脊髓损伤大鼠组织形态学变化与不同时点的Netrin-1表达

目的:Netrin-1蛋白可能具有轴突引导作用,观察其在大鼠急性脊髓损伤后不同时点的表达及损伤脊髓组织形态学的变化。方法:实验于2002-10/2003-10在中国医科大学实验动物中心完成,选取Wistar大鼠40只,随机分为损伤组20只,假手术组15只,正常对照组5只。制作大鼠脊髓半横断损伤模型,并于术后1,3,5,7,14d分别选择损伤组大鼠4只,假手术组3只,正常对照组1只,麻醉下取出T10节段脊髓经过处理制成切片,行苏木精-伊红染色观察损伤脊髓组织形态改变。经苏木精-伊红染色和常规卵白素-生物素-过氧化物酶复合物染色,电镜检测Netrin-1阳性反应物的表达。各组每只分别选取9张组化切片,分别从灰质前角至后角取8个高倍镜视野,测定其阳性反应物的平均灰度值,通过对平均灰度值的分析,测定Netrin-1的表达量。结果:在整个实验过程中,40只大鼠无死亡。实验切片360张,所取视野的平均灰度值均达到统计学分析要求。①3组苏木精-伊红染色组织形态学改变:假手术组与正常对照组脊髓均为正常结构。损伤组脊髓损伤后第1天灰质内出现片状出血、中央区碎裂,轴突断裂及脱髓鞘改变;第3天神经元肿胀,逐渐形成空洞,胶质细胞减少;第5,7天残存神经元减少,胶质细胞增生;第14天神经元胞浆内尼氏体染色呈虎斑状,提示生理功能逐渐恢复②3组Netrin-1表     

脊髓全横断模型大鼠损伤区白细胞介素17的表达

背景：现阶段,针对已知的炎性递质的干预措施对于减轻脊髓继发损伤的效果局限。白细胞介素17是重要的促炎性细胞因子,在中枢神经系统疾病发病机制中的作用正逐渐受到关注。 目的：观察急性脊髓损伤模型大鼠白细胞介素17 mRNA和蛋白表达的变化规律。 方法：健康雄性SD大鼠随机分为2组：模型组制作大鼠脊髓完全横断模型,假手术组仅剪开硬脊膜而不伤及脊髓实质。开放后测定肢运动功能评分观察急性脊髓损伤对大鼠运动功能的影响,苏木精-伊红染色观察脊髓损伤后不同时间点组织病理学改变,实时荧光定量PCR、Western blot分别检测各组大鼠脊髓损伤后不同时间点白细胞介素17 mRNA和蛋白水平表达变化。 结果与结论：开放后肢运动功能评分结果：假手术组大鼠BBB评分均为20-21分,脊髓损伤1,2 d大鼠BBB评分均为0分,损伤后7 d BBB评分为0-3分（P＜0.05）。苏木精-伊红染色结果：与假手术组相比,脊髓损伤6 h后,炎性细胞浸润,神经元和胶质细胞肿胀,神经元突起减少;脊髓损伤12 h后,灰质、白质组织结构疏松、空泡化;脊髓损伤后7 d,胶质细胞增生,组织纤维化明显。RT-qPCR结果显示：白细胞介素17 mNA于脊髓损伤后3 h出现,并于6 h表达出现高峰（P ＜0.01）,随后表达减少,7 d后表达接近假手术组水平。Western blot结果显示：脊髓损伤6 h后,白细胞介素17表达开始升高,并于损伤后12 h出现高峰（P＜0.05）,随后表达减少,至伤后7 d表达接近假手术组水平。结果可见脊髓损伤12 h后组织损伤表现最严重,并与白细胞介素17表达改变存在时间的一致性,推断白细胞介素17可能参与了脊髓继发性炎症反应过程。     

大鼠急性脊髓损伤后内源性垂体腺苷酸环化酶激活肽表达的变化

目的:观察大鼠脊髓损伤后垂体腺苷酸环化酶激活肽表达的变化,分析其在脊髓损伤中的意义,为进一步探索脊髓损伤后的再生修复机制和神经营养因子治疗脊髓损伤提供实验依据。方法:实验于2005-10/2006-09在汕头大学医学院生殖医学研究中心完成。①实验分组:选择清洁级健康成年雌性SD大鼠66只,随机抽签法分为损伤后1,3,7,14,28d组以及正常对照组,每组11只。②实验方法:改良的NYU装置制备脊髓损伤模型,对照组不做手术。损伤后1,3,7,14,28d麻醉取材。逆转录-聚合酶链反应扩增垂体腺苷酸环化酶激活肽。③实验评估:采用苏木精-伊红染色观察脊髓损伤后的病理变化,免疫组织化学检测阳性细胞计数,逆转录-聚合酶链反应及蛋白免疫印迹方法检测脊髓组织中垂体腺苷酸环化酶激活肽蛋白及mRNA的表达情况。结果:纳入66只大鼠,均进入结果分析。①在蛋白和mRNA水平垂体腺苷酸环化酶激活肽表达呈时间相关性,正常对照组可见垂体腺苷酸环化酶激活肽mRNA和蛋白的少量表达,脊髓损伤后1d表达开始增加,7d时表达明显增加,与3d时比较差异有显著性意义(P<0.05)。②苏木精-伊红染色结果可见脊髓灰质出血水肿坏死,神经细胞变性死亡,免疫组织化学显示正常对照组神经元中有垂体腺苷酸环化酶激活肽阳性表达,损伤后垂体腺苷酸环化酶激活肽的表达逐渐增高,损伤7d时垂体腺苷酸环化酶激活肽表达明显增加(P<0.05),至28d时表达仍较高。结论:损伤后垂体腺苷酸环化酶激活肽表达增加,内源性垂体腺苷酸环化酶激活肽的增加可能有利于受损脊髓神经元的存活与再生。     

微囊化兔许旺细胞移植脊髓损伤大鼠:碱性成纤维细胞生长因子表达和后肢运动功能的变化

背景:研究表明微囊化兔许旺细胞移植于大鼠损伤脊髓后,能减轻炎症反应,促进脊髓再生,但具体作用途径尚不完全清楚.目的:观察微囊化兔许旺细胞移植于损伤大鼠脊髓后,碱性成纤维细胞生长因子的表达以及后肢运动功能的恢复.方法:取家兔坐骨神经以双酶消化法制成许旺细胞悬液后,再用气体喷入法制成海藻酸钡-许旺细胞微囊.同法制备不包被许旺细胞的空囊.SD大鼠随机分为4组:细胞组、空囊组、微囊组建立脊髓半横断损伤模型,分别于损伤处植入明胶海绵吸附的10 μL许旺细胞悬液、10 μL空囊、10 μL海藻酸钡-许旺细胞微囊;正常组不做任何干预.采用BBB评分观察大鼠后肢运动功能恢复情况,制作脊髓标本切片通过苏木精-伊红染色和尼氏染色行病理学检查,免疫组织化学染色观察碱性成纤维细胞生长因子的表达变化.结果与结论:造模后即刻大鼠右后肢出现瘫痪;材料移植后7,14,28 d,微囊组大鼠后肢运动功能明显恢复,BBB评分明显优于细胞组、空囊组(P<0.05或P<0.01).碱性成纤维细胞生长因子阳性细胞主要见于神经元细胞的胞浆及胶质细胞的胞核内.材料移植后第1,3,7天,胶质细胞主要在脊髓损伤附近处表达,其中第3天表达量最大;第14天在神经元细胞的胞浆内可见碱性成纤维细胞生长因子表达,微囊组表达程度明显高于细胞组、空囊组;之后各组表达程度均明显下降.提示微囊化兔许旺细胞移植于损伤大鼠脊髓后,可以抑制异种移植后免疫排斥,减轻炎症反应,增加碱性成纤维细胞生长因子表达,促进后肢功能恢复和脊髓再生.     

微囊化兔坐骨神经组织细胞移植对大鼠损伤脊髓胶质纤维酸性蛋白表达的作用

目的:观察脊髓损伤大鼠进行微囊化兔坐骨神经组织细胞移植后胶质纤维酸性蛋白表达的变化。方法:实验于2004-03/2005-02在江西医学院人体解剖学教研室应用解剖研究室完成。①选取健康成年家兔10只,用于制备坐骨神经组织细胞。②选取健康成年SD大鼠130只,随机分为4组:正常对照组10只、损伤对照组40只、细胞悬液组40只、微囊组40只。③损伤对照组、细胞悬液组、微囊组大鼠均建立脊髓半横断伤模型,于损伤处分别植入明胶海绵、明胶海绵吸附的10μL细胞悬液、明胶海绵吸附的10μL微囊化坐骨神经组织细胞。移植前后均不使用免疫抑制剂。正常对照组未给予材料移植。④损伤对照组、细胞悬液组、微囊组大鼠分别于术后3,7,14,28d取材,每时相点10只,行免疫组织化学染色,观察胶质纤维酸性蛋白表达的变化。结果:实验选取健康成年SD大鼠130只,全部进入结果分析。①术后各组脊髓切片炎性反应苏木精染色结果:脊髓损伤后3d,损伤对照组和细胞悬液组可见明显核固缩,部分神经元萎缩变小,神经元数量减少,细胞边界模糊不清,并有大量巨噬细胞浸润;第7天损伤对照组和细胞悬液组炎性反应进一步加剧,有大量的噬中性粒白细胞浸润,但微囊组少见;第14天损伤对照组和细胞悬液组胶质细胞明显增生、肥大,炎性反应减轻,神经元的形态有所恢复,而微囊组炎性反应较轻,胶质细胞增生减少。②术后各组脊髓切片胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色结果:正常对照组可见胶质纤维酸性蛋白染色阳性细胞,空白及阴性对照染色未见阳性反应。损伤对照组和细胞悬液组术后3,7,14d内胶质纤维酸性蛋白的表达呈进行性增高趋势,28d回落。微囊组术后7,14,28d胶质纤维酸性蛋白的表达显著低于损伤对照组、细胞悬液组(P<0.01)。结论:微囊化异种坐骨神经组织细胞移植能抑制损伤脊髓胶质纤维酸性蛋白的表达,减轻由反应性胶质化所形成的胶质瘢痕。     

聚集素在大鼠急性脊髓损伤后神经功能康复过程中的表达

背景:聚集素具有许多重要的生物学功能,特别是病理条件下对组织细胞具有显著的保护作用。观察聚集素在脊髓损伤中的表达变化将有助于明确继发性脊髓损伤的作用途径并提供可能的治疗手段。目的:观察急性脊髓损伤组织中聚集素的表达变化。设计:随机对照动物实验。单位:中国医科大学附属第一医院骨科。材料:实验于2003-01/2006-01在中国医科大学实验动物部完成。选择成年健康SD大鼠65只,体质量250～300g,由中国医科大学实验动物部提供。方法:65只大鼠随机分为3组,即脊髓损伤组、假手术组及正常对照组,各组分别为30,30及5只。采用改良Allen重物打击法制备大鼠脊髓背侧损伤模型,损伤部位为T10节段;假手术组仅行T10全椎板切除;正常对照组未手术。脊髓损伤组和假手术组分别分为伤后及术后12h,1,3,7,14,21d共6个时间点,每个时间点麻醉处死5只。分别在伤后不同时间点对各组大鼠脊髓损伤组织取材制成冰冻切片,进行苏木精-伊红染色观察脊髓损伤组织变性坏死情况,进行聚集素免疫组化染色观察聚集素阳性反应物的沉积、分布情况,应用半定量图像分析法测定聚集素阳性反应物的平均灰度值(与聚集素免疫反应强度呈反比)。主要观察指标:①各组大鼠脊髓损伤组织变性坏死情况及聚集素阳性表达情况。②各组大鼠脊髓损伤组织聚集素阳性反应物平均灰度值。结果:65只大鼠全部进入结果分析,无脱失。①脊髓损伤组大鼠损伤后1d聚集素阳性表达增加;伤后7d达到高峰;伤后14d逐渐减少;伤后21d趋于稳定,随时间延长存在动态变化过程。假手术组及正常对照组伤后各时间点均有聚集素阳性表达,但均表达稳定,随时间延长无动态变化过程。②脊髓损伤组在伤后1,3,7,14,21d时聚集素阳性反应物的平均灰度值显著低于假手术组相应时间点及正常对照组(t=6.33～15.57,P<0.01);而假手术组伤后各时间点聚集素阳性反应物的平均灰度值与正常对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:聚集素在急性脊髓损伤组织中表达明显增加,并且存在动态变化过程。     

微囊化兔坐骨神经组织细胞移植对大鼠损伤脊髓胶质纤维酸性蛋白表达的作用

目的：观察脊髓损伤大鼠进行微囊化兔坐骨神经组织细胞移植后胶质纤维酸性蛋白表达的变化。 方法：实验于2004-03／2005—02在江西医学院人体解剖学教研室应用解剖研究室完成。①选取健康成年家兔10只，用于制备坐骨神经组织细胞。②选取健康成年SD大鼠130只，随机分为4组：正常对照组10只、损伤对照组40只、细胞悬液组40只、微囊组40只。③损伤对照组、细胞悬液组、微囊组大鼠均建立脊髓半横断伤模型，于损伤处分别植入明胶海绵、明胶海绵吸附的10μL细胞悬液、明胶海绵吸附的10μL微囊化坐骨神经组织细胞。移植前后均不使用免疫抑制剂。正常对照组未给予材料移植。④损伤对照组、细胞悬液组、微囊组大鼠分别于术后3。7，14，28d取材，每时相点10只，行免疫组织化学染色，观察胶质纤维酸性蛋白表达的变化。 结果：实验选取健康成年SD大鼠130只，全部进入结果分析。①术后各组脊髓切片炎性反应苏木精染色结果：脊髓损伤后3d，损伤对照组和细胞悬液组可见明显核固缩，部分神经元萎缩变小，神经元数量减少，细胞边界模糊不清，并有大量巨噬细胞浸润；第7天损伤对照组和细胞悬液组炎性反应进一步加剧，有大量的噬中性粒白细胞浸润，但微囊组少见；第14天损伤对照组和细胞悬液组胶质细胞明显增生、肥大，炎性反应减轻，神经元的形态有所恢复，而微囊组炎性反应较轻，胶质细胞增生减少。②术后各组脊髓切片胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色结果；正常对照组可见胶质纤维酸性蛋白染色阳性细胞，空白及阴性对照染色未见阳性反应。损伤对照组和细胞悬液组术后3，7，14d内胶质纤维酸性蛋白的表达呈进行性增高趋势，28d回落。微囊组术后7，14，28d胶质纤维酸性蛋白的表达显著低于损伤对照组、细胞悬液组（P〈0?     

聚集素在大鼠急性脊髓损伤后神经功能康复过程中的表达

背景：聚集素具有许多重要的生物学功能，特别是病理条件下对组织细胞具有显著的保护作用。观察聚集素在脊髓损伤中的表达变化将有助于明确继发性脊髓损伤的作用途径并提供可能的治疗手段。 目的：观察急性脊髓损伤组织中聚集素的表达变化。 设计：随机对照动物实验。 单位：中国医科大学附属第一医院骨科。 材料：实验于2003-01／2006-01在中国医科大学实验动物部完成。选择成年健康SD大鼠65只，体质量250-300g，由中国医科大学实验动物部提供。 方法：65只大鼠随机分为3组，即脊髓损伤组、假手术组及正常对照组，各组分别为30，30及5只。采用改良Allen重物打击法制备大鼠脊髓背侧损伤模型，损伤部位为T10节段；假手术组仅行T10全椎板切除；正常对照组未手术。脊髓损伤组和假手术组分别分为伤后及术后12h，1，3，7，14，21d共6个时间点，每个时间点麻醉处死5只。分别在伤后不同时间点对各组大鼠脊髓损伤组织取材制成冰冻切片，进行苏木精-伊红染色观察脊髓损伤组织变性坏死情况，进行聚集素免疫组化染色观察聚集素阳性反应物的沉积、分布情况，应用半定量图像分析法测定聚集素阳性反应物的平均灰度值（与聚集素免疫反应强度呈反比）。 主要观察指标：①各组大鼠脊髓损伤组织变性坏死情况及聚集素阳性表达情况。②各组大鼠脊髓损伤组织聚集素阳性反应物平均灰度值。 结果：65只大鼠全部进入结果分析，无脱失。①脊髓损伤组大鼠损伤后1d聚集素阳性表达增加；伤后7d达到高峰；伤后14d逐渐减少；伤后21d趋于稳定，随时间延长存在动态变化过程。假手术组及正常对照组伤后各时间点均有聚集素阳性表达，但均表达稳定，随时间延长无动态变化过程。②脊髓损伤组在伤后1，3，7，14，21d时聚集素阳性反应物的平均灰度值显著低于假手术组相应时间点及正常对照组（t=6．33-15．57，P〈0．01）；而假手术组伤后各时间点聚集素阳性反应物的平均灰度值与正常对照组比较差异无显著性意义（P〉0．05）。 结论：聚集素在急性脊髓损伤组织中表达明显增加，并且存在动态变化过程。     

许旺细胞修复大鼠脊髓损伤:静脉移植的可行性及优势

背景:目前细胞移植是修复脊髓损伤的研究热点之一,许旺细胞能够分泌多种神经营养因子,改善损伤局部微环境,大量相关文献证实了其能够促进脊髓损伤后功能的恢复.针对治疗脊髓损伤的细胞移植方法很多,其中静脉移植具有操作方便、能够避免传统移植方法造成的附加损伤等优点.目的:探讨许旺细胞尾静脉移植修复大鼠脊髓损伤的疗效.方法:体外分离Wistar大鼠双侧坐骨神经,植块法培养,S-100染色鉴定,Hoechst33342标记许旺细胞.Impactor model-Ⅱ打击仪制作 Wistar大鼠T10脊髓损伤模犁60只,随机分为3组,空白对照组术后未作处理,DMEM对照组、许旺细胞移植组术后1周分别尾静脉注射1 mL.DMEM或1 mL.许旺细胞.术前1 d,术后1,3 d,1周及以后每周进行BBB评分.移植后1,2,4周取材行冰冻切片观察移植许旺细胞的迁移.移植后8周取材行苏木精-伊红染色及免疫荧光染色观察损伤段胶质原纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶的表达.结果与结论:经纯化鉴定获得纯度为95%的许旺细胞.移植后1,2,4周损伤段及邻近节段脊髓内可观察到Hoechst33342阳性细胞.术后4周,许旺细胞移植组与空白对照组、DMEM对照组BBB评分差异开始有显著性意义(P<0.05),且许旺细胞移植组高于空白对照组、DMEM对照组.苏木精-伊红染色示各组均有脊髓空洞形成,许旺细胞移植组空洞小于空白对照组、DMEM对照组.免疫组织化学染色示空白对照组、DMEM对照组胶质原纤维酸性蛋白反应较强,许旺细胞移植组胶质原纤维酸性蛋白阳性面积小于其他组(P<0.05);许旺细胞移植组神经元特异性烯醇化酶的阳性面积明显大于其他组(P<0.05).提示静脉移植许旺细胞修复大鼠脊髓损伤是可行的,操作简便,且有较好的疗效.     

构建还原论式大鼠脊髓全横断损伤模型的性别影响

目的:建立保留血液供应的大鼠还原论式脊髓全横断损伤模型,探讨性别因素对其实验模型构建和应用的影响。方法:实验于2003-06/2004-12在解放军第四军医大学全军神经科学研究所实验室完成。选择一级SD大鼠90只,雄50只,雌40只,体质量225～250g。分成雄鼠1组40只,雄鼠2组10只,雌鼠组40只,用切割辅以吸除的方法全横断脊髓,保留脊髓腹、背动脉和背静脉,雄鼠2组致伤后即刻处死取材,雄鼠1组和雌鼠组观察6周后处死取材。雄鼠2组行苏木精-伊红染色观察损伤区脊髓离断情况,雄鼠1组和雌鼠组行苏木精-伊红染色、神经丝和胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学染色、生物素化的葡萄糖胺追踪实验观察损伤区脊髓离断情况,行Bas-so-Beattie-Bresnahan(BBB)运动功能评定并记录病死率、压疮发生率。结果:进入BBB运动功能结果分析雄鼠1组和雌鼠组分别为27只和37只大鼠,雄鼠1组脱失13只,雌鼠组脱失3只。①雄鼠2组苏木精-伊红染色显示大鼠脊髓完全横断且保留了脊髓腹、背动脉和背静脉。雄鼠1组和雌鼠组的苏木精-伊红染色、神经丝和胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学染色、生物素化的葡萄糖胺追踪实验均显示两组模型损伤区脊髓离断完全,无组织残留,两组间差异无显著性意义(P>0.05);两组BBB运动功能评分结果差异也无显著性意义(P>0.05)。②雄     

三种尼氏小体染色方法对放疗后犬脊髓神经元显示效果的比较

目的:探讨建立理想显示神经元微细结构的方法.方法:在10～14 d内,对18只比格犬胸9～10椎体给予总剂量为60 Gy的放疗.放射治疗结束3个月后,将18只比格犬以随机数字表法随机分为A、B、C组,每组6只,各组犬活杀后取脊髓并行横断切片,A组采用苏木精一伊红染色,B组采用传统ToluidineBlue染色(甲苯胺蓝染色).C组采用改进的Toluidine Blue染色法显示神经元结构.结果:苏木精一伊红染色后神经元结构不清晰.尼氏小体模糊.传统Toluidine Blue染色后组织切片全部为蓝色,对比度较差.改进后的Toluidine Blue染色后,尼氏小体、胞核及轴突、树突都清晰可见,且视野红蓝颜色相匹配,清晰度好,分辨率高.经病理图像及分析系统统计,改进后Toluidine Blue染色后组脊髓神经元内尼氏小体表达量与其他两组有差异(P<0.05),结果优于其他两组.结论:光镜下,改进的Toluidine Blue染色法的组织切片分辨率、美观度、清晰度较苏木精-伊红染色和传统的Toluidine Blue染色法的更好,更能清楚显示神经元的结构特征.该技术灵敏、准确、重现性好,可应用于放疗对脊髓神经元损伤的研究.     

睫状神经营养因子对坐骨神经切断吻合后大鼠脊髓前角胶质纤维酸性蛋白表达的影响

背景:睫状神经营养因子具有多种生物活性,在神经系统发育、分化和损伤修复中具有重要意义.目的:观察睫状神经营养因子对坐骨神经切断吻合后大鼠相应脊髓节段前角星形胶质细胞的特异标记物胶质纤维酸性蛋白表达的影响.方法:将SD大鼠随机分为对照组、模型组、生理盐水组及药物组.除对照组外,对所有大鼠实施双侧坐骨神经切断吻合术,药物组手术区局部注射睫状神经营养因子100 ng/kg,1次/d,生理盐水组局部注射等量生理盐水.术后1,3,7,14,21,28 d取相应脊髓节段,免疫组织化学染色观察胶质纤维酸性蛋白的表达,苏木精伊红染色、TUNEL染色对脊髓前角神经元进行计数.结果与结论:大鼠坐骨神经切断吻合后相应脊髓节段星形胶质细胞胞体大,突起分枝多且粗大,神经元数目逐渐减少,凋亡神经元增多,胶质纤维酸性蛋白表达增高.与模型组和生理盐水组比较,药物组神经元存活数目增多,凋亡减少,胶质纤维酸性蛋白表达明显增加(P<0.05或P<0.01).同时,药物组大鼠的运动功能障碍较轻,恢复较快.说明睫状神经营养因子可以通过促进大鼠脊髓前角胶质纤维酸性蛋白的表达起到神经保护作用.     

脊髓全横断大鼠神经生长因子和脑源性神经营养因子表达及三七皂苷的干预效应

目的:神经生长因子和脑源性神经营养因子同属神经营养素家族,在神经系统发育及维持正常神经元功能中有重要作用。实验拟证实脊髓全横断损伤三七皂苷对大鼠神经生长因子及脑源性神经营养因子蛋白水平的表达变化产生了影响。方法:实验于2005-06/09在昆明医学院神经科学研究所完成。①实验材料:清洁级健康雌性SD大鼠72只,质量(200±20)g;三七皂苷由云南植物药业提供。②分组及实验过程:大鼠被随机分为4组:假手术组、单纯脊髓全横断损伤组、脊髓全横断损伤 生理盐水(0.5mL/次)组、脊髓全横断损伤 三七皂苷(100mg/kg/次)组,每组18只。于T10水平横断大鼠脊髓,假手术组仅剪开硬脊膜而不损伤脊髓。后2组于术后30min,4,24,48,72h腹腔注射给药各1次。③实验评估:各组于术后3,7及21d分别取6只大鼠L1～2段脊髓制作冰冻切片,采用免疫组织化学ABC法染色。观察并计数脊髓腹角神经生长因子、脑源性神经营养因子蛋白的表达变化;常规苏木精伊红染色观察脊髓的组织病理变化。结果:72只大鼠全部进入结果分析:①脊髓全横断损伤后脊髓出现明显的神经变性坏死、炎性浸润等病理变化,三七皂苷可减轻这些变化。②神经生长因子蛋白主要分布于灰质神经元胞浆及胶质细胞胞核中。在正常脊髓有少量表达,脊髓损伤后7d表达明显升高,直到伤后21d仍高于假手术组(P<0.05);三七皂苷可明显促进其表达,伤后3,7d均明显高于其他各组(P<0.05),在21d时下降但仍高于假手术组(P<0.05)。③脑源性神经营养因子蛋白主要分布于腹角的运动神经元胞浆中,胶质细胞未见着色。在正常脊髓有少量表达,脊髓损伤后7d表达明显升高(P<0.05),伤后21d已下降,同假手术组相比差异无显著性(P>0.05);三七皂苷可明显促进其表达,伤后3,7,21d均明显高于所有对照组(P<0.05)。结论:三七皂苷可减轻脊髓横断性损伤后继发损害,增加神经生长因子、脑源性神经营养因子表达量及提前神经生长因子、脑源性神经营养因子表达时间,提示其可以促进脊髓损伤早期修复。     

微管蛋白、水通道蛋白4和K~+通道蛋白4.1在大鼠脊髓损伤后不同时间的表达变化

目的探究微管骨架、水通道蛋白4(AQP4)和K+通道4.1(Kir4.1)在大鼠急性脊髓损伤后的时间变化规律。方法 90只成年雌性Sprague-Dawley大鼠,随机分组为假手术组(n=30)和损伤组(n=60),损伤组设6 h、1 d、3d、5 d、7 d,每个亚组12只大鼠。用Allen打击法制备T10打击损伤模型。损伤后各时间点各组行脊髓含水量检测、脊髓HE染色,观察急性脊髓损伤后的病理变化;行微管蛋白、AQP4和Kir4.1免疫组织化学染色和Western blotting检测,观察急性损伤后三组蛋白的表达变化及相对灰度值分析。结果损伤组各时间点脊髓含水量均高于假手术组(P0.05),且5 d时最高。HE染色显示,损伤后6 h,灰质主要以出血为主;损伤后1 d,灰质出血严重,神经元肿胀加重;损伤后3 d,灰质坏死面积加大,水肿现象明显;损伤后5 d、7 d,灰质坏死更加明显,水肿现象更加严重。Western blotting和免疫组织化学染色结果显示,损伤后AQP4在灰质表达逐渐增高,且5 d表达为高峰,微管蛋白和Kir4.1表达趋势基本相同,为损伤后表达逐渐下降,5 d表达最低。结论脊髓损伤后微管蛋白表达与Kir4.1表达趋势相似,与AQP4表达趋势相反,可能共同参与水肿形成。     

大鼠脊髓损伤后肾上腺髓质素的表达及重组人红细胞生成素的干预作用

目的：观察肾上腺髓质素在大鼠脊髓损伤组织中的表达，并分析重组人红细胞生成素的干预作用。 方法：实验于2005-06／10在协和医院骨科中心实验室完成。选择70d健康SD大鼠54只，随机数字法分为假手术组、脊髓损伤模型组、重组人红细胞生成素组3组。采用Allen’s WD法-自制圆柱状金属棒沿细玻璃导管垂直自由落下，制成大鼠急性脊髓损伤动物模型，金属棒重量8．5g，高度5cm，损伤能量8．5&;#215;5（g&;#183;cm）。重组人红细胞生成素组损伤后1，3，5，7，9d分别给予600U／kg重组人红细胞生成素尾静脉注射。脊髓损伤模型组损伤后相同时间点给予等量的生理盐水。假手术组只切除椎板暴露脊髓。损伤动物模型以摆尾反射，双下肢对称性抽搐为成功标志。分别在术后3，6和11d采用改良Tarlov评分并改良Rivlin与Tator斜板法评分进行运动功能评定，每个时间点6只。苏木精-伊红染色观察脊髓损伤情况。免疫组化染色观察肾上腺髓质素的表达。 结果：54只大鼠均进入结果分析。①各组大鼠脊髓损伤情况：假手术组各时间点取材无明显异常。脊髓损伤模型组伤后3d，灰质内出现大量红细胞，神经元细胞肿胀呈圆形，大量核固缩、核碎裂，灰白质交界消失，灰质内空洞形成；伤后6d，红细胞融合成团，灰白质交界较清楚，残存神经元明显减少，轻微肿胀，仍见少量中性粒细胞，11d灰白质交界清楚，残存神经元形态基本正常。重组人红细胞生成素组各时间点病理变化明显轻于脊髓损伤模型组。②肾上腺髓质素的表达：肾上腺髓质素表达主要位于神经元中，假手术组各时间点肾上腺髓质素低表达，各时间点灰度值差异无显著性意义；脊髓损伤模型组、重组人红细胞生成素组神经元数量较假手术组减少，肾上腺髓质素表达增强，重组人红细胞生成素组最强。伤后6，lld均恢复到正常表达。脊髓损伤模型组、重组人红细胞生成素组3d的灰度值均高于假手术组，重组人红细胞生成素组灰度值高于脊髓损伤模型组，差异均有非常显著性意义（P〈0．01）。⑨改良Tarlov评分结果：脊髓损伤模型组及重组人红细胞生成素组3，6，11d的改良Tarlov评分均显著低于假手术组相同时间点评分（P〈0．01）；重组人红细胞生成素组3，6，11d改良Tarlov评分均高于脊髓损伤模型组相同时间点的评分（P〈0．05）。④改良Rivlin与Tator法评分结果：脊髓损伤模型组、重组人红细胞生成素组3，6，11d改良Rivlin与Tator法评分均显著低于假手术组相同时间点评分，差异有非常显著性意义（P〈0．01）；重组人红细胞生成素组3，6，11d改良Rivlin与Tator法评分均高于脊髓损伤模型组相同时间点的评分，差异有非常显著性意义（P〈0．01） 结论：急性脊髓损伤后肾上腺髓质素表达代偿性增高，肾上腺髓质素参与了脊髓损伤的发生发展过程并在其中起着抗氧化作用，重组人红细胞生成素能够减轻脊髓的继发性损伤，其治疗作用的机制之一可能是通过促进肾上腺髓质素表达增高而实现的。     

大鼠脊髓损伤后肾上腺髓质素的表达及重组人红细胞生成素的干预作用

目的:观察肾上腺髓质素在大鼠脊髓损伤组织中的表达,并分析重组人红细胞生成素的干预作用。方法:实验于2005-06/10在协和医院骨科中心实验室完成。选择70d健康SD大鼠54只,随机数字法分为假手术组、脊髓损伤模型组、重组人红细胞生成素组3组。采用Allen’sWD法-自制圆柱状金属棒沿细玻璃导管垂直自由落下,制成大鼠急性脊髓损伤动物模型,金属棒重量8.5g,高度5cm,损伤能量8.5×5(g·cm)。重组人红细胞生成素组损伤后1,3,5,7,9d分别给予600U/kg重组人红细胞生成素尾静脉注射。脊髓损伤模型组损伤后相同时间点给予等量的生理盐水。假手术组只切除椎板暴露脊髓。损伤动物模型以摆尾反射,双下肢对称性抽搐为成功标志。分别在术后3,6和11d采用改良Tarlov评分并改良Rivlin与Tator斜板法评分进行运动功能评定,每个时间点6只。苏木精-伊红染色观察脊髓损伤情况。免疫组化染色观察肾上腺髓质素的表达。结果:54只大鼠均进入结果分析。①各组大鼠脊髓损伤情况:假手术组各时间点取材无明显异常。脊髓损伤模型组伤后3d,灰质内出现大量红细胞,神经元细胞肿胀呈圆形,大量核固缩、核碎裂,灰白质交界消失,灰质内空洞形成;伤后6d,红细胞融合成团,灰白质交界较清楚,残存神经元明显减少,轻微肿胀,仍见少量中性粒细胞,11d灰白质交界清楚,残存神经元形态基本正常。重组人红细胞生成素组各时间点病理变化明显轻于脊髓损伤模型组。②肾上腺髓质素的表达:肾上腺髓质素表达主要位于神经元中,假手术组各时间点肾上腺髓质素低表达,各时间点灰度值差异无显著性意义;脊髓损伤模型组、重组人红细胞生成素组神经元数量较假手术组减少,肾上腺髓质素表达增强,重组人红细胞生成素组最强。伤后6,11d均恢复到正常表达。脊髓损伤模型组、重组人红细胞生成素组3d的灰度值均高于假手术组,重组人红细胞生成素组灰度值高于脊髓损伤模型组,差异均有非常显著性意义(P<0.01)。③改良Tarlov评分结果:脊髓损伤模型组及重组人红细胞生成素组3,6,11d的改良Tarlov评分均显著低于假手术组相同时间点评分(P<0.01);重组人红细胞生成素组3,6,11d改良Tarlov评分均高于脊髓损伤模型组相同时间点的评分(P<0.05)。④改良Rivlin与Tator法评分结果:脊髓损伤模型组、重组人红细胞生成素组3,6,11d改良Rivlin与Tator法评分均显著低于假手术组相同时间点评分,差异有非常显著性意义(P<0.01);重组人红细胞生成素组3,6,11d改良Rivlin与Tator法评分均高于脊髓损伤模型组相同时间点的评分,差异有非常显著性意义(P<0.01)结论:急性脊髓损伤后肾上腺髓质素表达代偿性增高,肾上腺髓质素参与了脊髓损伤的发生发展过程并在其中起着抗氧化作用,重组人红细胞生成素能够减轻脊髓的继发性损伤,其治疗作用的机制之一可能是通过促进肾上腺髓质素表达增高而实现的。     

MKP-1蛋白在急性脊髓损伤中的作用

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP-1))在大鼠脊髓损伤后表达的变化及其意义.方法 20只SD大鼠随机分为实验组及假手术对照组.实验组采用改良Allen'S打击法制作脊髓损伤动物模型,假手术对照组同法暴露脊髓,但不损伤脊髓.两组大鼠术后24 h取手术段脊髓,用苏木精一伊红染色观察损伤脊髓组织病理变化和检测脊髓标本损伤段的MKP-1蛋白的表达的差异.结果 实验组脊髓HE染色显示存在大量出血坏死后形成的囊腔,组织和神经细胞水肿以及神经纤维溶解消失.免疫组化结果 发现,术后第24h实验组MKP-1阳性细胞数为(5.12±0.81)个/m2,阳性细胞密度为(104.58±6.32),MKP-1的表达量明显低于假手术对照组,差异均有统计学意义(t分别=17.24、8.75,P均＜0.05).结论 脊髓组织受重物打击后可下调MKP-1蛋白的表达,而这可能是脊髓损伤的机制之一.     

大鼠脊髓损伤后ski相关蛋白表达的时空变化规律及作用

目的探究大鼠脊髓损伤后ski相关蛋白(SKIP)的表达及其变化规律。方法 60只成年雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(n=30)和打击组(n=30),每组分为1 d、3 d、5 d、7 d、14 d五个时间点,各6只。打击组用Allen法制作T10打击损伤模型,假手术组只咬开椎板。采用BBB评分评价后肢运动功能;尼氏染色观察损伤后脊髓神经元的病理变化;免疫荧光染色观察损伤脊髓SKIP的表达情况。结果打击组各时间点BBB评分均显著低于假手术组(t48.267,P0.001)。与假手术组相比,打击组5 d脊髓神经元胞浆中尼氏小体开始崩解、凝聚,分布不规则,神经元变性坏死,14 d时损伤加重。免疫荧光染色显示,SKIP主要在脊髓灰质中表达,白质中极少表达;损伤后SKIP表达逐渐上升,5 d时达到高峰(t=-17.035,P0.001),14 d时明显降低(t=3.853,P0.05)。结论 SKIP可能是一种作用于神经元并影响其凋亡的新的信号分子。     

硬膜外注入亚甲蓝对腰椎脊髓及脊神经节结构的影响

背景：亚甲蓝可阻碍感觉神经的异常疼痛传导,其机制是阻断缓激肽诱导的痛觉过敏,消除局部组织炎症引起的痛觉过敏反应。目的：观察亚甲蓝溶液对大鼠腰椎脊髓及脊神经节功能的影响,明确亚甲蓝治疗椎间盘源性腰痛的安全性。方法：将120只Wistar大鼠随机分为5组,每组24只。暴露大鼠腰节段硬膜,亚甲蓝0.2 mL组、亚甲蓝1 mL组、亚甲蓝2 mL组分别于大鼠硬膜外注入相应量的亚甲蓝;生理盐水组大鼠硬膜外注入1 mL生理盐水;空白对照组不进行此步操作。分别在注入后30 min,2 h,24 h,72 h每组分别随机对6只大鼠进行灌流固定,并切除相应节段脊髓及神经节,行苏木精-伊红染色,在光镜下观察对比组织结构改变。结果与结论：亚甲蓝各组大鼠注入后30 min,2 h,24 h,72 h时间脊髓及神经根苏木精-伊红染色,显示脊髓背侧面结构完整,白质与灰质分界清晰,白质中神经纤维致密,纤维间有圆形或卵圆形的神经胶质细胞核;灰质后角神经纤维致密;神经元细胞,胞核圆形染色浅,核仁明显;细胞群间有成束的神经纤维。亚甲蓝各组大鼠腰椎脊髓及脊神经节与生理盐水组及空白对照组比较均无明显的组织结构变化。结果表明硬膜外注入1%亚甲蓝对脊髓及脊神经结构无明显影响。     

构建还原论式大鼠脊髓全横断损伤模型的性别影响

目的：建立保留血液供应的大鼠还原论式脊髓全横断损伤模型，探讨性别因素对其实验模型构建和应用的影响。方法：实验于2003-06／2004-12在解放军第四军医大学全军神经科学研究所实验室完成。选择一级SD大鼠90只，雄50只，雌40只，体质量225-250g。分成雄鼠1组40只，雄鼠2组10只，雌鼠组40只，用切割辅以吸除的方法全横断脊髓，保留脊髓腹、背动脉和背静脉，雄鼠2组致伤后即刻处死取材，雄鼠l组和雌鼠组观察6周后处死取材。雄鼠2组行苏木精-伊红染色观察损伤区脊髓离断情况，雄鼠1组和雌鼠组行苏木精-伊红染色、神经丝和胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学染色、生物素化的葡萄糖胺追踪实验观察损伤区脊髓离断情况，行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动功能评定并记录病死率、压疮发生率。结果：进入BBB运动功能结果分析雄鼠1组和雌鼠组分别为27只和37只大鼠，雄鼠1组脱失13只，雌鼠组脱失3只。①雄鼠2组苏木精-伊红染色显示大鼠脊髓完全横断且保留了脊髓腹、背动脉和背静脉。雄鼠l组和雌鼠组的苏木精-伊红染色、神经丝和胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学染色、生物素化的葡萄糖胺追踪实验均显示两组模型损伤区脊髓离断完全，无组织残留，两组间差异无显著性意义(P&;gt;0．05)；两组BBB运动功能评分结果差异也无显著性意义(P&;gt;0．05)。②雄鼠1组的病死率远高于雌鼠组(32．5％，7．5％)；雄鼠1组的压疮发生率为30％，而雌鼠组无压疮发生。结论：还原论式大鼠脊髓全横断模型损伤区无脊髓组织残留，且保留了血液供应，适用于脊髓再生的研究。大鼠性别因素对脊髓全横断损伤后组织学变化及运动功能恢复无明显影响，但雄鼠病死率、压疮发生率均高于雌鼠，不利于模型建立，所以应选用雌鼠为实验对象。