PRL-3基因的克隆及其原核表达载体的构建表达

目的 克隆人PRL-3基因并构建其原核表达载体.方法 设计PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人PRL-3 cDNA.经T-A克隆,通过双酶切鉴定及测序确认后,构建人PRL-3基因的原核表达载体pGEX-4T-1-PRL-3.结果 成功扩增出人PRL-3全长cDNA,并构建pGEX-4T-1-PRL-3原核表达载体,测序结果表明PRL-3全长cDNA与GenBank中PRL-3序列完全一致,SDS-PAGE胶分析表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组蛋白.结论 获得人PRL-3基因全长cDNA并构建其原核表达载体,使其在大肠杆菌中获得了高效表达,为深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础.     

pcDNA3．1^＋-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的 克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3-1^ -HIF-1α。方法 以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板，进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，获得HIF-1α的cDNA，克隆入T载体，测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3．1^ ，酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3．1^ -HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞，RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果 扩增出HIF-1αcDNA全长，测序结果与Genbank记载完全一致，成功克隆入真核表达载体pcDNA3．1^ ；建立了稳定的细胞株HEK293／pcDNA3．1^ -HIF-1α。结论 成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3．1^ -HIF-1α并证明其能在真核细胞内表达。     

pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的构建与鉴定

[目的]从人角质形成细胞系HaCaT中克隆NRP1(Neuropilin-1)基因全长cDNA,构建含NRP1基因的重组真核表达载体,为下一步的NRP1基因功能研究奠定基础。[方法]采用RT-PCR法从人角质形成细胞系HaCaT中扩增NRP1基因全长cDNA,扩增产物通过TA克隆连接到pMD18-T载体进行测序鉴定,然后通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),最后得到pcDNA3.1(+)-NRP1重组质粒。[结果]成功克隆NRP1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体。[结论]pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的成功构建可以为NRP1基因功能的进一步研究及其临床基因治疗奠定实验基础。     

pcDNA3.1+-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3.1 -HIF-1α。方法以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得HIF-1α的cDNA,克隆入T载体,测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3.1 ,酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1 -HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1αcDNA全长,测序结果与Genbank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1 ;建立了稳定的细胞株HEK293/pcDNA3.1 -HIF-1α。结论成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3.1 -HIF-1α,并证明其能在真核细胞内表达。     

重组Sox5蛋白cDNA克隆与真核表达载体的构建

目的 克隆人类睾丸组织特异的Sox5基因全长cDNA，构建重组Sox5真核表达载体pcDNA3-Sox5。方法 从成人睾丸组织提取总mRNA，采用RT-PCR技术扩增SoxScDNA片段，并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3真核表达质粒，双酶切及测序鉴定重组质粒。结果 经RT-PCR获得1．1kb的产物，连接重组后经双酶切筛选阳性克隆，DNA测序验证，确定成功筛选出真核表达载体pcDNA3Sox5。结论 成功构建人Sox5基因全长cDNA真核表达载体，为进一步探索精细胞特异表达的Sox5转录因子是否参与ZNF30的转录调控打下了基础。     

日本血吸虫合抱相关未知功能基因SJCHGC00821的克隆及生物信息学分析

目的 克隆与日本血吸虫合抱相关但未知功能的新基因SJCHGC00821，构建其真核表达载体，并应用生物信息学初步探讨其功能。方法 应用PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增SJCHGC00821基因全长ORF，将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3中，通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定。应用生物信息学初步分析其细胞定位、蛋白序列、结构域及功能。结果 获得日本血吸虫合抱相关未知基因SJCHGC00821的克隆，序列分析结果提示该cDNA序列含有一个597bp的完整阅读框序列，编码198个氨基酸，其编码蛋白的理论分子量为22．76kDa，等电点为4．84。二级结构分析预测提示其具有一定抗原性。结论 成功地克隆了日本血吸虫SJCHGC00821基因全长ORF，构建了其pcDNA3真核表达载体，为进一步研究其结构与功能创造了条件。     

pcDNA3.1- Bcl-2真核表达载体构建

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体, 测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒。结果: RT-PCR获得长度为720 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3. 1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1- Bcl-2构建成功。结论 成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。     

CDH22基因克隆及其真核表达载体的构建与表达

目的克隆人CDH22基因并构建其真核表达载体。方法设计CDH22特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人CDH22cDNA,经T-A克隆,通过双酶切及测序鉴定,将CDH22克隆至pCDNA3/HA,构建人CDH22基因的真核表达载体pCDNA3/HA-CDH22,转染HEK293A细胞,用WesternBlot及免疫荧光细胞化学技术检测目的蛋白的表达。结果成功扩增出人CDH22全长cDNA,双酶切鉴定证实成功构建pCDNA3/HA-CDH22真核表达载体,测序结果表明CDH22全长cDNA与GeneBank中CDH22序列完全一致,转染HEK293A细胞后,可检测出Mr约为86KD的目的蛋白,而免疫荧光细胞化学技术也检测到蛋白表达。结论获得人CDH22基因全长cDNA并成功构建了CDH22真核表达载体,证实pCDNA3/HA-CDH22转染HEK293A细胞后可表达HA-CDH22蛋白,为深入研究CDH22基因在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP C1,转染大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,双酶切鉴定重组质粒。【结果】经RT PCR获得 1 0 3kb的产物 ,经DNA测序 ,确定所扩增片段为人类 pol β基因全长cDNA ,进而成功筛选出真核表达载体 pEGFP C1 β。【结论】成功构建人 pol β基因全长cDNA真核表达载体 ,为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础     

人卵巢癌组织乙酰肝素酶基因的全长扩增及真核载体的构建

目的通过基因工程技术,扩增出乙酰肝素酶基因全长,构建其真核载体。为进一步研究乙酰肝素酶与卵巢癌浸润转移的关系打下基础。方法选取浆液性卵巢癌组织作为模板提取人卵巢癌组织总mRNA,RT-PCR技术扩增cDNA,利用PCR技术进行乙酰肝素酶基因全长的扩增。将其与真核表达载体pcDNA3.1连接,进行克隆及酶切和测序鉴定。结果成功扩增出目的基因全长,并经测序验证其同源性达100%。结论采用基因工程技术成功从恶性卵巢癌组织中扩增出HPSE全长并构建了其真核表达载体。     

PRL-3基因C104S位点突变体和CAAX缺失体的构建及表达

目的:分别构建肝再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver 3,PRL-3)基因C104S位点突变和C端CAAX缺失的myc标签和GFP荧光标签重组质粒pcDNA3-myc-PRL-3(C104S)、pEGFP-PRL-3(C104S)、peDNA3-myc-PRL-3(△CAAX)和pEGFP-PRL-3(△CAAX),并进行真核表达,为PRL-3的后续功能研究提供有效的工具.方法:设计PRL-3基因C104S点突变、c端CAAX缺失的特异性引物,以peDNA3-myc-PRL-3质粒为模板,通过基因克隆、一步法点突变的方法构建各重组质粒,通过酶切和测序鉴定后转染真核细胞,检测其在细胞中的表达并观察定位情况.结果:成功构建了4种重组质粒,并能在结肠癌细胞LoVo中表达.用激光共聚焦扫描显微镜对细胞中绿色荧光融合蛋白的定位观察发现,当PRL-3的CAAX位点缺失后,PRL-3由内膜系统大量入核,与理论预期相符.结论:获得了PRL-3基因C104S位点突变体和CAAX缺失体重组真核表达质粒并能在细胞中表达,为进一步研究PRL-3的功能提供了条件.     

PRL-2真核表达载体的构建及其致侵袭和粘附的研究

目的 构建PRL-2真核表达载体并观察其致侵袭和粘附的能力.方法 用RT-PCR法从肝癌细胞系HepG2总RNA中扩增编码PRL-2基因全长阅读开放框DNA,构建真核表达载体.以脂质体转染法将重组质粒稳定转染至正常永生化肝细胞系CL1中,筛选阳性克隆.分别应用RT-PCR、Western blotting免疫印迹和免疫组化法分析PRL-2在阳性细胞中mRNA、蛋白表达及其定位.MTT法观察转染20 min和120 min后与底物粘附的细胞数,评价PRL-2对CL1肝细胞粘附能力的促进作用,观察6 h后细胞穿透多聚碳膜上层粘蛋白的细胞数,分析PRL-2对肝细胞浸润迁移的影响.结果 经RT-PCR扩增出大小为504 bp的基因片断,序列测定正确并经亚克隆酶切鉴定.经过8周G418筛选后,获得稳定表达PRL-2的细胞亚系PRL-2-CL1,经RT-PCR、Western blotting印迹和免疫组化证实,PRL-2-CL1细胞系表达PRL-2 mRNA及蛋白.PRL-2使CL-1细胞在20 min和120 min时对纤连蛋白的粘附率明显升高(P＜0.05),PRL-2使CL-1细胞穿透迁移小室多聚碳膜的细胞数由(10.0±3.7)个显著升高至(44.8±2.6)个(P＜0.05).结论 成功构建重组PRL-2真核表达载体并可在永生化肝细胞中稳定表达,PRL-2具有致肝癌细胞侵袭和转移的能力.     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达

目的 构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系.为PRb-3基因功能研究奠定基础.方法 设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体.通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体.利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系.结果 成功构建PRL-3 pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L.RT-PCR、Western blotting结果 表明,克隆1 PRL-3mRNA及蛋白显著降低.结论 成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系.     

结直肠癌中RhoC、PRL-3与FMNL2的表达及其意义

目的探讨RhoC、PRL-3及FMNL2在结直肠癌(CRC)中的表达及其相互作用关系。方法利用免疫组化、Western blot检测在不同结直肠癌细胞中RhoC、PRL-3蛋白含量变化;用Realtime-RTPCR法分析RhoC、PRL-3mRNA表达情况。结果免疫组化显示FMNL2基因沉默后,RhoC的平均光密度值(AOD)明显下降,而PRL-3的AOD值未见明显差异。随着结直肠癌细胞中FMNL2蛋白水平下调,RhoC蛋白水平表达明显下降,RhoC mRNA的表达水平是SW620细胞的0.618倍,差异有统计学意义(P0.05),而PRL-3蛋白含量及mRNA的表达水平均未见明显差异。结论 FMNL2可能参与RhoC调控转移机制,而FMNL2对PRL-3的表达可能无反馈性调节作用。     

14-3-3基因真核表达载体的构建

目的克隆人14-3-3基因并构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。方法从胎脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人14-3-3基因的全长cDNA,将其插入pCUm-T载体中;序列测定后,重组携带14-3-3基因的表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。结果经限制性内切酶酶切分析、PCR和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。结论成功构建了14-3-3真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3,为进一步研究14-3-3在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。     

核基质蛋白SAFB真核表达载体的构建及其鉴定

目的构建人SAFB基因真核表达载体,为SAFB基因功能研究提供研究基础。方法设计人SAFB特异性引物,提取人正常结直肠上皮组织总RNA,应用RT-PCR方法提取人SAFBcDNA,通过双酶切及测序鉴定,将SAFB克隆至pcDNA3.1（-）,构建人SAFB基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）/SAFB,转染SW480细胞,用WesternBlot技术检测目的蛋白的表达。结果成功扩增人SAFB全长cDNA,双酶切鉴定和测序结果证实成功构建pcDNA3.1（-）/SAFB真核表达载体,转染细胞后,可检测出分子量约为140KD的目的蛋白。结论获得人SAFB基因全长cDNA并成功构建了SAFB真核表达载体,证实pcDNA3.1（-）/SAFB转染SW480细胞后可表达SAFB蛋白,为深入研究SAFB基因在肿瘤发生发展中的作用提供了基础。     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建

目的 了解大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)线粒体DNA的突变,克隆突变的大肠癌线粒体DNA(mtDNA)基因,构建pcDNA3.I(+)-mtDNA真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞,以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法 提取大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)mtDNA,扩增D-LOOP区,产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3.1(+),并用脂质体法导人NIH3T3细胞。结果 检测出大肠癌细胞株SW480、LoVo、HT29细胞mtDNAD-LOOP分别有10、9、8个突变位点。成功克隆1119bp的mtDNAD-LOOP区至表达质粒pcDNA3.1(+),并导入NIH3T3细胞中。结论 线粒体DNAD-LOOP区是一个具有高度多态性和突变性的区域,在大肠癌细胞株中突变率较高。     

人宫颈癌Ca Ski 细胞 IL-24基因的克隆鉴定与真核表达

目的:克隆人IL-24基因并构建真核表达载体,转染Ca Ski细胞进行真核表达.方法:利用RT-PCR技术扩增出Ca Ski细胞中的IL-24基因.将IL-24基因克隆人pcDN3.1( )中,构建真核表达质粒pcDN3.1( )-hIL-24的表达.结果:PCR及测字结果均证实在功克隆了人IL-24,该质粒被转染人Ca Ski细胞中能表达出hIL-24蛋白.结论:成功构建了hIL-24基因的真核表达载体.