骨骼肌高表达质粒VR／TPO在CHO细胞中瞬时表达及动物实验

目的：构建肌肉高表达质粒ＶＲ／ＴＰＯ,将其在体外定量表达,并初步了解其体内表达活性。方法;以重组ＴＰＯ ＣＤＮＡ为目的基因,构建人ＶＲ／ＴＰ炕效表达质粒,用脂质体法将共转染ＣＨＯ细胞,ＲＴ－ＰＣＲ法检测ＭＲＮＡ表达,ＥＬＩＳ 表达量,并不入体内了解其对巨核各级造血的影响。结果：ＶＲ／ＴＰＯ可在ＣＨＯ中高效表达,其在表量超过ＰＣＤＮＡ３ＴＰＯ,并初步发现有促进血小板增加作用。结论：ＶＲ／ＴＰＯ为一高     

截短血小板生成素cDNA在中华仓鼠卵巢细胞中的表达

目的：将具有全长血小板生成素（TPO）活性的N端截短血小板生成素cDNA(T184)作为目的基因,在中华仓鼠卵巢细胞（CHO）中成功表达,方法：将N端截短血小板生成素cDNA克隆入以二氢叶酸还原酶（DHFR）为筛选扩增基因的pDC-B真核表达载体,通过不断提高MTX浓度,促进N端截短血小板生成素在CHO细胞中的表达。结果：构建了N端截短血小板生成素cDNA的真核表达质粒,并能在CHO细胞中高效表达,结论：N端截短血小板生成素cDNA在CHO细胞中成功表达,其产物具有全长TPO的活性。     

人可溶性转化生长因子βⅡ型受体真核表达载体的构建及表达

目的:构建人转化生长因子βⅡ型受体胞外区(sTGFβRⅡ)基因的真核表达载体,转染真核细胞CHO以表达sTGFβRⅡ蛋白,并检测其生物学活性.方法:以TGFβRⅡ的重组质粒为模板,用PCR方法扩增得到人TGFβRⅡ胞外区(1-159位氨基酸)的cDNA,将该cDNA重组到真核表达载体pCDNA3.1/myc-his(-)B(pCDNA)的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点上,构建成pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒.经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染CHO细胞,用Western blotting法检测sTGFβRⅡ的表达,并测定其生物学活性.结果:CHO细胞转染pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒后,其培养上清经 Western blotting分析,显示有特异性的蛋白条带,所表达的蛋白能明显抑制TGFβ1对貂肺上皮细胞的增殖抑制作用.结论:成功克隆了sTGFβRⅡ基因,并获得有生物学活性的sTGFβRⅡ蛋白.     

TPO在COH/dhfr-中的表达及生物活性测定

目的：研究获得高效表达重组蛋白TPO-His的哺乳动物表达系统稳定细胞株。方法：采用overlap PCR拼接得到带有TPO信号肽的TPO N-端功能区序列;构建重组表达载体pCDNA3.1-TPO-His,然后将其与pSV2-dhfr载体磷酸钙法共转哺乳动物表达系统细胞系COH/dhfr-,经过G418、MTX及条件培养基多重压力筛选得到高效表达重组蛋白TPO-His的稳定细胞株;通过采用GIEMSA法检测TPO刺激UT-7/EPO-Mpl细胞的分化作用来测试重组蛋白TPO-His的生物活性。结果：经过多重压力筛选获得高效稳定分泌表达目的蛋白的细胞株CHO（dhfr-）/pCDNA3.1-TPO-His,其表达量可达2.8μg/106cells/24h,纯化蛋白具有较高的生物活性。结论：研究获得具有高效分泌表达目的蛋白的稳定细胞株,其表达产物TPO-His具有较高的生物学活性。     

稳定表达PAcGFP1-Golgi质粒的中国仓鼠卵巢细胞株的构建

目的:将质粒PAcGFP1-Golgi转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)并进行筛选纯化,得到单一克隆细胞株,从而构建能很好显示高尔基体形态、分布和功能的新模型。方法:将质粒PAcGFP1-Golgi以脂质体法转染CHO细胞,稳定后用G418筛选、平板稀释法克隆细胞;克隆完成后以激光共聚焦显微镜观察高尔基体形态及分布,动态监测荧光表达率,MTT法检测细胞增殖活性。结果:成功获得稳定表达质粒PAcGFP1-Golgi的CHO细胞株,激光共聚焦显微镜下高尔基体显示清晰,荧光表达率高达(99.31±0.26)%且表达稳定,细胞增殖活性与空白CHO细胞无异。结论:稳定表达PAcGFP1-Golgi质粒的CHO细胞株构建成功,为进一步研究高尔基体、COG复合体及其与遗传性糖基化障碍疾病之间的关系打下基础。     

多聚组氨酸标签的Attacin抗菌肽基因克隆及其在CHO细胞中稳定表达

目的 克隆家蝇幼虫抗菌肽Attacin-His_6融合基因,构建真核表达载体并转染CHO细胞表达,为深入研究其生物学活性创造条件.方法 以pUCm-T/Attacin载体为模板,用含6×His标签序列的下游引物克隆Attacin-His_6融合基因,并将其构建于pcDNA3.1( )中,pcDNA3.1/Attacin-His_6重组质粒转染CHO细胞,Zeocin G418筛选阳性细胞株,RT-PCR检测重组质粒在CHO细胞的转录情况.结果 成功扩增出Attacin-His_6融合基因,构建了pcDNA3.1/Attacin-His_6重组质粒并转染入CHO细胞中,RT-PCR从阳性克隆的CHO细胞中扩增出预期大小的目的 片段,从转录水平证实CHO-Attacin-His_6重组细胞株表达了Attacin-His_6基因.结论 抗菌肽Attacin基因哺乳动物型工程细胞表达系统的建立,为进一步制备其肽类抗生素奠定了基础.     

重组融合蛋白rTMP-GH在巴斯德毕赤酵母中表达的研究

目的 实现TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)与人生长激素(human growth hormone,hGH)的重组融合蛋白rTMP-GH在巴氏毕赤酵母中的高效表达.方法 以含有rTMP-GH核苷酸序列的原核质粒为模板,PCR方法获得rTMP-GH的编码序列,并亚克降至载体pPIC9K中,将所构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒转化酵母宿主细胞GS115,MD/MM平板及G418抗性筛选高表达株,然后进行试管补料分批表达,Western blot对表达产物进行鉴定,通过巨核细胞集落形成能力对其,圭物学活性进行初步检测.结果 成功构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒,筛选到高表达rTMP-GH重组融合蛋白的巴氏毕赤酵母细胞株,初步证实所表达产物具有刺激巨核细胞集落形成的能力.结论 成功实现了rTMP-GH融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达.     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

人ICOS-Ig融合蛋白的真核表达及其生物学活性

目的:真核表达人ICOS胞外区与IgG Fc融合蛋白,并对其生物学活性进行初步分析。方法:以RT-PCR方法克隆人ICOS胞外区片段和人IgG Fc片段,定向插入真核表达载体pSecTag2,构建重组质粒pSecTag2-ICOS-Ig,脂质体转染CHO细胞,可溶性表达并纯化ICOS-Ig融合蛋白。采用SDS-PAGE、蛋白质印迹、ELISA对融合蛋白进行鉴定,配体结合活性实验和混合淋巴细胞增殖反应实验检测融合蛋白的活性。结果:构建的ICOS-Ig融合蛋白表达载体在CHO细胞中表达ICOS-Ig蛋白。纯化获得的ICOS-Ig可以与配体ICOSL特异性结合,并抑制同种T淋巴细胞增殖反应。结论:成功构建了人ICOS胞外区与人IgG Fc融合蛋白真核表达系统,获得有生物学活性的ICOS-Ig融合蛋白。     

PD-L1蛋白的表达、纯化与鉴定

目的克隆人PD-L1的基因,纯化Flp-In CHO系统表达PD-L1蛋白.方法用RT-PCR方法制备PD-L1基因,以哺乳细胞高效表达质粒载体pSec/WG为载体构建重组PD-L1/pSec/WG质粒,重组体用载体上的通用引物为测序引物,鉴定克隆的正确性.再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化转染Flp-In CHO细胞收集上清,G蛋白亲和层析法纯化蛋白.用免疫印迹法鉴定转化细胞所分泌上清的PD-L1基因的表达.结果正确构建了PD-L1/pSec/WG重组质粒,并且在转化细胞所分泌的上清中检测出了PD-L1基因的表达.亲和层析法成功纯化出PD-L1蛋白,分子量为40×10 3.结论成功地构建了PD-L1/pSec/WG重组质粒,纯化出PD-L1蛋白,可进行下一步mAb制备,进一步研究其功能.     

人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达

目的：构建人肠三叶因子（hITF）重组真核表达载体,并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法：通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段,将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr,得到重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr;经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系;用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白,为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。     

促血小板生成素基因转染小鼠骨髓基质细胞体外表达的实验研究

目的探讨促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)基因修饰的小鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)体外表达TPO的变化特点。方法以脂质体介导法将TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs,RT-PCR方法检测TPO mRNA的表达,免疫组化法及Western blot测定TPO蛋白的表达。结果转染TPO基因的BMSCs其TPO mRNA及TPO蛋白表达量明显高于空载体组(P<0.01)及未转染组(P<0.01)。结论阳离子脂质体能有效介导TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs,且转染后BMSCs中TPO mRNA及TPO蛋白的表达显著上调。     

丙型肝炎病毒核心区截短型基因真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的：建立截短的丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的真核表达载体，并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中瞬时表达：方法：应用多聚酶链反应（PCR），以HCV-H株全长cDNA序列为模板，扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段，克隆人真核表达载体pcDNA3．1（-），并通过脂质体转染至CHO细胞。结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1-Ct，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3．1-Ct在CHO细胞中表达截短型的C蛋白。结论：成功构建羧基端部分缺失的HCVC区基因的真核表达载体，瞬时转染CHO细胞，为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗（BCG）活载体疫苗奠定基础。     

rhTPO在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性分析

目的：探讨人促血小板生成素(human thromlbopoietin，hTPO)在大肠杆菌中表达、分离纯化及生物学活性初步鉴定。方法：利用RT-PCR法从人胎肝细胞中扩增目的基因片段，将其定向插入pQE30表达质粒T5启动子下游的多克隆区，转化大肠杆菌M15，得到pQE30-TPO的工程菌，诱导目的蛋白表达、纯化。将表达产物给血小板减少模型小鼠尾静脉注射，观察注射后不同时间血小板量的改变。结果：经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside IPTG)诱导培养，该工程菌可以产生单一特异性的高表达蛋白条带。将纯化后的表达蛋白注射小鼠，结果显示对实验性小鼠血小板减少症具有一定的治疗作用。结论：在大肠杆菌中成功地高效表达了重组hTPO，该产物具有促血小板生成的活性。     

GST融合蛋白制备表皮生长因子受体抗体

目的：探讨制备大量表皮生长因子受体(EGFR)特异性抗体的方法。方法：将编码EGFR的N端肽段的cDNA克隆入表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达后,经亲和层析柱纯化,用该GST融合蛋白免疫BALB／C小鼠,获得免疫血清,以ELISA和Western Blot检测抗体滴度。结果：获得GST—PTB融合蛋白纯度大于95％;经免疫小鼠抗血清滴度1：38827～1：190602,得到大量高滴度的EGFR特异性抗体。结论：用原核系统表达GST融合蛋白直接免疫小鼠可以快速、大量地制备EGFR特异性抗体。     

人可诱导共刺激分子胞外片段和小鼠免疫球蛋白Ig融合基因的表达及生物学活性鉴定

目的:探讨用基因工程方法表达的人可诱导共刺激分子(ICOS)与小鼠免疫球蛋白的融合蛋白竞争抑制ICOSB7RP1共剌激通路的作用.方法:以RT-PCR方法克隆编码人ICOS胞外片段,与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段(Ig)的基因融合,构建携带融合基因的高效真核表达载体pcDNA4/HisMAX A-ICOS-Ig.采用脂质体法转染CHO细胞,用Western 印迹法检测稳定表达细胞中融合基因的表达,流式细胞术检测重组蛋白的配体结合活性.以适当浓度的重组融合蛋白作为拮抗剂与BALB/c和C57BL小鼠脾单个核细胞进行混合培养,观察重组蛋白在体外抑制淋巴细胞增殖的效果.结果:构建了携带融合基因的高效真核表达载体pcDNA4/HisMAX A-ICOS-Ig;Western印迹法检测表明转染细胞有重组蛋白的表达;流式细胞术分析显示重组蛋白有配体表达细胞的结合活性;该重组融合蛋白作为拮抗剂可体外抑制混合淋巴细胞增殖.结论:构建并成功表达了ICOS-Ig融合基因高效真核表达载体;该重组蛋白具有配体结合活性,可在体外通过抑制ICOS-B7RP1共刺激通路抑制淋巴细胞增殖.     

重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆编码人白细胞介素10（hIL-10）基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达.方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑（MTT）检测hIL-10蛋白的活性.结果：RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础.     

小鼠4-1BBLcDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆小鼠4-1 BBL基因，构建其真核表达载体，并观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法：取C57BL/6小鼠脾细胞，经PHA诱导后，以RT-PCR克隆4-1 BBLcDNA，测序，构建pCDNA3．1( )-m4-1BBL真核表达质粒，转染COS-7细胞，RT-PCR检测m4-1BBLmRNA表达，间接免疫荧光法和流式细胞仪检测4-1 BBL蛋白的表达，结果：从小鼠脾细胞中克隆到m4-1 BBL cDNA，经测序完全正确，所构建的m4-1BBL质粒在COS-7细胞中获得高效表达。结论：小鼠4-1BBLcDNA基因克隆、真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

MHC I类基因逆转录病毒表达载体的构建及其在造血细胞中的表达

目的：构建BALB/c小鼠MHC I类基因的逆转录病毒表达载体并探讨该基因在C57BL/6小鼠造血细胞中，并用逆转录聚合酶链反应和流式细胞仪检测转染后基因的表达。结果：用EcoR I和XhoI双酶切鉴定证实，H2D^d基因正确插入载体pMSCV。重组逆转录病毒感染的C57BL/6小鼠造血细胞整合了BALB/c小鼠的H2D^d基因，且能转录为mRNA，在其细胞膜上有H2D^d分子的表达。结论：成功构建小鼠H-2D^d编码基因的逆转录病毒载体，该基因已稳定地整合进C57BL/6小鼠造血细胞的基因组内，且在细胞中得到表达。     

鼠bcl-XL基因在CHO细胞中的表达

目的：构建携带鼠bcl-XL基因的真核表达载体，并将其在CHO细胞中表达。方法：用反转录PCR获取鼠bcl-XL全长cDNA序列，将其克隆进pEGFP重组融合表达质粒，脂质体法转染CHO细胞，荧光检测目的蛋白表达。结果：成功获得了鼠bcl-XL cDNA，构建了编码鼠bcl-XL的真核融合表达载体pEGFP-bcl-XL，转染CHO细胞后观察到融合蛋白表达。结论：鼠bcl-XL基因的克隆及融合表达，为进一步在高密度、大规模细胞培养中利用bcl-XL具有重要意义。