谷氨酸-天冬氨酸转运体在豚鼠耳蜗的分布

目的研究谷氨酸-天冬氨酸转运体(glutamate—aspartate transporters，GLAST)在正常豚鼠耳蜗内的分布，为探讨GLAST在防止耳蜗谷氨酸(Glu)神经毒性中的作用提供形态学基础。方法选取健康红目豚鼠6只，采用免疫组织化学方法，以山羊抗GLAST抗体为标记物，观察正常豚鼠耳蜗中GLAST的表达及分布。结果在正常豚鼠耳蜗的内、外毛细胞，内、外毛细胞周围的支持细胞，螺旋神经节细胞，血管纹边缘细胞和螺旋缘上皮，均有GLAST阳性表达。结论GLAST在正常豚鼠耳蜗内主要分布于内、外毛细胞，内、外毛细胞周围的支持细胞，螺旋神经节细胞、血管纹边缘细胞和螺旋缘上皮，其功能尚需进一步的研究。     

谷氨酸对豚鼠畸变产物耳声发射和听性脑干反应的影响

目的 研究外源性谷氨酸对畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustlcemission，DPOAE)、听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)及耳蜗形态学的影响。方法应用豚鼠全耳蜗灌流技术，耳蜗灌流10mmol/L谷氨酸2h，分别记录灌流前、后DPOAE和ABR；耳蜗微音电位(cochlear microphonics，CM)和听神经复合动作电位(compound action potential，CAP)；应用透射电镜进行耳蜗形态学观察。结果灌流人工外淋巴液前、后CM及CAP无改变；灌流10mmol／L谷氨酸后DPOAE无改变，ABR潜伏期延长；同样灌流10mmol／L谷氨酸后CM幅度虽有下降、但是其非线性特点无改变；CAP阈值平均升高了35dB；灌流谷氨酸后内毛细胞及其下方神经纤维出现空泡。结论谷氨酸作为耳蜗主要的兴奋性传入神经递质，过度释放可以产生兴奋性毒性，损伤耳蜗内毛细胞及传入神经。同时本实验为建立听神经病的动物模型提供了一个参考方法。     

交叉听力对豚鼠听性脑干反应测试的影响

报告对８只听觉正常的及鼠，观察交叉听力对其耳蜗动作电位和听怀脑干反应测试结果的影响。先手术造成其左耳全聋，然后用四种方法分别记录ＡＢＲ反应阈和Ⅰ波潜伏期。结果发现，术耳虽已全聋，但该侧给声强度达１０ｄＢＨＬ以上时仍可记录到ＡＢＲ，而ＡＰ未能引出，代之出现的却是清晰的ＡＢＲ波形。     

不同龄豚鼠听性脑干反应和耳蜗核形态比较

为比较出生后不同时间及成年豚鼠听性脑干反应、耳蜗核结构、各亚核团细胞形态、细胞面积和密度，测试了出生后１２、２４、４８小时和成年豚鼠各５、５、９、２８只的听性脑干反应，部分作脑干切片，光学显微镜观察耳蜗核及各亚核团细胞形态，计算机图像处理系统测试前腹侧核和后腹侧核细胞面积和密度，发现（１）新生豚鼠除ＡＢＲ反应阈较成年豚鼠高平均１０ｄＢ外，波形、各波潜伏期和波间期无显著差异。（２）跟猫、沙土鼠和蝙蝠一样，新生豚鼠和成年豚鼠耳蜗核也可分为三个亚核团：背侧核（ＤＣＮ）、前腹侧核（ＡＶＣＮ）和后腹侧核（ＰＶＣＮ）。（３）豚鼠耳蜗核各亚核团内细胞分型也跟猫相似，ＡＶＣＮ内有大球细胞、小球细胞和球形细胞；ＰＶＣＮ内有章鱼细胞、多极细胞和球形细胞；ＤＣＮ内有颗粒细胞、锥形细胞和巨细胞。（４）成年豚鼠各亚核团平均细胞密度较新生豚鼠明显降低，出生１２小时到成年鼠ＡＶＣＮ和ＰＶＣＮ细胞密度分别减少２５．１３％和２２．１７％。（５）新生豚鼠ＡＶＣＮ细胞平均面积是成年组的８３．３６％，ＰＶＣＮ是成年组的９３．０４％。比较本实验测量的细胞密度和面积的改变和猫出生后到成熟耳蜗核细胞的资料，分析差异较大的可能原因。     

短期铅暴露对成年豚鼠听性脑干反应的影响

摘要：目的观察短期铅暴露对成年豚鼠听性脑干反应（auditory brainstem response, ABR）的影响。方法将24只听力正常的成年黑目花色豚鼠随机分为4组（A、B、C、D组,每组6只）,分别用含醋酸铅浓度为2 mmol/L的铅水进行喂养0、15、30及60 d,所有动物均在实验结束时测试双耳ABR并断头采血检测血铅浓度。结果各组动物的血铅浓度分别为A组（58.91±7.76）μg/L、B组（659.00±62.71）μg/L、C组（733.00±68.96）μg/L、D组（701.80±54.75）μg/L。各组动物由click诱发的ABR阈值分别为A组（25.91±3.75）dB SPL、B组（23.57±5.56）dB SPL、C组（26.88±5.94）dB SPL、D组（25.63±5.00）dB SPL,各组动物之间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。在70 dB SPL 的click声刺激下,随着铅暴露时间的延长,I波潜伏期出现延长的趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;30 d及60 d与对照组相比,III波振幅出现减小,其差异具有统计学意义（P<0.01）。结论短期铅暴露（2个月内）对成年豚鼠ABR阈值无明显影响,但铅暴露时间超过30 d,从耳蜗传导到中脑的听觉信号强度开始出现下降。     

水杨酸钠对幼年和成年豚鼠听性脑干反应阈值及螺旋神经节谷氨酸脱羧酶表达的影响

目的 观察水杨酸钠对幼年和成年豚鼠听性脑干反应(ABR)阈值以及螺旋神经节谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)表达的影响.方法 选择出生4 d的豚鼠40只和出生后1个月的成年豚鼠40只,分成4组(每组20只):幼年对照组,成年对照组,幼年水杨酸钠给药组[300 mg/(kg·d)],成年水杨酸钠给药组[300 mg/(kg·d)].给药15 d后每组随机选取10只豚鼠检测ABR阈值,采用免疫组织化学染色方法检测螺旋神经节GAD的表达.各组剩下的动物停止给药,继续喂养30 d后检测ABR阈值和螺旋神经节GAD的表达.结果 给药15 d后幼年水杨酸钠给药组和成年水杨酸钠给药组豚鼠ABR阈值较给药前以及同期对照组均有提高(P值均<0.001),停药30 d后幼年水杨酸钠给药组ABR阈值恢复到给药前水平,而成年水杨酸钠给药组仍停留在高阈值水平;水杨酸钠给药15 d后能明显下调幼年以及成年豚鼠螺旋神经节GAD蛋白表达,幼年豚鼠GAD表达水平低于成年豚鼠(t=4.7,P<0.001),停药30 d后幼年给药组螺旋神经节GAD表达恢复到同期对照组水平,而成年给药组则继续停留在低表达水平.结论 水杨酸钠在对幼年和成年豚鼠ABR阚值以及螺旋神经节GAD表达的影响上存在差异,其对幼年豚鼠的影响更为明显,但停药后幼年豚鼠较成年豚鼠更容易恢复到正常水平.     

颈上神经节切除对豚鼠耳蜗血流及听性脑干反应阈的影响

目的研究豚鼠颈交感神经节对耳蜗血流及听觉生理功能的调节作用。方法在正常豚鼠单侧耳蜗螺旋蜗轴动脉局部滴加逆行追踪剂辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP),观察双侧交感颈上神经节、星状神经节内的阳性神经元分布;建立单侧颈上神经节切除模型,观察术后不同时间点双侧耳蜗血流、听性脑干反应的情况;建立单侧颈上神经节切除后噪声性听损伤模型,观察颈上神经节切除对噪声损伤导致的听觉阈移是否有保护作用。结果耳蜗螺旋蜗轴动脉局部给予逆行追踪剂后同侧颈上神经节内可见阳性神经元;单侧颈上神经节切除1周后,术侧耳蜗底回血管纹处血流较对侧升高,听性脑干反应阈值无明显变化;颈上神经节切除对噪声导致的听损伤有一定的保护作用。结论交感颈上神经节切除对豚鼠耳蜗血流及听觉生理功能有一定的影响。     

水合氯醛对豚鼠听性脑干反应的影响

目的 探讨水合氯醛麻醉对成年豚鼠听性脑干反应检测的影响.方法 分别在清醒状态(w aking state,W)及水合氯醛(chloral hydrate,CH)麻醉状态下对20只健康成年雄性白色豚鼠进行短声(click)诱发的听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)检测,以引出率最高的波来判断反应阈值,比较两种状态下90 dB peSPL刺激声强下ABR各波的潜伏期、波间期及不同强度下的Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ波振幅及引出率.结果 20只豚鼠水合氯醛麻醉状态与清醒状态下ABR反应阈分别为25.50±2.76、28.5±3.66 dB peSPL,差异无统计学意义(P>0.05).水合氯醛麻醉状态下ABR各波潜伏期较清醒状态均延长,Ⅲ 、Ⅳ 、Ⅴ波差异有统计学意义(P<0.05),而Ⅰ 、Ⅱ波差异无统计学意义(P>0.05);水合氯醛麻醉状态下Ⅰ-Ⅴ 、Ⅲ-Ⅳ 、Ⅳ-Ⅴ波间期较清醒状态下延长(P<0.05),而Ⅰ-Ⅱ 、Ⅱ-Ⅲ波间期差异无统计学意义(P>0.05);水合氯醛麻醉状态和清醒状态均显示波Ⅱ振幅及引出率最高;水合氯醛麻醉状态波Ⅱ 、Ⅲ振幅在高强度刺激声时较清醒状态高,而波Ⅳ振幅较清醒状态低(P<0.05).结论 水合氯醛麻醉及清醒状态下豚鼠ABR反应阈无明显差异,但水合氯醛麻醉会使豚鼠ABR的波Ⅲ 、Ⅳ 、Ⅴ潜伏期明显延长,并对振幅产生影响;豚鼠ABR波Ⅱ出现率最高,可以Ⅱ波判断反应阈.     

谷氨酸调节耳蜗内毛细胞游离钙的实验观察

目的 探讨谷氨酸（glutamate,Glu）对离体耳蜗内毛细胞（inner hair cells,IHC)内钙信号的调控作用及其生理病理意义。方法 在激光共聚焦显微镜下用钙敏荧光探针Fluo－3作为指示剂,观察外源性谷氨酸对分离的10个豚鼠耳蜗IHC胞内游离钙离子浓度（[Ca^2 ]i)的影响。结果 分离好的正常IHC呈烧瓶形态,有明显的颈部,皮板上可观察到静纤毛,大球形的细胞体中间可见圆形的细胞核。形态完好的IHC大约存活2h,Fluo-3 钙敏荧光探 针染色后IHC胞体、胞核及表皮板有明显的染色梯度,表明游离Ca^3 浓度从细胞 核向细胞逐渐减少。终浓度为3.85umol/L的Glu对游离IHC内[Ca^2 ]i有增高趋势,而对游离外毛细胞（outer hair cells,OHC)内[Ca^2 i]浓度无影响。观察10个IHC,发现9个[Ca^2 ]i浓度增加,1个无变化;观察10个OHC,发现7个[Ca^2 ]i无变化,3无略有下降。当Glu浓度增高后,IHC内[Ca^2 ]i先是迅速升高,继而逐渐下降,IHC外形由烧瓶状逐渐变成球形,提示IHC水种变性。结论 Glu可选择性调控IHC内[Ca^2 ]i ,而对OHC内[Ca^2 ]i无影响,而过量的Glu刺激,可造成IHC[Ca62 ]i的堆积,从而IHC水肿变性。     

噪声暴露对豚鼠耳蜗内毛细胞谷氨酸样免疫反应的影响

目的：了解噪声暴露对豚鼠耳蜗内毛细胞谷氨酸样免疫反应的影响，探讨噪声暴露引起耳蜗传入神经损伤的谷氨酸兴奋毒机制。方法：采用免疫组织化学方法结合计算机图像分析，观察噪声暴露后不同时间豚鼠耳蜗内毛细胞谷氨酸样免疫反应的改变。结果：在噪声后8小时，豚鼠耳蜗内毛细胞谷氨酸样免疫反应减弱。结论：噪声可引起耳蜗内毛细胞传入神经递质谷氨酸的过度释放，继而对耳蜗传入神经产生兴奋毒损伤，这可能是噪声后耳蜗传入神经损伤的机制之一。     

头低位模拟失重状态对豚鼠耳蜗听功能与超微结构的影响

目的探讨头低位模拟失重对豚鼠耳蜗听功能与超微结构的影响。方法 22只豚鼠随机分为实验组16只和对照组6只。实验组采用头低位模拟失重法,身体纵轴与水平线呈-30°,于实验前、失重5天后即刻及脱离失重3天后分别测试豚鼠听性脑干反应(ABR),然后取耳蜗行扫描电镜和透射电镜观察。对照组不作任何处理。结果对照组豚鼠ABR反应阈为23.48±6.04dB SPL,实验组实验前为24.22±4.04,模拟失重5天后即刻ABR反应阈为41.61±7.01dB SPL,与实验前和对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.05);脱离失重3天后实验组ABR反应阈为27.50±3.54dB SPL,与实验前相比差异无显著统计学意义(P>0.05)。扫描电镜观察发现失重5天后即刻豚鼠耳蜗内、外毛细胞散在缺失,纤毛融合、倒伏;透射电镜检查见内、外毛细胞细胞局部空泡形成,脱离失重3天后上述病变均有明显恢复,但未完全恢复正常。结论模拟失重5天即可以导致豚鼠耳蜗听觉功能和超微结构的损伤,脱离失重3天后听功能可以恢复正常,但其超微结构还没有完全恢复正常。     

豚鼠耳蜗一氧化氮合酶的分布

目的 用组织化学法,通过观察NADPH-黄递酶的活性了解一氧化氮合酶在豚鼠耳蜗内分布。方法 经4％多聚甲醛心脏灌注固定后,取出耳蜗,经3％依地酸脱钙后,作厚10μm冰冻切片,用辅酶Ⅱ孵育液在37℃条件下孵育l小时。结果 发现在耳蜗内、外毛细胞底部与耳蜗神经末梢接头处及毛细血管球内皮细胞有明显NADPH-黄递酶活性,此外在内、外柱细胞、支持细胞、血管纹及螺旋神经节细胞也有NADPH-黄递酶活性反应。结论 NO在维持耳蜗正常神经传导及毛细血管张力中起着重要作用。     

Distribution of the Glutamate/Aspartate Transporter GLAST in Relation to the Afferent Synapses of Outer Hair Cells in the Guinea Pig Cochlea

The glutamate/aspartate transporter GLAST is known to occur in the plasma membrane of supporting cells and their glialike processes around the synaptic region of inner hair cells of the mammalian cochlea. Its function there is presumably to take up glutamate following the release of this putative amino acid neurotransmitter from the inner hair cells. In this study, we have investigated whether GLAST is also associated with the outer hair cells using postembedding immunogold labeling. This is interesting because it is uncertain whether the outer hair cells have a functional synapse at which glutamate may be released. However, earlier ultrastructural studies of the afferent synapses in outer hair cells in several mammalian species have shown features normally associated with synaptic activity. These observations are confirmed and extended here in guinea pig where these afferent synapses have presynaptic bodies, putative synaptic vesicles, and coated pits associated with them. Immunoreactivity for GLAST was found along the plasma membranes of Deiters' cells, especially around the synaptic region of the hair cell, on processes wrapped around approaching nerve fibers. Semiquantitative analysis of the distribution of immunogold labeling of Deiters' cells confirmed that it was densest in the region adjacent to the synapses. There was also more labeling in apical than in basal regions of the cochlea in three of the four animals examined, suggesting an association with the number of afferent synapses, which are more numerous in apical regions. Interestingly, labeling also occurred in other regions of the cell membrane away from the afferent terminals. This suggests that glutamate uptake is also required away from the immediate vicinity of synapses, perhaps as a consequence of glutamate dispersal resulting from the mechanical displacement of the cochlear partition during stimulation. Nonetheless, the particular association of GLAST with the synaptic region of the outer hair cell implies that the latter have active afferent synapses at which glutamate is released.     

豚鼠耳蜗和内淋巴囊水通道蛋白的表达

目的 研究豚鼠耳蜗和内淋巴囊组织中水通道蛋白(aquaporin，AQP)不同亚型的定位表达及其意义。方法 用兔抗大鼠AQP1、AQP2、AQP3、AQP4的多克隆抗体，采用免疫组化SP法分别检测相应AQP蛋白亚型在豚鼠耳蜗和内淋巴囊组织中的表达模式。结果 在耳蜗组织中，AQP1、4广泛分布于耳蜗的各个区域，如血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋缘、螺旋神经节等，AQP3除了在血管纹表达呈弱阳性外，其余区域的表达与AQP1和AQP4相似，AQP2则仅表达于Reissner膜。在内淋巴囊组织中，AQP1、AQP3和AQP4在内淋巴囊上皮细胞和上皮下纤维组织均呈强阳性表达，只是AQP3的表达强度稍弱于AQP1和AQP4，而AQP2在内淋巴囊上皮细胞和上皮下组织均呈阴性表达。结论 水通道蛋白1、3、4以相似的方式广泛分布于豚鼠耳蜗和内淋巴囊组织中，而AQP2则仅表达于Reissner膜，提示不同亚型的AQP可能在不同区域协同作用参与内淋巴的调节，从而保持内耳内环境的稳定。     

水通道蛋白1、2、5在膜迷路积水豚鼠耳蜗中的分布及表达研究

目的观察水通道蛋白(aquaporin,AQ)1、2、5(AQP1、AQP2、AQP5)三种蛋白在膜迷路积水豚鼠耳蜗的表达及分布情况,探讨其在内淋巴积液中可能的发生机制。方法选择健康红目豚鼠60只,随机分为空白组(30只)和模型组(30只),模型组给予醋酸去氨加压素6μg·kg-1·d-1腹腔注射10 d,空白组以1 ml生理盐水腹腔注射10 d;常规饲养7天后取出耳蜗,通过免疫组化、Western-blot方法观察AQP1、AQP2、AQP5蛋白在豚鼠耳蜗的分布及表达。结果免疫组化示空白组、模型组豚鼠耳蜗组织中AQP1表达的光密度值分别为0.134±0.021、0.273±0.053;AQP2表达分别为0.089±0.013、0.261±0.100;AQP5表达分别为0.264±0.065、0.151±0.098;与空白组比较,模型组AQP1、AQP2蛋白表达明显上调(P<0.01),AQP5蛋白表达明显下调(P<0.05)。Western-blot示空白组、模型组豚鼠耳蜗组织中AQP1表达分别为0.214±0.034、0.313±0.032;AQP2表达分别为0.283±0.050、0.544±0.042;AQP5表达分别为0.291±0.041、0.199±0.033;与空白组比较,模型组AQP1、AQP2蛋白表达上调(P<0.01),AQP5蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论AQP1、AQP2、AQP5蛋白均可能参与了豚鼠耳蜗膜迷路积水的发生。     

杂色和白色豚鼠听反应阈及耳蜗血管纹细胞增殖活性的差异

目的研究杂色和白色成年豚鼠正常听反应阈及耳蜗血管纹细胞增殖活性的差异。方法用听觉诱发电位仪分别测定杂色和白色豚鼠40Hz听觉相关电位(40HzAERP)及听性脑干反应(ABR)阈值;用免疫组化法检测两种豚鼠耳蜗血管纹增殖细胞核抗原(PCNA)表达的差异。结果杂色和白色豚鼠耳蜗血管纹中间细胞PCNA染色均呈阳性,但前者PCNA的表达显著强于后者;两种豚鼠的听反应阈值无显著性差异。结论正常杂色和白色成年豚鼠血管纹中间细胞均具有增殖能力,但前者的增殖能力显著高于后者,不过这种差异并不造成两种豚鼠的正常听反应阈有明显差异。     

多巴胺对豚鼠耳蜗谷氨酸受体NMDA NR_1和NMDA NR_(2A)的调节作用

目的观察豚鼠耳蜗谷氨酸受体NMDANR1和NMDANR2A与多巴胺调节作用的相关性,探讨多巴胺在内毛细胞下突触复合体中的作用机制。方法选用杂色豚鼠40只,随机分组,每组10只．分别以右耳行全耳蜗灌流人工外淋巴液和不同浓度的多巴胺,并以人工外淋巴液灌流组的对侧耳蜗作为正常对照组,则共为5组（每组10耳）：①正常对照组;②人工外淋巴液组;③10mmol／L多巴胺组;④30mmol／L多巴胺组;⑤50mmol／L多巴胺组。在灌流前、灌流0、1、2h同时记录各组动物耳蜗电图,应用半定量RT—PCR的方法,观察各组间谷氨酸受体NMDANR1和NMDANR2A的mRNA表达量是否有差异。结果多巴胺对豚鼠4000Hz耳蜗复合动作电位产生抑制作用,使其阈值升高,且这种抑制作用呈现明显的量效依赖关系。与正常对照组和人工外淋巴液组比较,其余三组谷氨酸受体NMDANR1的mRNA表达量明显减少（P〈0．05）,NMDANR1的表达量与灌流多巴胺的浓度呈现明显的浓度剂量依赖关系;谷氨酸受体NMDANR2A的mRNA表达量在各组间差异均无统计学意义（P〉0．05）,随着灌流多巴胺浓度的增加,NMDANR2A的表达量没有明显变化。结论多巴胺可通过减少谷氨酸受体NMDANR1的量来实现对听觉通路抑制的作用,而谷氨酸受体NMDANR2A不参与多巴胺的抑制作用。     

豚鼠耳蜗Ca2+-ATP酶活性的超微细胞化学定位

目的为观察耳蜗Ca^2 -ATP酶的定位，建立一种检测内淋巴积水的超微细胞化学手段，进一步探讨CCa^2 -ATP酶在调节耳蜗钙浓度方面的作用。方法采用柠檬酸铅超微细胞化学染色方法观察12只豚鼠耳蜗内Ca^2 -ATP酶活性。结果Ca^2 -ATP酶活性反应产物是柠檬酸铅颗粒，主要表达在前庭膜内淋巴侧的细胞膜表面和微绒毛上，内、外毛细胞的静纤毛和皮板上，外毛细胞的基底侧细胞膜和血管纹基底细胞的内皱折膜上也可观察到Ca^2 -ATP酶反应产物。结论柠檬酸铅组织化学一步法能系统测定Ca^2 -ATP酶在耳蜗的定位，为探索此酶在耳蜗的作用建立了一种观察手段。本文结果提示Ca^2 -ATP酶在调节内耳钙浓度方面起着重要的作用。