白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段的克隆及其作为基因表达内参照的应用

目的获取白纹伊蚊β-肌动蛋白基因序列并探讨其作为基因表达内参照的作用。方法根据昆虫β-肌动蛋白核苷酸序列的高度保守区设计引物,通过PCR的方法从白纹伊蚊C6/36细胞中扩增获得白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段,进一步通过RT-PCR的方法验证其在稳定转染空载体和40S核糖体蛋白S4(RPS4)基因的白纹伊蚊C6/36细胞中的表达。结果获得白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段,长911 bp,与其他几种蚊β-肌动蛋白基因对应序列的相似性在89%以上。在稳定转染空载体和RPS4基因的C6/36细胞中,均可稳定地扩增出目的基因。结论成功获得了白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段,并且该片段完全可以用作基因表达差异分析时的内参照基因。     

白纹伊蚊乙酰胆碱酯酶基因片段克隆及序列分析

目的 从白纹伊蚊基因组DNA中获得乙酰胆碱酯酶（AchE)基因片段及其DNA序列。方法 根据已知的果蝇和斯氏按蚊AchE氨基酸序列保守区域设计一对简并引物，利用简并引物对白纹伊蚊AchE基因片段进行扩增。PCR产物经T／A克隆，α互补筛选法筛选，碱裂解法提取出重组质粒DNA,并对之进行酶切鉴定和PCR鉴定。对重组质粒的阳性克隆进行DNA是序，利用互联网和PCGENE软件与部分已知物的AchE氨基酸序列进行同源性分析并构建进化系统树。结果 从白纹伊蚊基因组DNA中扩增出AchE基因片段，其核酸序列共394bp，根据内含子特性确定内含子位置后，所得基因的氨基酸序列共107个氨基酸残基，并含有AchE的特征性保守序列FGESAG。同源性分析表明，其与埃及伊蚊相应片段的同源性最高（96％），其次为斯氏按蚊（87％），与黑腹果蝇则较低（69％）。结论 从白纹伊蚊敏感株中获得了AchE基因片段，DNA序列及其特征。该片段与埃及伊蚊相应片段同源性最高。     

广州市白纹伊蚊细胞色素C氧化酶亚基Ι基因遗传多态性分析

目的 探索广州市白纹伊蚊线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因（COI）序列的特征,分析同一城市不同环境下白纹伊蚊的遗传变异。方法 单蚊抽提广州市不同点采集的白纹伊蚊基因组DNA,扩增细胞色素C氧化酶亚基I基因片段,联合单链构象多态性PCR（PCR-SSCP）技术分析COI基因片段多态性并筛选部分样品进行克隆测序,用软件比对分析序列的差异。结果 广州市不同采样点白纹伊蚊PCR扩增后获得709bp的COI基因部分序列,序列分析出现12个变异位点,变异率为1.69%。聚类分析显示广州株白纹伊蚊不同采样点的群体间出现部分分化。结论 广州市不同采样点的白纹伊蚊线粒体COI基因出现部分遗传多态性,可能与城市化发展下白纹伊蚊孳生环境的变化有一定关系。     

白纹伊蚊乙酰胆碱酯酶基因片段克隆及序列分析

目的　从白纹伊蚊基因组 DNA中获得乙酰胆碱酯酶 ( Ach E)基因片段及其 DNA序列。　方法　根据已知的果蝇和斯氏按蚊 Ach E氨基酸序列保守区域设计一对简并引物 ,利用简并引物对白纹伊蚊 Ach E基因片段进行扩增。PCR产物经 T/ A克隆 ,α互补筛选法筛选 ,碱裂解法提取出重组质粒 DNA,并对之进行酶切鉴定和 PCR鉴定。对重组质粒的阳性克隆进行 DNA测序 ,利用互联网和 PCGENE软件与部分已知物种的 Ach E氨基酸序列进行同源性分析并构建进化系统树。　结果　从白纹伊蚊基因组 DNA中扩增出 Ach E基因片段 ,其核酸序列共 394bp,根据内含子特性确定内含子位置后 ,所得基因的氨基酸序列共 10 7个氨基酸残基 ,并含有 Ach E的特征性保守序列 FGESAG。同源性分析表明 ,其与埃及伊蚊相应片段的同源性最高 ( 96 % ) ,其次为斯氏按蚊 ( 87% ) ,与黑腹果蝇则较低 ( 6 9% )。　结论　从白纹伊蚊敏感株中获得了 Ach E基因片段、DNA序列及其特征。该片段与埃及伊蚊相应片段同源性最高。     

蚊抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定

目的 建立抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系。方法 采用PCR方法，以淡色库蚊抗药性品系CD-NA文库为模板，扩增出抗药性品系高表达的糜蛋白酶基因编码区；经T／A克隆测序鉴定后，亚克隆到真核表达载体piEl-3，构建重组昆虫细胞表达载体piEl-3／chy，经酶切和PCR鉴定后，与带有筛选标记的piEl-neo质粒共转染蚊细胞C6／36，通过G418选择培养，建立转染细胞系；用RT-PCR、Westernblotting鉴定糜蛋白酶基因的转录表达。结果 成功构建了真核表达载体piE1-3／chy，证明糜蛋白酶基因已转入C6／36细胞，建立了稳定转染细胞系，表达产物分子质量单位约30ku，与理论值相符。结论 稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究糜蛋白酶基因与抗药性的关系奠定了基础。     

白纹伊蚊乙酰胆碱酯酶基因片段克隆及鉴定

目的　从白纹伊蚊中分离、克隆及鉴定乙酰胆碱酯酶 (ACh E)基因片段。　方法　根据已知的果蝇和斯氏按蚊 ACh E氨基酸序列保守区域设计简并引物 ,对白纹伊蚊 ACh E基因片段进行扩增 ,将凝胶回收的 PCR产物经与 T-载体质粒连接进行 T/ A克隆 ,用α互补筛选法筛选重组质粒克隆 ,用碱裂解法提取重组质粒 DNA并对重组质粒进行酶切鉴定和 PCR鉴定。　结果与结论　获得与设计相符的白纹伊蚊 ACh E基因片段 PCR扩增产物并对其作出鉴定     

干扰白纹伊蚊羽化激素对C6/36细胞糖代谢的影响

目的观察干扰羽化激素对白纹伊蚊C6/36细胞糖代谢的影响。方法根据白纹伊蚊羽化激素基因设计RNAi干扰序列(EH-siRNA),转染白纹伊蚊C6/36细胞48 h后,用qRT-PCR检测细胞EH基因及糖代谢相关基因的转录水平,并检测细胞内糖原含量。结果 EH-siRNA干扰后,白纹伊蚊C6/36细胞EH基因的转录水平下降26.7%(P0.05);糖酵解途径中葡萄糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘油变位酶和烯醇酶基因的转录水平与阴性对照组相比,分别下降58.6%、55.4%和46.2%(均P0.05),柠檬酸循环中的柠檬酸合成酶和异柠檬酸脱氢酶的转录水平与阴性对照组比较差异均无统计学意义(均P0.05)。干预后白纹伊蚊C6/36细胞糖原含量为12.27 mg/10~4cell,与阴性对照组(21.38 mg/10~4cell)和空白对照组(27.66 mg/10~4cell)比较差异均有统计学意义(均P0.05)。结论白纹伊蚊羽化激素对C6/36细胞的糖代谢起调节作用,羽化激素干扰可降低C6/36细胞糖酵解关键酶的表达以及糖原的含量。     

preS2S/adw真核表达质粒构建及其表达的初步研究

目的：针对我国乙型肝炎（乙肝）病毒流行的血清型，采用美国药品及食物鉴定委员会承认的应用于疫苗临床使用的载体pVAX1，构建了肝病毒adw血清型核酸疫苗preS2S的真核表达质粒，对其在真核细胞中的表达进行初步研究。方法：采用PCR法扩增preS2S片段，插入pVAX1载体中，测定DNA序列后，转染SP2／0细胞，抽提转染后SP2／0细胞的总RNA，再用RT－PCR法扩增其中的preS2S片段，以检测其表达的基础，结果：测序证实了该片段为乙肝病毒adw型preS2S基因。PCR扩增法检测出的转染细胞中存在preS2S基因，结论：获得了adw血清型乙肝病毒preS2S的真核表达质粒，提示其能够在真核细胞中表达目的基因蛋白。     

福建省登革热监测点白纹伊蚊mtDNA-COI基因遗传多态性研究

目的探讨福建省登革热监测点白纹伊蚊线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mtDNA-COⅠ)基因序列特征和遗传多态性。方法选择福建省登革热监测点2015—2016年送检部分批次白纹伊蚊雌性成蚊,提取基因组DNA,扩增全长mtDNA-COⅠ基因片段并测序,分析基因特征并构建系统发育树。结果 PCR扩增mtDNA-CO Ⅰ基因共12个片段,测序得到的片段长度在1 476bp—1 494bp之间。与白纹伊蚊参比序列相比,同源性为99%,包含9个位点的碱基差异。根据不同单倍体型序列构建种系发育树,发现6个登革热监测点的白纹伊蚊分属3个单倍体型,即H02、H03、H08。结论确定福建省登革热监测点白纹伊蚊mtDNA-COⅠ基因存在9个单核苷酸差异位点,包括H02、H03、H08共3种单倍体型,为福建省虫媒病毒病监测及其防控提供技术支撑。     

登革病毒prM基因真核表达载体的构建及在白纹伊蚊细胞C6/36中的表达

目的　构建登革病毒prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达。方法　将prM基因亚克隆入真核表达载体 pEGFP -N3,转化大肠杆菌JM 10 9,筛选阳性克隆进行PCR及酶切鉴定 ,将获得的重组质粒以脂质体法转化白纹伊蚊C6 / 36细胞并使其表达 ,利用RT -PCR法检测目的基因的转录 ,Western -blot检测融合蛋白的表达。结果　成功构建了 pEGFP -prM重组质粒 ,RT -PCR证明 prM基因在蚊细胞内的转录 ,Western -blot检测到 prM -GFP融合蛋白的表达。结论　成功构建登革了病毒 prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达 ,为进一步研究细胞内免疫的分子机制及构建转基因蚊虫奠定了基础     

应用基因表达谱芯片技术筛选XTP6基因转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP6的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP6蛋白可能的分子生物学功能.方法设计并合成XTP6基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP6基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP6编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP6.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析的DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现21个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP6转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP6蛋白可能的生物学功能提供依据.     

乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1反式调节基因的筛选

目的应用表达谱基因芯片技术，研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子DNA结合蛋白1(SBP1)反式调节基因，阐明SBP1蛋白可能的分子生物学功能。方法设计并合成SBP1基因序列特异性的引物，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增SBP1基因片段，以常规的分子生物学技术将获得的SBP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-SBP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取mRNA，逆转录为cDNA，与转染空表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定，证实准确无误。提取高质量的mRNA，逆转录为cDNA，进行cDNA芯片分析。在1152个基因容量的表达谱芯片的筛选中，发现有12个基因表达水平显著上调，6个基因表达水平显著下调。结论应用基因表达谱芯片成功筛选了SBP1转染细胞后差异表达基因，为进一步阐明SBP1蛋白可能的生物学功能提供依据。     

福建省不同地理株白纹伊蚊rDNA ITS2基因多态性分析

目的探讨福建省不同地理环境白纹伊蚊rDNA ITS2基因序列特征。方法在闽东福鼎市、闽北武夷山市、闽中涵江区和闽南东山县分别现场采集5个点的白纹伊蚊幼虫,实验室饲养,收集羽化成蚊,用75%酒精-20℃保存,PCR特异扩增白纹伊蚊rDNAITS2,用生物信息系统进行白纹伊蚊rDNAITS2基因多态性的分析。结果 PCR特异扩增福建省4个不同地理环境白纹伊蚊rDNA ITS2,在琼脂凝胶电泳上获得500bp左右的扩增片段。序列分析福建不同地理环境的白纹伊蚊在rDNA ITS2表现了基因的多态性,其rDNA ITS2基因单核苷酸存在转换、颠换和缺失,而同一地理环境的5只白纹伊蚊rDNA ITS2基因序列没有差异。结论福建省不同地理区域的白纹伊蚊在rDNA ITS2区表现的遗传多态性,可能与蚊虫生态环境如海拔高度、气温、降雨量和湿度等有一定的关系。     

白纹伊蚊AGO2和Dcr-2基因片段克隆及各发育期转录水平分析

目的克隆白纹伊蚊(Aedes albopictus)RNA干扰通路相关AGO2和Dcr-2基因片段,并分析该蚊种不同发育阶段这2个基因片段的转录水平。方法根据埃及伊蚊(Ae.aegypti)AGO2和Dcr-2蛋白的氨基酸序列保守区设计简并引物,经RT-PCR从白纹伊蚊雌蚊总RNA中分别扩增AGO2和Dcr-2 cDNA,并与载体pMD18-T连接,转染大肠埃希菌(E.coli)后,筛选阳性克隆,测序并做Blastx分析。根据获得的白纹伊蚊AGO2和Dcr-2基因片段设计特异性引物,采用半定量RT-PCR分析白纹伊蚊卵、Ⅰ/Ⅱ龄幼虫、Ⅲ/Ⅳ龄幼虫、蛹、雄蚊和雌蚊中这2个基因的mRNA水平。结果获得的AGO2和Dcr-2 cDNA片段大小分别为326 bp和491 bp,登录号分别为JQ764670和JQ764671。Blastx分析结果显示,该2个序列编码的氨基酸序列与埃及伊蚊的AGO2和白纹伊蚊的Dcr-2氨基酸序列的同源性分别为91%和98%。AGO2和Dcr-2基因在白纹伊蚊不同发育阶段中均有转录,于雌蚊中的mRNA水平最高,分别为雄蚊中mRNA的3.1倍和15.5倍,显著高于其他各阶段的mRNA水平(P<0.05)。结论获得了白纹伊蚊AGO2和Dcr-2基因部分cDNA片段,并发现这2个基因在雌蚊中转录水平最高。     

福建省白纹伊蚊mtDNA-CO1基因的系统发育分析

目的调查福建省不同地域白纹伊蚊线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(mtDNA-CO1)基因的遗传多态性和系统发育关系。方法 2015-2017年采集福建省15个媒介监测点的白纹伊蚊成蚊和幼虫样品,提取基因组DNA,扩增全长mtDNA-CO1基因片段并测序,应用Mega6.0和DnaSP5.0软件做基因特征分析和系统发育分析。结果新得到54份白纹伊蚊mtDNA-CO1基因片段序列,用于分析的片段长度为1388 bp。样本间多序列比对显示8个核苷酸差异位点,单倍型多样性为0.746,核苷酸多样性为0.126%。根据单倍型参考序列构建系统发育树,确定福建省白纹伊蚊存在9种单倍型,即:H01、H02、H03、H04、H08、H09、H12、H17、H23,另有6条序列无法确定单倍型。结论根据mtDNA-CO1基因多样性,2015-2017年福建省媒介监测点采集白纹伊蚊分属9种单倍型,这对于当地白纹伊蚊的种群进化研究及相关虫媒病毒病防控具有重要参考价值。     

人核糖体蛋白S13与胃癌细胞多药耐药性的实验研究

目的 探讨人核糖体蛋白S13(RPS13)在胃癌多药耐药(MDR)机制中的作用。方法 采用RT-PCR法扩增RPS13 cDNA片段编码区序列全长，DNA重组技术构建正反义真核表达载体，经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，斑点杂交检测转染细胞mRNA水平的变化；MTT法测定细胞对化疗药物的敏感性，流式细胞仪检测细胞周期。结果 RT-PCR法成功扩增出RPS13 cDNA片段编码区序列全长，并构建正反义真核表达载体；斑点杂交试验证实：正义转染细胞RPS13 mRNA水平上调，反义转染细胞其mRNA水平下调。RPS13正义核酸转染SGC7901细胞后，细胞对阿霉素、5-氟尿嘧啶和长春新碱的敏感性降低；转染反义核酸后，耐药细胞对丝裂霉素和长春新碱的敏感性增加。细胞周期测定表明高表达RPS13后，G1期、S期和G2期细胞的比例分别为47．0％、33．2％和19．8％；低表达RPS13后，G1期、S期和G2期细胞的比例分别为62．9％、1、0％和36．1％。结论 RPS13参与胃癌耐药细胞SGC7901／VCR的多药耐药。     

淡色库蚊抗药性相关胰蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定

目的为进一步研究胰蛋白酶基因与抗药性的关系。方法采用PCR方法,以淡色库蚊抗性品系cDNA文库为模板,扩增出抗药性品系高表达的胰蛋白酶(trypsin)基因编码区。T/A克隆测序鉴定后,亚克隆到昆虫细胞表达载体pIE13,构建重组昆虫细胞表达载体pIE13/try。经酶切和PCR鉴定后,与带有筛选标记的pIE1neo质粒共转染蚊虫细胞C6/36,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞。用RTPCR、Westernblotting鉴定胰蛋白酶基因的转录表达。结果酶切和PCR鉴定表明,成功构建昆虫细胞表达载体pIE13/try;证实胰蛋白酶基因已转入C6/36细胞,并建立稳定转染细胞系,成功地表达目的基因。结论稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究胰蛋白酶与抗药性的关系提供了良好的实验基础。     

蚊抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定

目的建立抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系。方法采用PCR方法,以淡色库蚊抗药性品系cD NA文库为模板,扩增出抗药性品系高表达的糜蛋白酶基因编码区;经T/A克隆测序鉴定后,亚克隆到真核表达载体pIE13,构建重组昆虫细胞表达载体pIE13/chy,经酶切和PCR鉴定后,与带有筛选标记的pIE1neo质粒共转染蚊细胞C6/36,通过G418选择培养,建立转染细胞系;用RT PCR、Westernblotting鉴定糜蛋白酶基因的转录表达。结果成功构建了真核表达载体pIE13/chy,证明糜蛋白酶基因已转入C6/36细胞,建立了稳定转染细胞系,表达产物分子质量单位约30ku,与理论值相符。结论稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究糜蛋白酶基因与抗药性的关系奠定了基础。     

基因表达谱芯片技术筛选XTP4基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP4的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP4蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP4基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP4基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP4编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP4。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有21个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP4转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP4蛋白可能的生物学功能提供依据。     

先天性长QT综合征KCNQ1基因定点突变的研究

目的利用聚合酶链反应(PCR)技术对长QT综合征(LQTS)KCNQ1基因进行定点突变的研究。方法利用PCR定点突变技术，首先设计两对引物(包含预定的突变)，通过3轮PCR扩增，扩增出含有所需突变位点的片段，然后将片段克隆入T载体中，通过酶切连接的方法将突变点引入到pIRES2-EGFP-KCNQ1中，随后用Effectene转染试剂介导转染HEK293细胞。结果在真核表达载体pIRES2-EGFP—KCNQ1基础上获得了KCNQ1 cDNA C682T的突变体，测序结果表明在序列中发生了预期的突变。结论KCNQ1定点突变体的构建为进一步的功能研究奠定了基础。