沉默ATAD3A对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制研究

【摘要】 目的 探讨沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法 2019年8 - 12月在重庆市渝北区人民医院收集经病理确诊的3例黑素瘤患者的黑素瘤组织及癌旁组织 ,应用Western印迹检测ATAD3A在上述组织中的表达。分别采用沉默ATAD3A慢病毒和空载慢病毒感染黑素瘤A375细胞系,构建沉默ATAD3A（shATAD3A）实验组和空载对照（shCtrl）组,经实时荧光定量聚合酶链反应（qRT?PCR）和Western印迹验证干扰效率。采用CCK?8实验、克隆形成实验比较两组细胞的增殖能力和克隆形成能力,采用Transwell细胞侵袭实验、划痕实验比较两组细胞的侵袭、迁移能力,采用Western印迹检测两组细胞自我更新相关蛋白（NANOG、SOX2、OCT4）和侵袭、迁移相关蛋白［基质金属蛋白酶2（MMP2）、波形蛋白、SLUG］的表达水平。两组间各指标的比较采用独立样本t检验。结果 Western印迹显示,相对于癌旁组织,ATAD3A在3例黑素瘤组织中高表达（t = 10.825,P < 0.001）。qRT?PCR和Western印迹显示,shATAD3A组A375细胞ATAD3A mRNA为0.230 ± 0.073,shCtrl组为1.000 ± 0.244,两组比较,t = 9.461,P < 0.001,蛋白表达水平分别为0.279 ± 0.267和0.867 ± 0.115,t = 8.595,P = 0.002, 表明成功构建沉默ATAD3A的黑素瘤A375细胞系。克隆形成实验和CCK?8实验显示,shATAD3A组克隆形成率低于shCtrl组（22.667% ± 2.510%比43.667% ± 5.030%,t = 6.464,P = 0.003）,且细胞增殖活性自第2天开始直至第4天均显著低于shCtrl组。划痕实验及Transwell细胞侵袭实验显示,与shCtrl组相比,shATAD3A组划痕愈合减慢,划痕愈合率自第12 h开始（32.920% ± 4.642%比49.302% ± 1.448%,t = 5.835,P = 0.004）至24 h明显降低,通过Transwell小室下室的侵袭细胞数减少（68.330 ± 13.050比234.330 ± 19.139,t = 12.411,P < 0.001）。Western印迹显示,shATAD3A组细胞NANOG、SOX2、OCT4、MMP2、波形蛋白、SLUG的表达水平均显著下降（P < 0.05或0.001）。结论 ATAD3A在黑素瘤组织中高表达,沉默ATAD3A能抑制黑素瘤A375细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

白藜芦醇对婴儿血管瘤内皮细胞活性的影响

【摘要】 目的 研究葡萄糖转运体1（Glut-1）抑制剂白藜芦醇（RSV）对婴儿血管瘤内皮细胞（HemEC）活性的影响。方法 收集4例增殖期与4例消退期婴儿血管瘤（IH）组织,采用免疫组化观察Glut-1的表达。从4例增殖期IH组织中提取原代HemEC,采用qPCR与Western印迹检测HemEC与对照脐静脉内皮细胞 （HUVEC）中Glut-1 mRNA与蛋白的表达水平。体外培养HemEC,分别采用0（对照组）、50、100、200、400、800 μmol/L RSV干预24 h,采用CCK-8法检测各组HemEC增殖能力,计算半抑制浓度（IC50）。分别采用Transwell实验、流式细胞仪观察HemEC迁移能力及凋亡水平。组间比较采用t检验或方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验。结果 免疫组化显示,增殖期及消退期IH组织中血管内皮细胞Glut-1均阳性,但增殖期表达丰富,消退期表达明显降低。HemEC中Glut-1 mRNA及蛋白表达水平（1.793 ± 0.041、1.959 ± 0.144）均高于HUVEC（0.820 ± 0.073、0.648 ± 0.046,t = 16.35、12.28,均P < 0.001）。采用Glut-1抑制剂RSV干预HemEC后,0 ~ 800 μmol/L组HemEC增殖活性差异有统计学意义（F = 1 043.00,P < 0.001）,所有RSV干预组HemEC的增殖活性均低于对照组（P < 0.05）。GraphPad Prism 8计算得出RSV IC50浓度为150 μmol/L,Transwell实验与流式细胞仪检测显示,150 μmol/L RSV干预组HemEC组细胞迁移数（61 ± 5）低于对照组（150 ± 6,t = 15.11,P < 0.001）,凋亡率（13.01% ± 0.45%）高于对照组（3.93% ± 0.68%,t = 19.34,P < 0.001）。结论 糖酵解关键酶Glut-1在IH增殖期组织与HemEC中高表达,RSV干预可以抑制HemEC增殖及迁移能力并促进其凋亡。     

辛伐他汀对缺氧黑素瘤细胞A375增殖凋亡及迁移的影响

目的 探讨辛伐他汀对缺氧黑素瘤细胞A375增殖、凋亡、迁移调控的分子机制.方法 在常氧或缺氧环境下体外培养A375细胞,细胞分为辛伐他汀处理的辛伐他汀组与二甲基亚砜处理的对照组,通过CCK-8细胞计数试剂盒检测细胞活力,Annexin V/PI凋亡实验检测细胞凋亡,插入式细胞培养皿transwell迁移实验检测细胞迁移.RT-PCR法、Western印迹法检测辛伐他汀组与对照组细胞低氧诱导因子(HIF)-1α、生存素、细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子(P27),以及沉默缺氧A375细胞的HIF-1α后的生存素、p27 mRNA与蛋白表达水平.结果 常氧或缺氧环境下,辛伐他汀组与对照组A375细胞增殖活力、凋亡细胞比例、细胞迁移数组间差异均有统计学意义(F值95.84、37.22、177.5,均P＜0.001),缺氧对照组A375细胞的增殖活力(1.391±0.129)、细胞迁移数(322.550±26.226)均高于常氧对照组(0.807±0.049、125.583±17.256)、缺氧辛伐他汀组(0.685±0.417、115.167±12.050)(P＜ 0.001);缺氧对照组细胞凋亡比例(6.167％±2.714％)均低于常氧对照组(11.833％±2.483％)、缺氧辛伐他汀组(17.833％±2.714％)(P＜0.01).缺氧辛伐他汀组HIF-1αmRNA与蛋白水平、生存素mRNA与蛋白水平均低于对照组(P＜ 0.05);P27mRNA与蛋白水平均高于对照组(P＜0.05).沉默缺氧A375细胞中HIF-1α后,生存素mRNA与蛋白水平均低于对照组(t值为5.346、8.281,P＜0.05),P27 mRNA与蛋白水平高于对照组(t值为31.37、9.954,P＜0.01).结论 辛伐他汀可抑制缺氧A375细胞的增殖及迁移,促进凋亡,其机制可能与HIF通路有关.     

普萘洛尔对体外培养血管瘤内皮细胞的影响及其分子机制

目的 研究普萘洛尔对体外培养的血管瘤内皮细胞(HemEC)增殖及凋亡的影响,探讨其分子机制.方法 收集7例增生期血管瘤患儿的手术切除血管瘤组织用于体外培养HemEC,同时培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为对照.采用0、25、50、75、100、125、150 μmol/L普萘洛尔分别处理两种细胞24、48、72 h.MTT法检测各组细胞的存活率,流式细胞仪检测凋亡率.采用含或不含100 μmol/L普萘洛尔的培养基分别培养HemEC(分别为普萘洛尔干预组及空白对照组)18h,提取两组细胞总RNA,采用表达谱基因芯片技术检测两组HemEC中差异表达的基因,并通过实时定量PCR验证.结果 25 μmol/L普萘洛尔作用24、48 h可引起HemEC轻微增殖(P＜0.05),而≥100 μmol/L普萘洛尔作用≥24 h可引起HemEC存活率下降,作用≥48 h可引起HUVEC存活率下降.100 ～150 μmol/L普萘洛尔作用24～72 h,HemEC细胞存活率比HUVEC低(P＜0.05).100 ～ 150 μmol/L普萘洛尔作用下,HemEC凋亡率随普萘洛尔作用时间及浓度逐渐升高(均P＜0.05).普萘洛尔干预HemEC后,表达谱基因芯片技术筛选出186个表达差异倍数≥1.5的基因,其中表达明显上调的基因128个,明显下调的58个.实时定量PCR显示,普萘洛尔干预组前蛋白转化酶枯草溶菌素9 mRNA表达水平为空白对照组的(9.88士2.19)倍,脂肪酸结合蛋白3 mRNA为(21.90±8.18)倍,差异均有统计学意义(t=7.028、4.427,P＜0.05).结论 高浓度普萘洛尔对HemEC及HUVEC的增殖均有抑制作用,且对HemEC的抑制作用更强.普萘洛尔抑制HemEC的增长可能与抑制HemEC增殖及促进其凋亡有关.     

当归提取物对内皮细胞迁移能力及明胶酶表达的影响

目的研究当归提取物对内皮细胞迁移能力及明胶酶表达的影响。方法应用迁移实验研究了当归提取物对内皮细胞迁移能力的影响．应用半定量RT—PCR技术及免疫印迹杂交技术分别在mRNA及蛋白水平检测了当归提取物对明胶酶表达的影响，同时应用明胶酶谱法观测了当归提取物对明胶酶活性的影响。结果0．1、1．0及10．0g/L浓度的当归提取物可明显抑制佛波酯诱导的内皮细胞迁移，抑制率分别为（30．44±7．01）％、（52．30±7.48）％及（74．77±3．15）％；同时当归提取物可影响明胶酶B的mRNA及蛋白的表达，并可下调其活性，10．0g/L浓度的当归提取物对明胶酶B mRNA、蛋白及酶活性的抑制率分别为（33．75±7．79）％、（72．36±4．02）％及（44．52±11．75）％。当归提取物可明显抑制明胶酶A蛋白表达及活性，10．0g／L浓度时抑制率为（72．34±5．07）％、（53．70±6．46）％，但对明胶酶A mRNA的表达无明显影响。结论当归提取物可在体外抑制佛波酯诱导的内皮细胞迁移．此作用可能是通过其对明胶酶表达或活性的抑制来实现．     

激光照射对体外培养的婴儿血管瘤内皮细胞相关生长因子及细胞凋亡的影响

【摘要】 目的 研究激光照射对体外培养的婴儿血管瘤内皮细胞相关生长因子及细胞凋亡的影响。方法 活化培养的婴儿血管瘤内皮细胞分为3组,强脉冲光（IPL）组（23 J/cm2,照射1次）、激光组（1 064 nm Nd：YAG激光,90 J/cm2,照射1次）和对照组（不照射激光）。照射后第1、3、7天,RT-PCR检测血管内皮生长因子（VEGF）、VEGF受体2（VEGFR-2）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）mRNA的表达,Western印迹检测VEGFR-2蛋白表达,ELISA检测细胞上清液中VEGF和bFGF的含量,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 与对照组相比,1 064 nm Nd：YAG激光照射后第7天,VEGF mRNA（0.363 ± 0.021比1.000 ± 0.023）、VEGFR-2 mRNA（0.483 ± 0.017比1.001 ± 0.031）、bFGF mRNA（0.402 ± 0.040比1.000 ± 0.004）表达均下降,VEGFR-2蛋白表达下降（0.332 ± 0.055比0.768 ± 0.096）,VEGF［（69.389 ± 24.179） ng/L比（334.506 ± 13.084） ng/L］和bFGF［（2.386 ± 0.151） ng/L比（9.165 ± 0.232） ng/L］分泌减少,细胞凋亡率（18.413% ± 2.654%比4.300% ± 0.036%）上升,差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比,IPL组照射后第7天VEGF mRNA（0.436 ± 0.041比1.000 ± 0.023）、VEGFR-2 mRNA（0.493 ± 0.037比1.001 ± 0.031）、bFGF mRNA（0.490 ± 0.044比1.000 ± 0.004）表达下降,VEFGR-2蛋白表达下降（0.406 ± 0.037比0.768 ± 0.096）,VEGF［（128.858 ± 6.063） ng/L比（334.506 ± 13.084） ng/L］和bFGF［（2.723 ± 0.471） ng/L比（9.165 ± 0.232） ng/L］分泌减少,细胞凋亡率上升（16.597% ± 1.877%比4.300% ± 0.036%）,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 1 064 nm Nd：YAG激光可能通过调节VEGF/VEGFR-2信号通路上的关键因子,以及细胞凋亡发挥对血管瘤内皮细胞的抑制作用,从而达到治疗血管瘤的作用。     

普萘洛尔及异丙肾上腺素对体外培养婴儿血管瘤内皮细胞增殖和血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的：探讨普萘洛尔及异丙肾上腺素在体外对婴儿血管瘤内皮细胞增殖及血管内皮细胞生长因子（VEGF、VEGF-2）、人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达的影响。方法将体外培养的2~3代增殖期婴儿血管瘤内皮细胞分为普萘洛尔组和异丙肾上腺素组,其中普萘洛尔组分别换浓度为10、15、20 mg/L 普萘洛尔工作液（10、15、20 mg/L 普萘洛尔组）、空白 EGM-2培养基（空白组）和含0.16% DMSO EGM-2培养基（DMSO组）培养,而异丙肾上腺素组分别换5、10、20 mg/L 异丙肾上腺素工作液（5、10、20 mg/L 异丙肾上腺素组）和空白EGM-2培养基（空白组）培养。采用 MTT 法测定24、48、72、96 h 时各组血管瘤内皮细胞的增殖情况,ELISA 法测定培养24、48 h 时各组细胞培养上清液中 VEGF、VEGF-2、bFGF 的浓度。结果培养24、48 h 时,10、15、20 mg/L 普萘洛尔组血管瘤内皮细胞增殖差异无统计学意义（H 值分别为1.152、2.643,均 P >0.05）;72、96 h 时,20 mg/L 普萘洛尔组血管瘤内皮细胞的增殖明显低于空白组（P <0.05）,而空白组、DMSO 组及10、15 mg/L 普萘洛尔组间差异均无统计学意义。各浓度普萘洛尔、异丙肾上腺素作用24 h 时均对 VEGF、VEGF-2、bFGF 水平有一定影响。48 h 时,15、20 mg/L 普萘洛尔组 VEGF 水平均较空白组显著下降,同时10、15、20 mg/L 普萘洛尔组VEGF-2、bFGF 水平也均较空白组显著下降（P <0.05）;而5、10、20 mg/L 异丙肾上腺素组 VEGF 水平均较空白组显著升高（P <0.05）,20 mg/L 异丙肾上腺素组 VEGF-2、bFGF 水平均显著高于空白组及5、10 mg/L 异丙肾上腺素组（P <0.05）。结论一定浓度普萘洛尔作用于增殖期婴儿血管瘤内皮细胞一定时间后能够抑制细胞生长,而异丙肾上腺素反之,两者对细胞因子表达的影响作用也相反,因此推断普萘洛尔治疗婴儿血管瘤的机制可能与β肾上腺素能受体及其下游信号转导影响相关细胞因子表达相关。     

基于MAPK/Wnt3a/mTOR/VEGF信号通路上调miR-23对子宫肌瘤细胞凋亡、侵袭、迁移的影响

目的基于丝裂原活化蛋白激酶/人Wnt-3a蛋白/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/血管内皮生长因子(MAPK/Wnt3a/mTOR/VEGF)信号通路探究上调miR-23对子宫肌瘤细胞凋亡、侵袭、迁移能力的影响。方法选取子宫肌瘤细胞,经培养后分为对照组、下调组、上调组,对三组增殖、凋亡、侵袭、迁移能力进行检测,检测miR-23、肾素活性(PRA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、上皮型黏附蛋白(E-cadherin)、MAPK、Wnt3a、mTOR、VEGF表达量。结果与对照组比较,下调组miR-23表达较低,PRA表达较高,上调组miR-23表达较高,PRA表达较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,下调组凋亡率、增殖抑制率较低,侵袭细胞数、迁移细胞数较高,上调组凋亡率、增殖抑制率较高,侵袭细胞数、迁移细胞数较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,下调组MAPK、Wnt3a、mTOR、VEGF、MMP-2相对表达量较高,E-cadherin相对表达量较低,上调组MAPK、Wnt3a、mTOR、VEGF、MMP-2相对表达量较低,E-cadherin...     

空气细颗粒物PM2.5对HaCaT细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

目的 探讨空气细颗粒物PM2.5对HaCaT细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法 收集北京市2015—2016年采暖季雾霾天气PM2.5,制备成混悬液。将HaCaT细胞分为空白组（仅用细胞培养基）、对照组（不加PM2.5,其他处理同实验组）和实验组［100 ~ 400 mg/L（细胞形态学观察和增殖实验用50 ~ 800 mg/L）PM2.5混悬液处理］处理24 h后,倒置显微镜下观察细胞形态变化;CCK8法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡;Western 印迹法检测细胞周期蛋白A2（cyclin A2）及细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）的表达水平。结果 随着PM2.5浓度升高,HaCaT细胞形态逐渐发生改变,细胞数目逐渐减少。与对照组（100 ± 4.95）%相比,50 mg/L PM2.5组HaCaT细胞存活率无明显变化（P＞0.05）,100、200、400、800 mg/L PM2.5组细胞存活率［分别为（91.77 ± 2.04）%、（80.01 ± 1.57）%、（57.80 ± 1.56）%、（21.98 ± 0.86）%］均显著下降（P＜0.05）。流式细胞仪检测显示,与对照组相比,PM2.5组（100、200、400 mg/L）S期细胞比例逐渐增高,G2/M期细胞比例逐渐降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。Western印迹法显示,100、200、400 mg/L PM2.5组cyclin A2、CDK1蛋白表达均较对照组有所降低,尤其以200 mg/L组降低最明显,差异均有统计学意义（P＜0.05）。100、200、400 mg/L PM2.5组细胞总凋亡率分别为（9.98 ± 0.21）%、（12.56 ± 0.74）%、（16.74 ± 1.48）%,与对照组（6.24 ± 0.17）%相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 PM2.5可能通过下调cyclin A2、CDK1表达水平诱导HaCaT细胞发生S期阻滞,从而抑制细胞增殖,促进HaCaT细胞凋亡。     

大黄素对黑素瘤B16F10细胞增殖、迁移及凋亡的影响

目的：明确大黄素对黑素瘤B16F10细胞增殖、迁移及凋亡的影响。方法：10、20、40、60、80 μmol/L的大黄素作用于B16F10细胞24 h后，Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法检测细胞增殖；倒置显微镜下观察细胞形态及数目变化；细胞划痕实验和Transwell迁移实验分别检测各组细胞划痕愈合率和细胞迁移数目；流式细胞术检测细胞周期；TUNEL法检测细胞凋亡情况；Western blot测定凋亡相关蛋白caspase-3的表达。结果：与空白对照组比较，不同浓度（10、20、40、60、80 μmol/L）的大黄素均可抑制B16F10细胞的增殖（P＜0.05），其抑制率呈浓度依赖和时间依赖关系，并且将细胞阻滞于G2/M期。在显微镜观察下细胞呈现出凋亡状态，不同浓度的大黄素组凋亡相关蛋白caspase-3的表达水平升高。结论：大黄素可有效抑制黑素瘤B16F10细胞增殖，抑制细胞迁移能力，并能促进细胞凋亡。     

载芬维A铵脂质体体外对恶性黑素瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的 探讨载芬维A铵脂质体（4-HPR-L）对A375及B16F10黑素瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法 采用薄膜-超声分散法制备载4-HPR-L。体外分别培养A375及B16F10黑素瘤细胞,分为3组,空白对照组仅加入细胞和新鲜培养基,4-HPR组和4-HPR-L组分别加入同浓度4-HPR和4-HPR-L。细胞增殖抑制实验（CCK-8法）检测各组细胞增殖情况;Hoechst33258染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡情况;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;通过激光共聚焦显微镜观察4-HPR-L入胞情况。采用SPSS22.0软件进行统计分析,多组间数据比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。结果 4-HPR与4-HPR-L对A375和B16F10的增殖抑制作用均表现出浓度依赖,0.1、1、15、30、50、70 mg/L 4-HPR和4-HPR-L处理A375和B16F10细胞48 h后,4-HPR组A375细胞存活率分别为（94.3 ± 1.4）%、（91.7 ± 2.5）%、（84.4 ± 2.5%）、（78.8 ± 2.1）%、（59.0 ± 1.1）%、（42.8 ± 2.0）%,4-HPR-L组分别为（86.0 ± 0.2）%、（76.5 ± 0.6）%、（60.9 ± 1.5）%、（49.0 ± 0.5）%、（32.9 ± 0.2）%、（18.9 ± 0.5）%,同浓度两组间比较,t值分别为8.019、8.298、11.455、19.978、33.672、16.314,均P < 0.01;4-HPR组B16F10细胞存活率分别是（95.4 ± 1.9）%、（90.5 ± 2.6）%、（77.0 ± 0.8%）、（64.4 ± 3.5）%、（59.1 ± 2.9）%、（49.9 ± 1.9）%,4-HPR-L组分别是（88.4 ± 2.0）%、（80.9 ± 3.4）%、（60.9 ± 2.2）%、（51.5 ± 2.9）%、（41.1 ± 1.2）%、（33.5 ± 2.4）%,同浓度两组间比较,均P < 0.05。相同浓度下,4-HPR同浓度组A375和B16F10细胞存活率均高于4-HPR-L组。Hoechst33258染色显示,对照组、4-HPR组细胞无明显变化,而4-HPR-L组细胞体积变小,细胞质浓缩,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。流式细胞仪检测显示,4-HPR-L组A375和B16F10细胞凋亡率均显著高于4-HPR组,均P < 0.01。细胞划痕实验显示,4-HPR-L较4-HPR能更好地抑制细胞移行,显著降低划痕的愈合程度。激光共聚焦显微镜观察显示,C6脂质体入胞迅速。结论 4-HPR-L能更好地进入A375细胞、B16F10细胞,且能有效抑制A375、B16F10细胞的增殖和迁移,并诱导其凋亡。     

葡萄糖转运蛋白3在皮肤鳞状细胞癌中的表达及其对A431细胞增殖、侵袭及迁移的影响

目的探究葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)在皮肤鳞状细胞癌(cSCC)中的表达及其对cSCC细胞系A431的影响。方法收集2016年6月至2020年12月经北京大学第三医院皮肤科病理确诊为cSCC患者的石蜡组织标本22份, 皮肤科手术中废弃的正常皮肤组织20份作为对照, 采用免疫组化法检测cSCC和正常皮肤组织中GLUT3的表达。将A431细胞分为GLUT3过表达组和阴性对照组, 分别转染携带SLC2A3基因的慢病毒载体和慢病毒空载体。实时荧光定量PCR及Western印迹法检测各组细胞中GLUT3 mRNA及蛋白的表达水平, MTS法检测各组细胞增殖活力, 动态细胞成像分析系统Incucyte S3实时检测各组细胞的迁移和侵袭能力。分别用葡萄糖及乳酸试剂盒检测并比较各组细胞48 h葡萄糖消耗量及乳酸产生量。两组间比较采用两独立样本t检验, 多组间比较采用单因素方差分析。结果 cSCC组织中GLUT3的表达[免疫组化评分:(9.39 ± 2.56)分]显著高于正常皮肤组织[(2.30 ± 2.60)分], t = 8.91, P<0.05。与A431细胞阴性对照组相比, GLUT3过...     

丹皮酚对人黑素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨丹皮酚对体外培养人黑素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。 方法 CCK8法检测0.5,1,2,4,8 mmol/L丹皮酚作用24,48 和72 h后A375细胞增殖水平。用0、1.25、2.5和5 mmol/L浓度丹皮酚作用24 h后,以Annexin-Ⅴ/PI法观察A375细胞凋亡的变化、分别测定caspase 3,caspase 8和caspase 9的活性,并以Western印迹检测p53,NF-κB及相关蛋白水平的变化。 结果 与空白对照组比较,0.5,1,2,4,8 mmol/L丹皮酚作用24,48 和72 h后均对A375细胞的增殖有抑制作用,且与时间、浓度呈依赖性。1.25、2.5、5 mmol/L丹皮酚在作用24 h时,A375细胞早期凋亡率由对照组的（3.11 ± 0.53）%分别上升至（13.74 ± 1.73）%、（25.95 ± 0.57）%、（46.44 ± 0.81）%,各组与对照组间差异均有统计学意义（P < 0.05或 < 0.01）。2.5 mmol/L和5 mmol/L作用组的caspase 3,caspase 8,caspase 9活性升高,且与对照组间比较,差异均有统计学意义（P < 0.05或< 0.01）。p53及Bax的蛋白水平随药物浓度的增加而升高,NF-κB、bcl-2、bcl-XL的蛋白水平随药物浓度增加而降低。 结论 丹皮酚对黑素瘤A375细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。可通过细胞内和细胞外两条途径发挥促凋亡作用,其机制可能与调节p53及NF-κB基因有关。     

芳姜黄酮衍生物对A375人黑素瘤细胞增殖及凋亡作用的机制研究

目的：研究一种芳姜黄酮衍生物（ATD）对人皮肤黑色素瘤A375细胞增殖及凋亡的影响。方法不同浓度（5、10、20、40、80μmol/L）ATD、长春新碱及芳姜黄酮体外作用A375及人皮肤成纤维细胞（HSF）48 h。CCK?8法检测细胞增殖抑制率;吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色,倒置显微镜观察细胞凋亡形态;DNA片段化检测细胞凋亡;比色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase?3）活性;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期。结果ATD、长春新碱及芳姜黄酮对A375细胞有抑制增殖作用,且呈剂量依赖性（ATD：R2=0.99,F=340.96;长春新碱：R2=0.99,F=349.19;芳姜黄酮：R2=0.89,F=25.41,均P<0.05）,三者IC50分别为（15.96±0.02）、（77.00±0.04）及（356.95±0.01）μmol/L。当药物浓度为5μmol/L及10μmol/L时,ATD对HSF增殖抑制率分别为（8±0.06）%和（25±0.02）%,长春新碱为（33±0.04）%和（29±0.08）%,芳姜黄酮为（49±0.09）%和（34±0.07）%;ATD对A375细胞抑制率分别为（26±0.06）%和（39±0.02）%,长春新碱为（8±0.04）%和（17±0.08）%,芳姜黄酮为（6±0.09）%和（10±0.07）%,与二甲基亚砜相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）,且ATD对A375细胞增殖抑制活性强于长春新碱及芳姜黄酮（P＜0.05）,但对HSF细胞毒性却明显低于长春新碱及芳姜黄酮（P＜0.05）。ATD、长春新碱及芳姜黄酮均可诱导A375细胞凋亡,caspase?3活性随3种药物浓度增加而增强,且药效为ATD>长春新碱>芳姜黄酮。流式细胞仪检测证实,3种药物都能诱导细胞发生不同程度凋亡,同芳姜黄酮及长春新碱相比,ATD能显著诱导细胞凋亡,且以晚期凋亡为主。随药物浓度增加,ATD组G1期A375细胞逐渐增多,G2期及S期细胞数明显减少。结论 ATD对A375细胞有抑制增殖及促凋亡作用,该作用明显强于芳姜黄酮及长春新碱,其机制可能是激活caspase?3,使细胞周期阻滞在G1期,进而抑制肿瘤细胞分化与增殖。