过表达lncRNA LINC00886 抑制食管鳞状细胞癌Eca109 细胞的恶性生物学行为

[摘要] 目的: 检测lncRNA LINC00886 在食管鳞状细胞癌（ESCC）组织及细胞系中的表达及其对Eca109 细胞体外增殖、迁移及侵袭的影响。方法: 收集2014 年6 月至2016 年12 月河北医科大学第四医院生物标本库69 例ESCC手术患者的癌及对应的癌旁组织标本,以及ESCC细胞系Eca109、TE13、TE1、Kyse150、Yes-2 和Kyse170,用qPCR 法检测LINC00886 在ESCC组织及细胞系中的表达情况。分别用pIRES2-LINC00886、pIRES2-NC转染Eca109 细胞,用qPCR法检测pIRES2-LINC00886 转染Eca109细胞后LINC00886 的过表达效率;用MTS、克隆形成实验、划痕愈合实验、Transwell 侵袭实验分别检测过表达LINC00886 对Eca109 细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果: 在ESCC组织中LINC00886 表达水平明显低于癌旁组织（P<0.01）,其表达水平与肿瘤TNM分期和淋巴结转移相关（均P<0.05）。LINC00886 在ESCC 细胞中的表达水平也低于对照组（均P<0.01）。转染pIRES2-LINC00886 后,Eca109 细胞中LINC00886 的表达水平显著高于对照组（均P<0.05）。与对照组相比,过表达LINC00886 明显抑制Eca109 细胞的增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.01)。结论: lncRNA LINC00886 低表达可能与ESCC的发生发展相关,过表达LINC00886可抑制ESCC细胞的增殖、迁移与侵袭能力。     

lncRNA LINC00504在乳腺癌组织及细胞中的表达、功能及可能机制

目的：探讨lncRNA LINC00504在乳腺癌中的表达、功能及可能的机制。方法：利用GEPIA等多个数据库分析LINC00504在乳腺癌组织中的表达及其与患者预后关系、与乳腺癌驱动基因相关性,筛选与LINC00504表达密切相关的关键基因并分析其相关信号通路。将si-LINC00504转染三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和SKBR3,qPCR检测转染细胞中LINC00504的表达;CCK-8法检测转染细胞的增殖能力。结果：数据库分析显示LINC00504在乳腺癌组织和体外培养MDA-MB-231和SKBR3细胞中均呈高表达,其高表达患者的PFS长于低表达患者。LINC00504表达与乳腺癌驱动基因ERRB2和BRCA1呈正相关、与BRCA2呈负相关,LINC00504相关的20个关键基因涉及多种肿瘤,主要参与氨基酸代谢、糖酵解/糖异生途径。敲减LINC00504表达可促进MDA-MB-231和SKBR3细胞的增殖。结论：在乳腺癌组织中高表达的LINC00504与患者PFS有关联;其相关基因可能参与多种肿瘤的氨基酸和糖代谢;敲减LINC00504可促进MDA-MB-231和SKB...     

lncRNASNHG15靶向miR-153对乳腺癌细胞线粒体途径凋亡的影响

目的：探讨lncRNASNHG15靶向miR-153对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其凋亡机制。方法: 用实时荧光定量 PCR（qPCR）检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231、BT-549 和 MCF-7中SNHG15表达水平。将MDA-MB-231 细胞分为对照（Ctrl） 组、si-NC组、si-SNHG15组、si-SNHG15+anti-NC组及si-SNHG15+anti-miR-153组, 用MTT法及流式细胞术分别检测细胞的增殖 活力和凋亡率。用双荧光素酶报告基因实验验证SNHG15和miR-153的靶向关系。用线粒体膜电位荧光探针（JC-1）染色法检测 细胞线粒体膜电位, 用Western blotting检测线粒体途径凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase3、cleaved caspase3（c-caspase3）和Cyt-C 的表达水平。结果:SNHG15在3种乳腺癌细胞中的表达水平均明显高于人正常乳腺上皮细胞MCF10A（均P<0.01）。SNHG15与 miR-153存在靶向关系。沉默SNHG15后,与对照组比较,si-SNHG15组MDA-MB-231细胞增殖活力明显降低、凋亡率升高、线 粒体膜电位降低（均P<0.01）;细胞中Bcl-2和caspase3表达降低,Bax、c-caspase3和Cyt-C表达升高（均P<0.01）。si-SNHG15与 anti-miR-153共同转染 MDA-MB-231 细胞后,可减弱 si-SNHG15 对细胞增殖、凋亡、线粒体膜电位及 Bcl-2、Bax、caspase3、 c-caspase3和Cyt-C表达的影响（均P<0.01）。结论: lncRNASNHG15可靶向调控miR-153诱导MDA-MB-231细胞凋亡,其机制 可能与调控细胞线粒体途径凋亡有关。     

LINC01936在乳腺癌中的表达及其对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭特性的影响

摘 要：［目的］ 研究LINC01936在乳腺癌中的表达及其对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。［方法］ 从UCSC XENA数据库中获取LINC01936在1 099例乳腺癌组织和292例非配对癌旁组织及112例配对样本中的表达数据。用LINC01936-pcDNA3.1或pcDNA3.1质粒转染人乳腺癌MCF-7细胞,获得过表达LINC01936的MCF-7细胞和对照 MCF-7细胞。使用cell counting kit-8(CCK-8) 细胞增殖实验测定LINC01936对MCF-7细胞增殖的影响。采用Transwell实验和细胞划痕实验测定细胞迁移和侵袭能力。通过细胞黏附实验检测黏附能力。荧光Hoechst33342染色法用于评价LINC01936对细胞凋亡的影响。Western blot和免疫荧光法用于检测NF-κB的蛋白水平。［结果］ 生物信息学分析表明,LINC01936在乳腺癌组织中低表达。CCK-8检测显示,LINC01936抑制MCF-7细胞的增殖（P<0.05）。Transwell实验及细胞划痕实验表明,转染LINC01936过表达质粒后,MCF-7细胞迁移和侵袭能力下降。细胞黏附实验表明,LINC01936减弱乳腺癌细胞的黏附能力（P<0.05）。荧光染色分析表明,LINC01936过表达促进MCF-7细胞的凋亡。Western blot和免疫荧光显示,LINC01936促进NF-κB的表达。［结论］ LINC01936可能通过促进NF-κB的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡。     

NRP-1过表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231、SK-BR-3生物学行为的影响

目的 通过上调乳腺癌细胞MDA-MB-231、SK-BR-3中NRP-1的表达,观察NRP-1对细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。方法 构建pcDNA3.1-NRP-1表达载体,脂质体介导NRP-1 表达质粒转染MDA-MB-231、SK-BR-3细胞,用G418筛选出稳定转染的乳腺癌细胞株。利用RTqPCR、Western blot法分别检测NRP-1基因mRNA及其蛋白表达;CCK-8法、AnnexinⅤ-APC/7-AAD法、Transwell小室分别检测转染细胞增殖率、凋亡率及侵袭、迁移能力。结果 成功构建pcDNA3.1- NRP-1表达载体,转染MDA-MB-231、SK-BR-3细胞并筛选稳定表达系。与对照组相比,过表达组细胞的NRP-1 mRNA及蛋白表达水平明显升高（均P<0.05）;NRP-1过表达组的细胞较对照组增殖率增加、凋亡率降低、侵袭及迁移能力增强（均P<0.05)。结论 NRP-1在乳腺癌发展、浸润、转移中起着一定的作用,它可促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡。     

lncRNA 00707 通过miR-613 调控胃癌MGC-803、SGC-7901 细胞的恶性生物学行为

[摘要] 目的:探讨长链非编码RNA 00707（lncRNA 00707）和微小RNA-613(miR-613)对胃癌细胞增殖和转移的调控作用及其相关机制。方法：收集2014 年1 月至2018 年6 月青海省人民医院肿瘤外科89 例原发性胃癌组织及癌旁组织标本以及胃癌MGC-803、SGC-790、BGC-823 细胞,采用qPCR实验检测胃癌组织和细胞系中lncRNA 00707、miR-613 的表达水平。分别建立lncRNA00707 低表达和过表达细胞模型,采用CCK-8 实验检测MGC-803、SGC-7901 细胞增殖能力,Transwell 法检测MGC-803、SGC-7901 细胞迁移和侵袭能力。用双荧光素酶基因报告实验验证lncRNA 00707 与miR-613 的靶向关系。结果：与癌旁组织相比,胃癌组织中lncRNA 00707 呈明显高表达(P<0.01),lncRNA 00707 表达水平与WHO分期呈正相关(P<0.05);与正常细胞系GES-1 相比,胃癌细胞系中lncRNA 00707 表达明显上调(P<0.05)。敲低lncRNA 00707 可明显抑制SGC-7901 细胞的增殖、侵袭和迁移能力(均P<0.05);lncRNA 00707 过表达可明显提高MGC-803 细胞的增殖和迁移能力(P<0.05)。与阴性对照组相比,lncRNA00707 过表达显著降低了miR-613 荧光素酶报告载体的荧光素酶活性,而下调MGC-803 和SCG-7901 细胞中lncRNA 00707,miR-613 的表达显著增加（均P＜0.01）。结论：lncRNA 00707 在胃癌组织和细胞系中发挥促癌效应,其可以通过抑制miR-613 而促进胃癌MGC-803 和SCG-7901细胞的增殖和转移。     

沉默CD44表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖与侵袭的影响

目的:探索乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF-7中CD44分子的表达水平差异及沉默CD44对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、侵袭和迁移的影响。方法:利用qRT-PCR及Western blot技术检测细胞中CD44基因表达水平;设计并合成CD44的siRNA片段(CD44-siRNA)转染乳腺癌细胞,利用qRT-PCR、Western blot技术检测细胞中CD44基因表达水平的变化;MTT检测MDA-MB-231细胞增殖;Transwell侵袭实验检测MDA-MB-231细胞的迁移与侵袭能力变化。结果:CD44在侵袭性乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达高于非侵袭性乳腺癌细胞MCF-7,CD44-siRNA下调了 MDA-MB-231细胞中CD44 mRNA与蛋白水平的表达,并抑制了细胞的增殖和侵袭转移能力。结论:CD44-siRNA能够下调CD44的表达,并有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖及其侵袭迁移力。     

miR-32-5p通过靶向Dickkopf相关蛋白3的表达调控乳腺癌MDA-MB-231细胞的生物学行为

目的:通过生物信息学手段筛选乳腺癌中差异表达的关键miRNA及其靶基因,干预其在乳腺癌细胞中的表达并观察对乳腺癌细胞功能的影响.方法:利用GEO数据库筛选在乳腺癌中差异表达的miRNA,ENCORI数据库验证差异miRNA的表达,以选定最显著的差异表达miRNA为研究对象;利用Starbase、miRDB和miRWal...     

不同药物麻醉的乳腺癌患者血清对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

目的:探究不同药物麻醉的乳腺癌患者血清对体外乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响。方法:收集我院2016年2月至2017年12月期间采用丙泊酚麻醉的乳腺癌患者血液样本28例，七氟醚麻醉的乳腺癌患者血液标本32例，乳腺癌术后镇痛使用曲马多的患者血液样本25例，未使用任何麻醉药的普通乳腺癌患者血液样本20例。将血清作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h后，采用流式细胞法检测细胞的凋亡率，ELISA法检测各组细胞中半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）和半胱氨酸蛋白酶8（caspase-8）的表达情况。结果:流式细胞法检测结果显示，使用丙泊酚、七氟醚麻醉和曲马多术后镇痛的患者血清均能够显著提高乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡率；ELISA结果显示，使用丙泊酚、七氟醚麻醉和曲马多术后镇痛的患者血清均能够显著提高乳腺癌MDA-MB-231细胞caspase-3的表达（P＜0.05），且各组之间无统计学差异（P＞0.05）；而使用丙泊酚和七氟醚麻醉的患者血清均能够显著提高乳腺癌MDA-MB-231细胞caspase-8的表达（P＜0.05），曲马多却未能影响乳腺癌MDA-MB-231细胞caspase-8的表达（P＞0.05），丙泊酚和七氟醚组与曲马多组对比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:使用丙泊酚、七氟醚麻醉和曲马多术后镇痛的患者血清均能够显著提高乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡率及caspase-3的表达；而使用丙泊酚和七氟醚麻醉的患者血清能够显著提高乳腺癌MDA-MB-231细胞caspase-8的表达，曲马多对乳腺癌MDA-MB-231细胞caspase-8的表达没有明显影响。     

circNEIL3 通过靶向miR-4784 调控乳腺癌MDA-MB-231 细胞的增殖、迁移和侵袭

目的：研究环状RNA nei 样DNA糖化酶3（circNEIL3）和微小RNA（miR）-4784 对乳腺癌细胞MDA-MB-231 的增殖、迁移和侵袭的影响。方法：收集2018 年1月至2019 年12月在济南市中西医结合医院经组织病理诊断为乳腺癌并行手术切除的45 例乳腺癌患者的癌组织和配对癌旁组织,qPCR 法检测乳腺癌组织、癌旁组织中circNEIL3 和miR-4784 的相对水平。将circNEIL3 的小干扰RNA（si-circNEIL3）、miR-4784 模拟物、si-circNEIL3+miR-4784 抑制物分别转染MDA-MB-231 细胞,采用CCK-8法、平板克隆实验、划痕愈合实验、Transwell 实验检测circNEIL3和miR-4784 表达对细胞活力、克隆形成、迁移和侵袭的影响。双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀（RIP）和RNA pull-down 实验检测circNEIL3和miR-4784 之间相互作用。结果：乳腺癌组织中circNEIL3呈高表达（P<0.05）,miR-4784 呈低表达（P<0.05）。干扰circNEIL3显著降低MDA-MB-231 细胞活力、克隆形成数、划痕愈合率以及侵袭数（均P<0.05）。过表达miR-4784 显著降低MDA-MB-231 细胞活力、克隆形成数、划痕愈合率以及侵袭数（均P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验、RIP 和 RNA pull-down 实验均证实circNEIL3 与miR-4784 可直接结合,干扰circNEIL3 能明显上调miR-4784表达（P<0.05）,过表达circNEIL3 能明显下调 miR-4784 表达（P<0.05）。抑制miR-4784 表达部分逆转干扰circNEIL3对MDA-MB-231 细胞活力、克隆形成、迁移和侵袭的抑制作用（P<0.05）。结论：干扰circNEIL3通过靶向上调miR-4784表达抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭。     

桔梗皂苷D诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡

目的:研究来自桔梗的天然单体化合物桔梗皂苷D(platycodin D,PD)对高转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的影响,初步探索其可能的作用机制.方法:以不同浓度(0、2.5、5、10 μmol/L)PD处理乳腺癌MDA-MB-231细胞后,采用MTT法检测细胞增殖率并计算IC50值,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达水平.结果:PD呈剂量依赖性显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖(P＜0.01),作用72 h的IC50值为(7.30±2.67) μmol/L.与对照组相比,10 μmol/L的PD可显著促进MDA-MB-231细胞的凋亡(P＜0.05).PD激活了caspase家族蛋白,上调有活性的cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9的表达,下调无活性的caspase-8和caspase-9的表达;PD同时减少Bcl-2的表达,增加Bax的表达,使Bcl-2/Bax的比值降低.研究还发现PD使突变型P53蛋白的表达减少、E2F1的表达增加.结论:PD抑制乳腺癌细胞增殖具有明显的抗肿瘤效应,而诱导凋亡的发生可能是其发挥抗肿瘤效应的机制之一.     

miR-200c 通过靶向细胞能量代谢和多种信号通路调控三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的恶性生物学行为

目的：考察miR-200c对三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）细胞MDA-MB-231的增殖、凋亡和迁移的影响及其代谢相关的分子机制。方法：以过表达miR-200c的MDA-MB-231（miR-200c-231）细胞、无过表达miR-200c的阴性对照细胞miR-NC-231及其移植瘤裸鼠模型为研究对象,qPCR检测细胞和移植瘤组织中miR-200c及其他相关基因的表达水平,免疫组化技术分析瘤组织中Ki67阳性细胞数量,Transwell小室法检测细胞的迁移能力,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Western blotting检测细胞及组织中增殖、迁移和代谢相关信号通路多种蛋白的表达,Seahorse能量代谢检测仪检测细胞的基础耗氧率（oxygen comsumpition rate,OCR）、细胞外酸度（extracellular acidification rate,ECAR）和代谢表型变化,液相质谱联用技术检测细胞中代谢产物的变化。结果：miR-200c-231细胞及其移植瘤组织中 miR-200c 表达较 miR-NC-231细胞显著增加（P<0.05或P<0.01）,miR-200c-231移植瘤质量和体积均显著下降、瘤组织中Ki67阳性细胞数明显减少（P<0.01）,miR-200c-231细胞的迁移能力下降、细胞凋亡率提高（均P<0.01）。同时伴随着ZEB1/2、Vimentin、cyclinD1的表达下调及cleaved PARP表达的提高（P<0.05或P<0.01）,STAT1/3和NF-κB的磷酸化水平降低（均P<0.05）而cAMP通路蛋白的磷酸化水平提高（P<0.05）。miR-200c-231细胞的OCR提高和ECAR降低、色氨酸2,3-加二氧酶（tryptophan-2,3-dioxygenase 2,TDO2）表达下降（P<0.05或P<0.01）,细胞内10种抗肿瘤代谢物质含量提高（P<0.05或P<0.01）。结论：miR-200c靶向TDO2调控TNBC细胞MDA-MB-231胞内抗肿瘤代谢产物水平、促使细胞代谢类型由依赖糖酵解为主向有氧呼吸类型转化,并失活STAT3和NF-κB通路而激活cAMP通路,从而影响MDA-MB-231细胞的恶性生物学行为。     

环加氧酶-2 通过调控EMT促进乳腺癌MDA-MB-231 细胞的迁移和侵袭

[摘要] 目的：探讨环加氧酶-2（COX-2）在乳腺癌转移中的作用及其可能的机制。方法：收集从2015 年10 月至2018 年4 月在云南省肿瘤医院接受乳腺切除术的患者中获得的原发乳腺癌组织和脑转移乳腺癌组织临床病理样本共45 例,其中原发30 例、脑转移15 例。采用qPCR检测COX-2 在原位乳腺癌和脑转移乳腺癌组织中的表达。将COX-2 过表达重组病毒（LV6-COX2）或敲减COX-2 重组病毒（LV3-COX2 shRNA1、LV3-COX2 shRNA2）感染人乳腺癌MDA-MB-231 细胞并获得稳转细胞株后,CCK-8法检测COX-2 表达对MDA-MB-231 细胞增殖的影响,划痕实验和Transwell 法检测对MDA-MB-231 细胞迁移和侵袭的影响。qPCR和WB实验分析各组细胞中COX-2 mRNA和蛋白的表达水平,qPCR检测COX-2 表达对MDA-MB-231 细胞内EMT相关基因表达的影响。结果：COX-2 表达水平在脑转移乳腺癌患者组织中显著高于原位乳腺癌组织（P<0.01）;并且与乳腺癌患者肿瘤TMN分期有关。成功构建稳定过表达/敲减COX-2 的MDA-MB-231 细胞株。过表达COX-2 促进MDA-MB-231 细胞的迁移和侵袭（均P<0.01）,同时显著提高MMP2、MMP1、N-cadherin 和vimentin 的表达（均P<0.01）,但对细胞增殖无明显影响;而沉默COX-2 则有相反的作用,且可促进细胞增殖（P<0.05）。结论：COX-2 在脑转移乳腺癌组织中高表达,其可能通过调控EMT过程促进乳腺癌MDA-MB-231 细胞的迁移和侵袭。     

RNA干扰对MDA-MB-231乳腺癌细胞株骨保护素基因表达的抑制作用

目的 构建针对骨保护素（OPG）基因的一个载体编码三条短发夹RNA（shRNA）的真核表达质粒,观察其对MDA—MB-231乳腺癌细胞株OPG表达的抑制作用。方法选择3个针对OPG基因的RNA干扰（RNAi）位点,分别设计合成3对编码相应shRNA的DNA单链,每对单链连接形成双链后分别与线性化载体pGenesil-1．1、pGenesil-1．2、pGenesil-1．3连接形成pGenesil-1．1-shRNAl、pGenesil-1．2-shRNA2、pGenesil-1．3-shRNA3,对以上重组载体反复酶切连接,构建成重组质pGenesil—1．1—1．2-1．3-shRNA1-shRNA2-shRNA3,酶切鉴定和测序无误后,将该质粒转染MDA—MB一231细胞,以G418加压筛选,对转染细胞行单克隆化,稳定转染细胞行RT—PCR和Westernblot检测,确定其对OPG基因表达抑制作用。统计分析采用单因素方差分析和SLD分析法。结果成功构建了pGenesil-1．1—1．2-1．3-shRNA1-shRNA2-shRNA3重组质粒;以该质粒稳定转染MDA—MB-231细胞后其OPGmRNA和蛋白表达均较对照差异有统计学意义（P〈0．05）,RNAi对OPGmRNA和蛋白的表达抑制率分别为91％和73％。结论本研究构建了针对OPG的一个载体编码3条shRNA的真核表达质粒,通过RNAi抑制了MDA—MB-231细胞OPG基因表达,为进一步深入探讨肿瘤细胞自身OPG表达在乳腺癌骨转移发生发展中的作用提供了相关实验基础。