白木香乙酰乙酰基辅酶A硫解酶基因(AsAACT)的克隆与表达分析

目的：对国产沉香的基原植物白木香Aquilaria sinensis （Lour.）Gilg乙酰辅酶A酰基转移酶（acetyl-CoA C-acetyl transferase,AACT）基因AsAACT全长进行克隆并展开生物信息学分析和表达分析,为解析沉香萜类次生代谢产物的生物合成机制奠定基础。方法：根据获得的白木香转录组数据库AACT部分转录本序列设计引物,采用RT-PCR及RACE技术,以白木香茎cDNA为模板,克隆获得AsAACT全长,进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR,以GADPH为内参,分析白木香愈伤组织受不同伤害胁迫AsAACT的表达模式。结果：AsAACT开放阅读框（opening reading frame,ORF）为1 236 bp,编码411个氨基酸残基,酶命名为AsAACT;白木香愈伤受物理伤害（切割）后表达量没有明显变化,但受化学伤害（MeJA）后4 h表达量升高了5.5倍,说明该基因对MeJA诱导的化学伤害较敏感,且能够在早期响应伤害胁迫。结论：通过AsAACT基因的全长cDNA克隆和表达特性分析,为后续深入研究其在沉香倍半萜合成途径的功能奠定基础。     

白木香查尔酮合酶(AsCHS1)基因的克隆和生物信息学分析

目的:对国产沉香的源植物白木香Aquilaria sinensis查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因AsCHS1编码区进行克隆,并对其进行生物信息学分析和表达分析.方法:根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有查尔酮合酶保守结构域的CHS基因序列,采用RT-PCR技术,以不同伤害时间白木香木质部混合样品总RNA为模板克隆得到白木香AsCHS1的基因编码区序列,并对AsCHS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析.另外,采用qRT-PCR方法,以组蛋白(histones)为内参对AsCHS1基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析.结果:序列分析表明,所克隆的AsCHS1基因编码区开放阅读框(opening reading frame,ORF)长为1 194bp,编码397个氨基酸残基,命名为AsCHS1.qRT-PCR实验证明该基因表达量在伤害后12h最大,说明该基因能够在早期响应伤害胁迫.结论:白木香AsCHS1基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究AsCHS1蛋白在白木香中黄酮合成途径中的功能及表达调控奠定基础.     

白木香查尔酮合酶基因的克隆和生物信息学分析

目的:对国产沉香的源植物白木香Aquilaria sinensis查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因AsCHS1编码区进行克隆,并对其进行生物信息学分析和表达分析。方法:根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有查尔酮合酶保守结构域的CHS基因序列,采用RT-PCR技术,以不同伤害时间白木香木质部混合样品总RNA为模板克隆得到白木香AsCHS1的基因编码区序列,并对AsCHS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。另外,采用qRT-PCR方法,以组蛋白(histones)为内参对AsCHS1基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析。结果:序列分析表明,所克隆的AsCHS1基因编码区开放阅读框(opening reading frame,ORF)长为1 194 bp,编码397个氨基酸残基,命名为AsCHS1。qRT-PCR实验证明该基因表达量在伤害后12 h最大,说明该基因能够在早期响应伤害胁迫。结论:白木香AsCHS1基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究AsCHS1蛋白在白木香中黄酮合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

红白忍冬SABATH甲基转移酶基因克隆及其生物信息学分析

目的: 克隆红白忍冬SABATH甲基转移酶基因(rLjSABATHMT),比较忍冬和红白忍冬SABATH甲基转移酶同源基因表达量和基因内含子序列的差异,为金银花的活性成分形成及调控机制研究提供基础。方法: 根据cDNA文库提供的基因片段设计特异性引物,从红白忍冬中克隆获得rLjSABATHMT基因cDNA序列及基因组序列。通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,使用MEGA 5.0构建SABATH甲基转移酶系统进化树,利用RT-PCR分析SABATHMT同源基因在忍冬与红白忍冬的不同器官、不同花期的表达量,对忍冬和红白忍冬SABATHMT同源基因内含子区序列进行分析和比较。结果: 克隆获得的rLjSABATHMT基因cDNA序列全长为1 251 bp,具有完整编码框,编码365个氨基酸。该基因蛋白序列具有保守的SABATHMT结构域,系统进化树结果表明它可能是水杨酸/安息酸甲基转移酶。基因表达分析结果表明SABATHMT同源基因主要在花中表达。忍冬和红白忍冬SABATHMT同源基因内含子区序列具有丰富的多态性,且有2个SNP为红白忍冬的特有基因型;内含子区motif元件中碱基变异在2个同源基因间具有显著差异。结论: SABATHMT同源基因内含子区变异可能导致了忍冬和红白忍冬SABATH甲基转移酶表达差异,为金银花活性成分调控机制研究提供了重要研究基础。     

白木香法呢基焦磷合酶基因AsFPS1的克隆及表达分析

法呢基焦磷酸合酶(FPS) 是倍半萜代谢途径中的关键限速酶之一.本研究在454高通量测序已获得的cDNA序列基础上,PCR扩增其开放阅读框并测序验证;提取三年生白木香根、茎、叶的总RNA及健康和伤害处理的愈伤组织的总RNA,以反转录成的单链cDNA为模板进行荧光定量PCR,检测AsFPS1基因的组织表达特异性及对伤害处理的反应.结果表明,扩增到的AsFPS1基因全长1 342 bp,开放阅读框1 029 bp,编码342个氨基酸.组织表达分析的结果显示,AsFPS1基因主要在根和茎中表达,叶中的表达量较低;该基因同时受物理伤害和结香液处理的诱导,分别在6,12 h达到最高表达水平.通过AsFPS1基因全长cDNA的克隆和表达分析,为后续研究其生物功能及沉香倍半萜合成机制奠定了基础.     

滇重楼鲨烯合酶基因PpSQS的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆滇重楼鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)基因(PpSQS),对该基因进行序列分析及原核表达。 方法: 采用同源克隆和RACE技术获得PpSQS的cDNA,并对其进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET-30b(+)-PpSQS,在大肠杆菌Escherich coli BL21(DE3)中进行诱导表达。 结果: PpSQS基因cDNA全长1 498 bp,包含1个1 212 bp的开放阅读框(ORF),可编码403个氨基酸;PpSQS理论标准分子质量为46.36 kDa,等电点为pI 6.83;SDS-PAGE分析表明,经1 mmol·L^-1 IPTG诱导后,重组PpSQS蛋白在大肠杆菌中获得表达。 结论: 首次获得了滇重楼PpSQS基因cDNA全长序列,该基因编码产物具有植物SQS同源蛋白的典型特征,实现重组PpSQS在大肠杆菌中的表达。     

白木香转录因子AsNAC2的克隆及表达分析

目的 对珍稀南药沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis As NAC2转录因子进行分子克隆,并对其进行生物信息学和表达模式分析。方法 以白木香茎的总RNA反转录的c DNA为模板,采用PCR技术获取基因编码序列（coding sequence,CDS）全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等特性;运用DNAMAN8.0和MEGA6.0等软件分别进行多序列比对和进化关系分析;利用qRT-PCR技术检测AsNAC2基因在不同组织和伤害胁迫下的表达特性。结果克隆获得AsNAC2基因（GenBank注册号MT130201）,开放阅读框（openreadingframe,ORF）全长864bp,编码1条由287个氨基酸组成的弱酸性的稳定的亲水性蛋白,该蛋白定位在细胞核中,不存在跨膜结构域。序列比对和系统进化树分析显示,As NAC2蛋白N端具有典型的NAM结构域,与锦葵目中的可可、哥伦比亚锦葵和榴莲NAC 2-like蛋白亲缘关系近,属于NAC转录因子家族中的ATAF亚组。qRT-PCR结果显示,AsNAC2基因主要在健康白木香的根和茎中表达,全断干伤害可...     

白木香AsNINJA1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的茉莉酸甲酯诱导表达

目的 克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis互作蛋白(jasmonate Zim-domain,JAZ)基因(NINJA),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法 以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆白木香NINJA基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qRT-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)处理的白木香愈伤组织中AsNINJA1基因的表达模式。结果 获得白木香NINJA基因全长cDNA,命名为AsNINJA1。序列分析表明,该基因的序列全长为1 982 bp,包含一个1 221 bp的开放阅读框,编码406个氨基酸,蛋白质相对分子质量为43 697,等电点为6.02。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理4 h后AsNINJA1基因相对表达量最高,是对照(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的近100倍,随后显著下降。结论 获得AsNINJA1基因全长cDNA序列,该基因对MeJA诱导极为敏感,且能在伤害早期响应。     

铁皮石斛HSP70基因的克隆及冷胁迫表达分析

目的: 揭示铁皮石斛热激蛋白HSP70基因冷胁迫表达,为耐低温品系选育提供分子生物学基础。 方法: 根据已获得的HSP70基因片段序列,采用RACE方法从铁皮石斛中克隆到HSP70基因全长cDNA序列。预测其编码蛋白的结构与功能,并运用实时定量PCR进行冷胁迫下表达分析。 结果: 核苷酸序列分析表明该基因全长2 296 bp,包含一完整的1 944 bp的开放阅读框,编码647个氨基酸。氨基酸序列具有典型的HSP70特征并且与其他植物的HSP70有很高的同源性。冷胁迫表达分析说明该基因确实能被低温诱导表达。 结论: 首次克隆获得受低温诱导表达的铁皮石斛HSP70基因,为进一步研究铁皮石斛健康栽培与抗寒品系的选育奠定基础。     

白木香JAZ1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的伤害诱导表达分析

目的克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis茉莉酸(JA)信号途径核心抑制蛋白基因(jasmonate-zim-domain protein,JAZ),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆JAZ基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qR T-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)和机械伤害处理的白木香愈伤组织中JAZ基因的表达模式。结果获得白木香JAZ基因全长cDNA,命名为AsJAZ1,GenBank登录号为KP677281。序列分析表明,该基因的序列全长为1507 bp,包含一个990 bp的开放阅读框,编码330个氨基酸,蛋白质相对分子质量为34280,等电点为6.89。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理0.5 h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的27倍,随后显著下降;经机械处理2h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经机械处理的白木香愈伤组织)的17倍,随后又快速降低,到24h基本恢复正常。结论获得AsJAZ1基因全长cDNA序列,该基因对伤害诱导极敏感,且能在伤害早期响应。     

菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT基因的克隆和表达分析

根据菘蓝转录组数据,克隆了菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT的全长cDNA并进行生物信息学分析,进一步利用实时荧光定量PCR技术分析了IiHCT基因的表达模式。IiHCT ORF为1290 bp,编码430个氨基酸,等电点为5.77,相对分子质量为47.68 kDa。IiHCT主要在菘蓝茎中表达,幼根、叶、花蕾中几乎不表达。同时发现离体菘蓝毛状根中可以检测到IiHCT的表达,外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,IiHCT相对表达量明显增加,在4 h达到原先的4.3倍。研究首次从菘蓝中克隆得到HCT基因,为进一步解析菘蓝苯丙素类成分的生物合成途径奠定基础。     

丹参类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)基因全长克隆及其生物信息学分析

根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆类贝壳杉烯氧化酶(Sm KOL)全长c DNA,并进行生物信息学分析;采用实时定量PCR检测茉莉酸甲酯(Me JA)诱导丹参毛状根不同时期的Sm KOL表达水平。克隆得到的Sm KOL全长c DNA由1 884个核苷酸组成,具有完整编码框,编码519个氨基酸,蛋白相对分子质量约为58.88 k Da,等电点p I 7.62;实时定量PCR结果表明该基因受Me JA诱导后,表达水平在36 h时达到最大值。从丹参毛状根中克隆得到1条Sm KOL全长c DNA,为进一步研究该基因的功能和丹参次生代谢调控机制提供了靶基因。     

丹参转录因子SmbHLH1基因的克隆和表达分析

目的:获得丹参转录因子SmbHLH1全长基因,分析SmbHLH1基因在丹参不同组织部位,以及不同诱导子处理后的表达差异.方法:利用RT-PCR等技术获得SmbHLH1基因全长,利用半定量RT-PCR,分析SmbHLH1基因在丹参不同部位的表达情况,及在不同处理条件下的表达情况.结果:获得的SmbHLH1基因由999个核苷酸组成,编码332个氨基酸,蛋白相对分子质量约36 kDa;半定量RT-PCR检测,该基因在丹参的根中表达量最高,其次是茎,在叶和花中有微量表达;茉莉酸甲酯,以及酵母提取物和Ag+共同诱导,会抑制该基因的表达,水杨酸和脱落酸对该基因的影响不大.结论:丹参SmbHLH1基因是bHLH家族新成员,其功能可能与油菜素内酯信号途径有关.     

菘蓝中肉桂酸-4-羟基化酶基因克隆与表达分析

目的克隆菘蓝中肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)基因,并进行生物信息学和表达分析。方法采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆C4H基因全长c DNA序列,进而获得其基因组DNA序列。通过RT-PCR法检测C4H蛋白在不同器官中及受到相应刺激因素下的表达情况。结果菘蓝C4H基因全长c DNA为1 674 bp(Gen Bank登录号:GU014562),包含一个1 530bp的开放阅读框(ORF),编码509个氨基酸残基。对应的基因组分析表明,C4H基因含2个内含子,3个外显子。在根、茎、叶各器官中均有表达,其中根中最多。胁迫因素紫外照射(UV-B)、茉莉酸甲酯(Me JA)、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)在一定程度上能够诱导C4H的表达上调。结论首次从菘蓝植物中克隆得到C4H基因的c DNA全长序列,并证实其在根中表达量最高,且在胁迫因素下表达量上调,为进一步研究菘蓝中抗病毒活性成分木质素类成分的次生代谢工程奠定基础。     

当归4-香豆酸辅酶A连接酶基因克隆与组织表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate coenzyme A ligase,4CL)为高等植物苯丙烷代谢途径关键酶之一,在当归阿魏酸的生物合成中起调控作用。研究利用同源克隆结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆当归4CL编码基因全长cDNA序列,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析4CL基因在当归幼苗生长过程中根、茎、叶组织中的表达特征。结果表明,获得的4CL cDNA序列(在GenBank已注册,登录号为KT880508) 全长1 815 bp,含有1个1 632 bp 的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码544个氨基酸的多肽链。4CL基因在当归幼苗不同生长阶段的根、茎、叶组织中均有表达,随着苗龄增大,茎、叶中的相对表达量显著增加(P<0.05),而根中表达量变化不大,表明4CL基因在当归幼苗中的表达具有明显的时空性。该研究为进一步研究4CL基因的结构与功能,解析当归阿魏酸的合成代谢机制和时空调控的分子基础奠定了工作基础。