示肿瘤球细胞比一般肿瘤细胞具有更强的化疗抵抗性。结论：CCL187细胞的肿瘤球细胞具有肿瘤干细胞特性。     

多药耐药细胞系K562/A02裸小鼠皮下移植瘤模型的建立与鉴定

目的建立一种耐药特性稳定的裸小鼠移植瘤动物模型,为进行体内肿瘤耐药机制研究和逆转药物的筛选提供实验模型和实验基础.方法将具有典型MDR表型的K562/A02耐药细胞接种于裸小鼠右侧背侧皮下,而亲本K562细胞接种裸小鼠左侧背侧皮下,接种细胞数为1×107细胞/只,观察肿瘤成瘤情况及生长特性,并比较裸小鼠移植瘤细胞和体外培养细胞对化疗药物的敏感性,同时利用RT-PCR和免疫组织化学染色对裸小鼠K562/A02移植瘤基因表型进行鉴定.结果1)K562/A02裸小鼠移植瘤的成瘤率为100%,大约于第6～9天成瘤(体积＞100mm3),敏感肿瘤生长速度与耐药肿瘤无明显差别;2)裸小鼠K562/A02移植瘤肿瘤细胞和体外培养原代细胞对阿霉素的IC50分别为185.24μg/ml和235.25μg/ml,而K562/A02移植瘤肿瘤的IC50分别为3.07μg/ml和3.26μg/ml;阿霉素治疗组能够明显减慢K562敏感移植瘤的生长,而对K562/A02耐药移植瘤的生长几乎无作用;3)K562/A02裸小鼠移植瘤肿瘤细胞具有mdr1/Pgp表达,而K562裸小鼠移植瘤肿瘤细胞则无mdr1/Pgp表达.结论以K562/A02细胞建立的裸小鼠耐药移植瘤模型,仍保持近似体外的耐药活性和基因表型,为耐药机制和逆转研究提供了良好的体内模型.     

裸小鼠高致瘤性K562-n细胞系的生物学特性研究

目的：探讨高致瘤性K562－n细胞系在胸腺缺陷裸小鼠体内致瘤的细胞生物学机理。方法：通过极限稀释法建立K562－n细胞系致瘤率不同的克隆株，并以K562细胞为对照，对各克隆株进行裸小鼠体内外生物学特性的比较研究，结果：高致瘤性的T562－B、K562－C、K562－E克隆株（致瘤率≥5／6），其软琼脂培养集落形成率，特别是大集落形成率，较对照K562细胞显著增高，（P＜0．01），而无致瘤性或低致瘤性的K562－A、K562－D克隆株（致瘤率≤2／6），其集落形成率与对照无显著差别（P＞0．05）；超微结构观察提示高致瘤性克隆株，常染色质成分增多，异染色质少见，胞浆内微丝增多且排列紊乱；流式细胞仪细胞周期分布分析显示高致瘤性的克隆株S期细胞比例增加。实验结果还表明裸小鼠NK细胞对高致瘤性克隆株的杀伤活性显著低于对照的K562细胞（P＜0．01），而低致瘤性克隆株与对照无显著差别（P＞0．05）；组织病理观察显示低瘤性的克隆株及对照K562细胞，所成裸小鼠肿瘤组织内有大量的炎性细胞浸润，大量肿细胞被杀伤，血供丰富区尤甚，而高致瘤性克隆株所致肿瘤组织内炎性细胞浸润少见，肿瘤组织增殖旺盛，结论：K562－n细胞系的裸小鼠高致瘤机理在于：1．软琼脂集落形成率增高，2．细胞增殖和DNA合成活跃，涉及细胞周期调节因素和细胞骨架成分的改变，3．对裸小鼠NK细胞杀伤的耐受性增强，所接种宿主的免疫力受到抑制，形成肿瘤组织内炎性细胞浸润减少。     

人KB细胞和CCL227细胞与肿瘤球细胞超微结构的比较

目的：比较人口腔癌KB细胞和结肠癌CCL227细胞与肿瘤球细胞的超微结构,为肿瘤干细胞研究提供更多的资料。方法：使用有血清培养液培养两种肿瘤细胞,无血清培养液分别诱导两种肿瘤细胞生成肿瘤球。常规方法制备KB细胞、CCL227细胞、KB肿瘤球细胞、CCL227肿瘤球细胞透射电子显微镜切片,透射电子显微镜观察、拍照。结果：在四组样本中,细胞基本表现两种形态。一种细胞表面有突起,核糖体、线粒体数量相对较多。另一种细胞表面无突起,细胞核周围出现微丝,核糖体、线粒体数量减少,核内染色质出现靠边,后一种细胞在肿瘤球细胞中较多见。结论：伴随生理功能的改变,肿瘤干细胞的结构也发生了一些改变,这些改变可能会使蛋白合成下降。     

人KB细胞和CCL227细胞与肿瘤球细胞超微结构的比较

目的:比较人口腔癌KB细胞和结肠癌CCL227细胞与肿瘤球细胞的超微结构,为肿瘤干细胞研究提供更多的资料.方法:使用有血清培养液培养两种肿瘤细胞,无血清培养液分别诱导两种肿瘤细胞生成肿瘤球.常规方法制备KB细胞、CCL227细胞、KB肿瘤球细胞、CCL227肿瘤球细胞透射电子显微镜切片,透射电子显微镜观察、拍照.结果:在四组样本中,细胞基本表现两种形态.一种细胞表面有突起,核糖体、线粒体数量相对较多.另一种细胞表面无突起,细胞核周围出现微丝,核糖体、线粒体数量减少,核内染色质出现靠边,后一种细胞在肿瘤球细胞中较多见.结论:伴随生理功能的改变,肿瘤干细胞的结构也发生了一些改变,这些改变可能会使蛋白合成下降.     

β-连环蛋白在结肠癌细胞及肿瘤球细胞中的表达

目的：研究信号通路β-连环蛋白在人结肠癌ccl187细胞及其肿瘤球细胞中的表达状况。方法：培养ccl187细胞及其肿瘤球,分别提取ccl187细胞和肿瘤球细胞的总RNA,应用半定量RT-PCR和Westernblot方法分别检测β-连环蛋白在ccl187细胞及其肿瘤球中的mRNA水平及蛋白水平的表达。结果：半定量RT-PCR结果显示ccl187细胞和肿瘤球细胞中β-连环蛋白转录水平分别为41.6%和42.6%（P〉0.05）。半定量Western blot结果显示ccl187细胞和肿瘤球细胞中β-连环蛋白的含量分别为36.7%和73.4%（P〈0.05）。结论：信号通路β-连环蛋白在人结肠癌ccl187细胞及其肿瘤球细胞中转录水平基本一致,但肿瘤球细胞中β-连环蛋白被积累,含量显著高于ccl187细胞。     

人肺腺癌细胞系中肿瘤干细胞的分离培养及鉴定*

目的:从人肺腺癌细胞系A 549 及H 1299中分离富集含肿瘤干细胞的细胞球并鉴定其生物学特性。方法:用无血清悬浮培养的方法从人肺腺癌A 549 及H 1299细胞株中富集得到肿瘤细胞球。将肿瘤细胞球传代扩增,体外利用CCK-8 法、平皿克隆以及Transwell 小室实验,研究细胞球的增殖情况、自我更新和侵袭转移能力;通过RT-PCR 检测干细胞特异性转录因子Oct4、Nanog基因表达情况;体内利用裸鼠移植瘤形成实验研究肺癌细胞球的成瘤能力。鉴定细胞球的肿瘤干细胞特性。结果:在无血清悬浮培养下,A 549 及H 1299细胞株3~ 6 天后能形成稳定传代的肿瘤悬浮球,悬浮球的体外自我更新、克隆形成和侵袭转移等能力均高于其亲本细胞（P < 0.05）;干细胞核心基因Oct4 和Nanog的mRNA 表达水平明显升高（P < 0.05）;A 549 悬浮球可以明显提高裸鼠体内成瘤能力。结论:通过无血清悬浮培养法可有效富集A 549 及H 1299细胞系中的干细胞成分,该法可成为快速易行构建肺腺癌干细胞模型的方法。