lncRNA MALAT1通过miR-124-3p/SOX7分子轴促进视网膜血管内皮细胞增殖及迁移和血管生成

目的：探讨lncRNA MALAT1对视网膜血管内皮细胞增殖、迁移及血管生成的影响及其分子机制。

方法：qPCR检测正常对照组、糖尿病患者无视网膜病变组、糖尿病视网膜病变患者组血清中lncRNA MALAT1的表达水平以及葡萄糖培养对lncRNA MALAT1的表达水平的影响。qRT-PCR检测miR-124-3p表达水平; Western blotting检测SOX7表达水平; 双荧光素酶报告系统检测lncRNA MALAT1与miR-124-3p、miR-124-3p与SOX7的靶向作用关系; CCK-8实验检测细胞的增殖活力; Transwell实验检测细胞的迁移能力; 体外成管实验检测hRMECs血管形成能力。

结果：lncRNA MALAT1在糖尿病视网膜病变患者血清中的表达水平显著高于糖尿病患者无视网膜病变组和正常对照组(P<0.001); 体外葡萄糖培养显著促进lncRNA MALAT1在hRMECs细胞的表达,并显著促进hRMECs细胞的增殖、迁移和血管形成(均P<0.05)。敲低lncRNA MALAT1显著抑制hRMECs细胞的增殖、迁移和成管能力(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验表明,lncRNA MALAT1与miR-124-3p、miR-124-3p与SOX7之间存在靶向结合作用。过表达miR-124-3p显著抑制hRMECs细胞的增殖、迁移和成管能力(均P<0.05); 过表达lncRNA MALAT1+miR-124-3p,同时过表达miR-124-3p+SOX7,敲低lncRNA MALAT1+过表达SOX7均显著消除了过表达miR-124-3p对hRMECs细胞增殖、迁移和血管形成的抑制作用(均P<0.05)。

结论：lncRNA MALAT1通过下调miR-124-3p对SOX7的负调控作用促进糖尿病视网膜病变中视网膜内皮细胞增殖、迁移和血管形成。lncRNA MALAT1在糖尿病视网膜病变患者的异常上调可能是微血管功能障碍的潜在生物标志。     

糖尿病视网膜病变患者血清circFTO和miR-141-3p表达情况及其与病变分期的关系

目的:探讨血清circFTO、miR-141-3p水平变化与糖尿病视网膜病变患者不同疾病分期的关系。方法:选取2019-10/2022-11本院收治的198例2型糖尿病患者为研究对象,根据不同分期将患者分为非糖尿病视网膜病变(NDR)组70例、非增殖期糖尿病视网膜病变(NPDR)组66例、增殖期糖尿病视网膜病变(PDR)组62例;同期选取67例本院体检正常的志愿者作为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血清circFTO和miR-141-3p水平;采用Pearson相关性分析检验糖尿病视网膜病变患者血清circFTO、miR-141-3p与各指标间的相关性;采用多因素Logistic回归分析探讨糖尿病视网膜病变的影响因素。结果:PDR组circFTO、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)高于对照组、NDR组、NPDR组,miR-141-3p、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)低于对照组、NDR组、NPDR组(P<0.05)。NDR组、NPDR组、PDR组空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)高于对照组(均P<0.05)。PDR组病程高于NDR组和NPD...     

血清lncRNA DLX6-AS1和miR-335-3p与糖尿病视网膜病变患者微血管损伤的关系

目的：探讨血清长链非编码RNA(lncRNA)无远端同源框6反义1(DLX6-AS1)、微小RNA-335-3p(miR-335-3p)与糖尿病视网膜病变(DR)患者微血管损伤的关系。

方法：前瞻性研究。选取2019-02/2021-12我院2型糖尿病(T2DM)患者160例，根据DR分期标准，分为无DR(NDR)组69例、非增殖型DR(NPDR)组48例、增殖型DR(PDR)组43例。比较三组患者血清lncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p、血管内皮生长因子(VEGF)以及内皮细胞(ECs)、内皮祖细胞(EPCs)水平。Pearson法进行各指标相关性分析。Logistic回归模型分析影响T2DM患者发生DR的因素。

结果：NDR组、NPDR组、PDR组患者血清miR-335-3p表达水平及EPCs比例逐次减少，lncRNA DLX6-AS1、VEGF表达水平及ECs比例逐次增加(均P<0.05)。DR患者血清lncRNA DLX6-AS1与miR-335-3p负相关(r=-0.668，P<0.01)。NPDR组、PDR组血清lncRNA DLX6-AS1与miR-335-3p表达水平均呈负相关性(r=-0.647、-0.675，均P<0.01)，lncRNA DLX6-AS1与VEGF均呈正相关(r=0.619、0.630，均P<0.01)，VEGF与miR-335-3p均呈负相关(r=-0.625、-0.649，均P<0.01)； PDR组lncRNA DLX6-AS1与ECs呈正相关，与EPCs呈负相关(r=0.528、-0.594，均P<0.01)，miR-335-3p与ECs呈负相关，与EPCs均呈正相关(r=-0.554、0.586，均P<0.01)。多因素回归分析显示，lncRNA DLX6-AS1(OR=2.484，95%CI：1.366～4.516)、miR-335-3p(OR=2.171，95%CI：1.218～3.871、VEGF(OR=1.603，95%CI：1.115～2.304)是T2DM患者发生DR的危险因素(均P<0.05)。

结论：DR患者血清中lncRNA DLX6-AS1表达上调，miR-335-3p表达下调，lncRNA DLX6-AS1与miR-335-3p呈负相关，二者异常表达均与DR患者微血管损伤有关。     

miR-101-3p靶向TGFβR1/Smad抑制视网膜母细胞瘤细胞侵袭和迁移

目的　探索miR-101-3p对视网膜母细胞瘤细胞侵袭和迁移的影响及作用机制。方法　RT-PCR检测miR-101-3p及转化生长因子β受体1（transforming growth factor beta receptor 1，TGFβR1）表达水平；生物信息学预测miR-101-3p与TGFβR1的靶向关系并通过荧光素酶报告实验进行验证。将Y79细胞分为Control组、miR-101-3p mimic组（转染miR-101-3p mimic）、pcDNA-TGFβR1组（转染pc-TGFβR1）及miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组（共转染miR-101-3p mimic和pc-TGFβR1），MTT检测细胞增殖速率，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell实验检测细胞侵袭，划痕实验检测细胞迁移，Western blot检测TGFβR1、Ki67、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-9、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-2、MMP-9、血管内皮生长因子、p-Smad2及p-Smad3的表达水平。结果　在视网膜母细胞瘤组织中,miR-101-3p的表达为0.35±0.05，明显低于正常视网膜组织（P<0.01）；视网膜母细胞瘤细胞株Y79中miR-101-3p的表达为0.24±0.04，明显低于视网膜上皮细胞株ARPE-19（P<0.01）；与Control组相比，miR-101-3p mimic组miR-101-3p mRNA水平显著升高、TGFβR1 mRNA水平显著降低（均为P<0.01）；miR-101-3p与TGFβR1之间存在连续结合片段。与Control组相比，miR-101-3p mimic组TGFβR1的表达水平显著降低，增殖速率及细胞中Ki67表达均显著降低，细胞凋亡率显著增加，Bax及cleaved Caspase-9表达显著升高、Bcl-2表达显著降低，侵袭细胞数目和划痕闭合率显著降低，MMP-2、MMP-9、血管内皮生长因子、TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表达水平显著降低（均为P<0.01）。结论　miR-101-3p通过靶向下调TGFβR1抑制视网膜母细胞瘤细胞的侵袭和迁移。     

miR-223-3p调控NLRP3炎症小体对自身免疫性葡萄膜炎大鼠M1/M2巨噬细胞极化平衡的影响

目的 探讨miR-223-3p调控NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体的表达水平对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠M1/M2巨噬细胞极化平衡的影响。方法 首先构建双荧光素酶报告质粒载体,并验证miR-223-3p对NLRP3基因表达的调控作用。然后将48只健康Lewis雌性大鼠随机分为正常对照(NC)组、EAU组和miR-223-3p慢病毒组,每组16只。EAU组和miR-223-3p慢病毒组大鼠首先用光感受器间维生素A结合蛋白(IRBP)乳糜液诱导EAU模型,同时miR-223-3p慢病毒组每只大鼠双眼玻璃体内注射8μL携带miR-223-3p的慢病毒,造模12 d后麻醉处死大鼠,分离各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织。实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中miR-223-3p、NLRP3、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arg-1)的基因表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素10(IL-10)以及NLRP3的蛋白表达水平;流式细胞仪检测各组大鼠眼...     

miR-22-3p对蓝光暴露下大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

目的　探讨miR-22-3p对蓝光暴露下的大鼠视网膜神经节细胞（RGC）的保护作用及机制。方法　取36只清洁级SD大鼠, 将12只SD大鼠随机分为2组:对照组与蓝光暴露组,每组6只。对照组采用正常的12 h明暗循环饲养;蓝光暴露组大鼠先进行暗适应24 h,随后采用复方托吡卡胺散瞳,将大鼠暴露在蓝光（光照强度1500 lux）下2 h;另取24只大鼠随机分为4组:对照组、蓝光暴露组、AAV-miR22组、AAV-miR22&PTEN组,每组6只。对照组采用正常的12 h明暗循环饲养,其余3组均接受蓝光暴露处理,AAV-miR22组注射1 μL含 2.5×10⁹ vg(基因组拷贝数)的AAV-7m8-miR-22-3p,AAV-miR22&PTEN组注射1 μL含2.5×10⁹ vg的AAV-7m8-miR-22-3p&PTEN,对照组与蓝光暴露组向大鼠玻璃体内注射1 μL生理盐水,注射结束使用氧氟沙星眼膏预防感染。取大鼠眼球组织行HE染色,在光学显微镜下观察检测神经节细胞层（GCL）、GCL至外核层 (ONL)的厚度,其中包含有内丛状层（IPL）、内核层(INL)、外丛状层（OPL）;采用NeuN免疫荧光组织化学染色标记RGC,计数视网膜上NeuN标记的阳性细胞数;TUNEL染色检测细胞凋亡;采用Lipofectamine 2000转染试剂盒转染阴性对照、miR-22-3p mimic、miR-22-3p inhibitor至RGC-5细胞,转染48 h后测定miR-22-3p表达量,转染成功即可采用Western blot检测PTEN蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR检测miR-22-3p表达,Western blot检测PTEN、p-Akt、Akt与Nrf2蛋白表达情况;双荧光素酶报告实验在酶标仪上测定荧光素酶活性。结果　HE染色结果证实:与对照组相比,蓝光暴露组大鼠视网膜组织萎缩,视网膜GCL、GCL至ONL厚度变薄（P<0.05）。另外,NeuN免疫荧光组织化学染色发现:与对照组相比,蓝光暴露组大鼠视网膜组织RGC数减少（P<0.05）。实时荧光定量PCR实验结果显示:与对照组相比,蓝光暴露组大鼠视网膜组织内miR-22-3p相对表达量降低（P<0.05）。Western blot检测结果显示:与对照组相比,蓝光暴露组大鼠视网膜组织内PTEN蛋白的表达水平升高,Nrf2蛋白的表达水平和p-Akt/Akt蛋白表达比值均降低（均为P<0.05）;miR-22-3p能够负向调控PTEN蛋白在RGC内的表达水平（P<0.05）。HE染色结果显示:过表达miR-22-3p能够缓解蓝光诱导的大鼠视网膜萎缩,并且能够提高大鼠视网膜GCL、GCL至ONL厚度。NeuN免疫荧光组织化学染色结果证实:过表达miR-22-3p能够通过靶向抑制PTEN表达提高蓝光暴露大鼠视网膜上RGC数。TUNEL实验结果证实:miR-22-3p能够通过抑制PTEN表达缓解蓝光诱导的大鼠视网膜RGC凋亡。结论　miR-22-3p能够通过靶向抑制PTEN的表达,激活PI3K/Akt/Nrf2通路,缓解蓝光诱导的大鼠RGC凋亡。     

miR-17-5p对小梁网细胞外基质蛋白表达的调控作用及其机制

目的　探讨miR-17-5p对小梁网细胞外基质（ECM）蛋白表达的调控作用及其机制。方法　收集原发性开角型青光眼（POAG）患者和正常小梁网组织,利用RT-PCR和Western blot分别检测miR-17-5p和Smad3表达;将人小梁网细胞（HTMCs）分为miR-17-5p mimics和miR-17-5p NC组,分别转染载有miR-17-5p mimics组和miR-17-5p NC的载体,Western blot检测HTMCs中ECM蛋白纤连蛋白（FN）、胶原蛋白I（CoL-I）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达;靶基因预测库预测miR-17-5p靶基因,荧光素酶报告载体联合Western blot鉴定靶基因。HTMCs中共转染miR-17-5p mimics和Smad3过表达载体,Western blot检测各转染组细胞中Smad3、FN、CoL-I、α-SMA的蛋白表达。结果　正常小梁网组织中miR-17-5p表达量为1.16±0.11,高于POAG小梁网组织的0.19±0.04,差异有统计学意义（t=10.641,P<0.001）;正常小梁网组织中Smad3蛋白表达量为0.31±0.06,低于POAG小梁网组织的0.86±0.07,差异有统计学意义（t=8.105,P<0.001）。miR-17-5p mimics组HTMCs中FN、CoL-I和α-SMA蛋白表达均低于miR-17-5p NC组,差异均有统计学意义（均为P<0.001）;靶基因预测库预测及荧光素酶报告载体联合Western blot鉴定证实Smad3为miR-17-5p下游靶基因;miR-17-5p+Smad3转染组HTMCs中Smad3、FN、CoL-I和α-SMA蛋白表达均高于miR-17-5p+vector转染组,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。结论　miR-17-5p 能抑制HTMCs的ECM蛋白表达,这一过程可能是通过靶向抑制Smad3表达而实现的。     

血清和玻璃体中miR-126和miR-325与增生性玻璃体视网膜病变严重程度的关系

目的：探讨血清和玻璃体中miR-126和miR-325与增生性玻璃体视网膜病变(PVR)严重程度的关系。

方法：回顾性研究。选取2019-10/2022-10在本院治疗的PVR患者100例100眼。按照视网膜病变程度分为轻度组42眼和重度组58眼。选取同期因眼外伤在本院进行玻璃体切除术无视网膜病变的患者30例30眼为对照组。采用荧光定量PCR检测血清和玻璃体中miR-126和miR-325表达水平； ELISA检测血清、玻璃体中转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平； Pearson法分析血清和玻璃体中miR-126和miR-325水平与TGF-β、PDGF、VEGF、TNF-α水平的相关性； 采用Logistic多因素分析影响发生重度PVR的因素。

结果：PVR患者血清和玻璃体中miR-126水平较对照组降低，且重度组低于轻度组(均P<0.05)； miR-325水平较对照组升高，且重度组高于轻度组(均P<0.05)。重度组患者血清和玻璃体中TGF-β、PDGF、VEGF、TNF-α水平较轻度组均上升(均P<0.05)。PVR患者血清和玻璃体中miR-126水平与miR-325、TGF-β、VEGF、TNF-α、PDGF水平均呈负相关(均P<0.05)，miR-325与TGF-β、VEGF、TNF-α、PDGF水平均呈正相关(均P<0.05)。Logistic回归分析显示，血清和玻璃体中miR-325、TGF-β、PDGF、TNF-α均是发生重度PVR的危险因素，miR-126是保护因素(P<0.05)。

结论：随PVR疾病的加重，患者血清和玻璃体中miR-126表达降低，miR-325表达升高，且与TGF-β、TNF-α、VEGF、PDGF具有相关性。     

miR-223-3p靶向调控Rbpj转录因子对葡萄膜炎大鼠Th1和Th17细胞分化的影响

目的:探讨miR-223-3p对Notch信号通路转录因子Rbpj表达的调控作用以及对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠Th1、Th17细胞分化水平的影响。方法:用双荧光素酶表达报告系统探讨miR-223-3p对Rbpj基因表达的调控作用。将24只雌性Lewis大鼠随机分为EAU模型组、正常对照组(NC组)和空白对照组(BC组),每组8只。EAU模型组注射含光感受器间维生素A结合蛋白(IRBP)、结核菌素和完全弗氏佐剂的乳糜液以诱导葡萄膜炎,BC组注射等体积的不含IRBP多肽的乳糜液,NC组注射等体积的无菌生理盐水。免疫后12d,无菌分离三组大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织,实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测miR-223-3p和Rbpj基因的表达水平;酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测Rbpj、IFN-γ、IL-17蛋白的表达水平;流式细胞仪检测三组大鼠不同组织中Th1和Th17细胞的表达水平。结果:双荧光素酶检测结果证实Rbpj是miR-223-3p调控的靶基因。免疫后12d,相比于NC组,EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中miR-223-3p相对表达水平分别为0.33±0...     

人翼状胬肉中miR-486-3p的表达及其潜在靶基因的生物信息学分析

目的：通过检测人翼状胬肉组织及正常结膜组织中miR-486-3p的表达情况,探寻其在翼状胬肉发生发展中可能的作用机制。

方法：于2018-09/2019-12收集原发性翼状胬肉患者69例69眼,收集术中切除的翼状胬肉组织和术眼正常结膜组织,采用RT-PCR定量检测标本中miR-486-3p的相对表达量,并利用 Targetscan数据库、miWalk3.0数据库、miRDB数据库对miR-486-3p进行靶基因预测后将得到的潜在靶基因取交集; 采用DAVID数据库对miR-486-3p潜在靶基因进行功能和通路富集分析; 采用String网站对miR-486-3p潜在靶基因进行互作分析。

结果：miR-486-3p在翼状胬肉组织中的相对表达量\〖(6.183±1.366)×10^-6\〗与正常结膜组织的相对表达量\〖(7.930±1.394)×10^-5\〗有显著差异(P<0.0001)。通过对其靶基因预测及生物信息学分析发现miR-486-3p潜在靶基因436个,其生物学功能主要富集于对RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的调控、囊泡介导的转运和转录调控、DNA依赖性RNA代谢过程的调控。KEGG通路主要富集于神经轴突导向(Axon guidance)通路及溶酶体通路上,其中Axon guidance通路可能对翼状胬肉的发生发展起着重要的调控作用。PPI网络分析进一步表明Axon guidance通路中的关键基因ABL1、PLXNA1对翼状胬肉具有重要作用。

结论：miR-486-3p可能通过SLIT(神经导向因子Slit)/Robo(回旋引导受体)和SEMA3A(神经导向因子Semaphorin 3A)/PLXNA1(丛蛋白受体 A1)等Axon guidance通路致翼状胬肉的新生血管异常,从而参与翼状胬肉的发生、发展。     

Inhibition of miR-665-3p Enhances Autophagy and Alleviates Inflammation in Fusarium solani-Induced Keratitis

PurposeAccumulated evidence has shown that microRNAs (miRNAs) are closely related with the regulation of autophagy, which plays vital roles in fungal keratitis (FK). Microarray data showed elevated expression of miR-665-3p in mouse corneal tissues after infection with Fusarium solani (F. solani). Here, we investigated the effect of miR-665-3p in regulating autophagy in experimental F. solani keratitis and determined the potential molecular mechanisms involved.MethodsIn this article, we established an in vivo mouse model of FK and an in vitro model of corneal stromal cells by inoculating with F. solani. We divided them into the following six groups: control, chloroquine (CQ), rapamycin (Rapa), miR-665-3p antagomir (ant-665), miR-665-3p agomir (miR-665), and the negative control group (miR-NC). The levels of autophagy were detected by electron microscopy, Western blotting, and immunofluorescence. Then, we used a dual-luciferase reporter assay to determine the binding of miR-665-3p to the autophagy-related gene (ATG)5 3''UTR. Detection of IL-1β protein levels and hematoxylin and eosin (H&E) staining of corneal tissues were used to observe the effect of miR-665-3p on inflammation in FK.ResultsHere, we showed that inhibition of miR-665-3p expression in FK upregulated autophagy and alleviated inflammation. Nevertheless, the opposite results were found by overexpressing miR-665-3p. Additionally, ATG5 was a direct target gene for miR-665-3p.ConclusionsTogether, our data demonstrated that miR-665-3p might be involved in F. solani keratitis of mice by regulating autophagic pathways and inflammation.     

circ_0000144靶向miR-502-5p调控人视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖和凋亡及迁移侵袭

目的：探讨环状RNA(circRNA)circ_0000144是否靶向微小RNA(miRNA)-502-5p调控人视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡、迁移侵袭。

方法：将Y79细胞分为si-NC组(转染si-NC)、si-circ_0000144组(转染si-circ_0000144)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-502-5p组(转染miR-502-5p mimic)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-circ_0000144组(转染pcDNA-circ_0000144)、si-circ_0000144+anti-miR-NC组(转染si-circ_0000144+anti-miR-NC)、si-circ_0000144+anti-miR-502-5p组(转染si-circ_0000144+anti-miR-502-5p)。实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测视网膜母细胞瘤组织和细胞中circ_0000144和miR-502-5p表达,溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)检测细胞增殖,免疫印迹实验(western blot)测定细胞核相关抗原Ki-67(Ki-67)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达,流式细胞术分析细胞凋亡,Transwell测定细胞迁移、侵袭。生物信息学预测与双荧光素酶报告实验分析circ_0000144是否靶向miR-502-5p。

结果：31例视网膜母细胞瘤组织中circ_0000144表达量比瘤旁组织高,miR-502-5p表达量比瘤旁组织低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-circ_0000144组Y79细胞中circ_0000144表达量、OD值、Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达量、迁移、侵袭细胞数减少,Bax蛋白表达量、凋亡率增加(P<0.05)。circ_0000144靶向负调控miR-502-5p的表达。miR-502-5p组较miR-NC组增加Y79细胞凋亡率、Bax蛋白表达量,减少OD值、迁移及侵袭细胞数、Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达量(P<0.05)。与si-circ_0000144+anti-miR-NC组比较,si-circ_0000144+anti-miR-502-5p组Y79细胞凋亡率、Bax蛋白表达量降低,OD值、迁移及侵袭细胞数、Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达量升高。

结论：视网膜母细胞瘤组织中circ_0000144高表达,通过负调控miR-502-5p抑制其表达降低视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、迁移侵袭,促进凋亡。