氨基酸组成分析直接鉴定SDS-PAGE分离的蛋白质

蛋白质组学是后基因组时代研究的重要领域。蛋白质组研究的基本技术包括双向凝胶电泳分离技术、蛋白质鉴定技术、计算机图像数据处理与蛋白质组数据库构建等。氨基酸组成分析［1,2］作为蛋白质组研究中的鉴定方法之一,对质谱鉴定、N端氨基酸序列鉴定等具有补充及验证作用。蛋白质是由20种氨基酸通过肽键连接起来的生物大分子,测定蛋白质的氨基酸组成可获得蛋白质的基本信息。本研究以马心肌红蛋白和细胞色素C为样品,优化实验条件,以此建立一种高灵敏度、高准确度的鉴定双向凝胶电泳分离后的蛋白质点方法。该方法还可用于分析天然蛋白质、基因重组蛋白质。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 试剂丙烯酰胺、过硫酸胺、甘氨酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三氟醋酸(TFA)、无水醋酸钠均为国产分析纯;甲叉双丙烯酰胺为进口分装;乙腈、甲醇为色谱纯;邻苯二甲醛（OPA）溶液、氯甲酸芴甲酯(FMOC)溶液、标准氨基酸溶液、硼酸盐缓冲液（pH 10.2）购自Hewlett Packard公司;邻苯二甲醛、马心肌红蛋白、细胞色素C为Sigma公司产品。 1.1.2 仪器 Hewlett Packard 1100 HPLC自动氨基酸分析仪;转印仪为Bio-Rad 半干转印仪。 1.2 SDS-PAGE电泳 采用15%分离胶,5%浓缩胶;马心肌红蛋白、细胞色素C上样量均为10 μg;聚集电压85 V,1 h;分离电压105 V,3 h;考马斯亮蓝染色。 1.3 电转印 转印缓冲液：0.025 mol/L Tris,0.192 mol/L甘氨酸,20%甲醇;电转印条件：恒电压24 V,1 h。当凝胶上的蛋白质点转印到PVDF膜时,将PVDF膜用水多次漂洗,晾干,待用。 1.4 酸水解 切割PVDF膜上的蛋白质点,放入小玻璃管中,加6 mol/L盐酸400 μl,封口,110℃水解24 h。1.5 氨基酸的提取 将水解后小玻璃管中的样品转移至1 ml样品管中,用氮气吹尽盐酸,并减压抽干。加170 μl提取溶液（水、乙腈和0.1%TFA的比例为50∶100∶20）,充分振摇,超声10 min,除去PVDF膜,冷冻干燥。加40 μl硼酸盐缓冲液,混匀,离心,取上清液,浓缩。 1.6 氨基酸的测定 采用OPA/FMOC柱前衍生方法。色谱条件：色谱柱C18 ODS-Hypersil,5 μm,125 mm×4 mm;柱温40℃;检测波长338 nm,226 nm;流速1 ml/min,进样量1 μl。流动相A：0.02 mol/L醋酸钠,0.018%三乙胺,0.3%四氢呋喃,用10%醋酸调pH至7.2。流动相B：0.1 mol/L醋酸钠（pH 7.2）∶乙腈∶甲醇（20∶40∶40）。洗脱梯度：0.0 min,0%B;17 min,60%B;18.0 min,100%B;24.0 min,100%B;25.0 min,0%B。 1.7 数据库检索 采用Internet上ExPASy蛋白质数据库检索,软件为AACompIdent,选择匹配模型free constellation,按以下各氨基酸之间的摩尔比值输入计算机,Asx,Glx,Ser,Thr,Ala,Pro,Arg,Val,Ilu,Leu,His,Gly,Tyr,Phe。蛋白质酸水解后Cys和Trp几乎被完全破坏,Met,Lys大部分被破坏,因此不输入计算机。Asn和Gln水解后分别为Asp和Glu。     

小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白质组的初步研究

目的 提取小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白并利用双向凝胶电泳技术对其进行分离. 方法 提取小鼠肝细胞线粒体蛋白并利用金属磷酸盐亲和层析树脂富集磷酸化蛋白后,进行一维等电聚焦分离和二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,质谱鉴定感兴趣的蛋白点. 结果 成功提取了小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白,并通过双向凝胶电泳分离技术成功建立了小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白质组图谱. 结论 磷酸化蛋白纯化技术与二维凝胶电泳分离技术的结合是研究亚细胞器磷酸化蛋白质组的有效方法,为进一步全面鉴定和研究线粒体磷酸化蛋白的功能打下了基础.     

重型脑损伤大鼠脑组织蛋白质组差异表达

目的 寻找重型脑损伤(severe traumatic brain injury,sTBI)大鼠伤后不同时间的蛋白质组变化规律.方法 提取创伤后3,7和14 d的鼠脑组织总蛋白进行双向凝胶电泳,筛选和鉴定差异蛋白质点.结果 共筛选出17个差异蛋白质点,它们参与细胞代谢、应激与炎症反应等过程.结论 利用双向凝胶电泳技术可寻找到多种参与重型脑损伤病程演进的蛋白质.     

线粒体蛋白质组分离鉴定策略及数据诠释

线粒体功能和蛋白质组的改变可以导致各种退化性疾病如心肌病、衰老和癌症的发生，因此线粒体蛋白质组研究日显重要。线粒体纯度是困扰线粒体蛋白质组研究的一个基本但却关键的问题，也是线粒体蛋白质组数据诠稃及亚细胞定位的关键。对线粒体蛋白质一般采用质谱鉴定，鉴定前的分离纯化是高效鉴定的前提。线粒体蛋白质的分离有基于凝胶电泳和液相色谱的两种策略，它们可以以合理的方式组合达到最佳分离效果。对鉴定的线粒体蛋白质数据的合理诠释是解读线粒体表达谱和不同生理状态功能的最终目标。     

蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统在多蛋白质复合体研究中的应用

多蛋白质复合体（MPCs）是蛋白质在体内发挥功能的重要形式之一。鉴定MPCs对于整体理解决定蛋白质功能和细胞行为的蛋白质-蛋白质相互作用网络具有至关重要的意义。鉴定MPCs的限制因素之一是MPCs的分离方法。蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）系统是研究这些复合体的强有效的工具。BN-PAGE系统是一种依赖于染料考马斯亮蓝（CBB）G-250给蛋白质加上负电荷的非变性蛋白分离方法,适用于分离相对分子质量10×103至10×106范围的MPCs。近年来,有关BN-PAGE系统用于哺乳动物细胞MPCs研究的报道有了很大的增长。本文重点对BN-PAGE系统的原理、发展及应用进行综述。     

脑损伤后大鼠海马差异蛋白质组学分析

目的 研究脑损伤后大鼠海马组织蛋白质组差异表达变化情况.方法 采用侧方液压冲击装置,建立大鼠中度脑损伤模型,分别取外伤组(3只)与假手术组(3只)大鼠海马组织总蛋白,通过差异荧光双向凝胶电泳(DIGE)分离蛋白,获得蛋白质分离图谱,经胶内酶切、抽提酶解肽段、MALDI-TOF/TOF质谱分析研究差异的蛋白质点,鉴定出变化的蛋白质.结果 经De-Cyder 5.0及BVA图像分析软件比较,发现17个蛋白点表达水平具有显著差异变化.鉴定出的蛋白质考染点含有14个蛋白质,2个为同一种蛋白,实际差异蛋白数为13个.依其功能属于细胞骨架蛋白、介导能量代谢的酶类、参与核酸合成及氧化应激反应的蛋白质、神经突触功能蛋白、细胞内信号传递蛋白及未知蛋白. 结论脑损伤后大鼠海马组织蛋白质表达谱存在差异,并初步鉴定出脑损伤后差异表达蛋白,为深入研究脑损伤的病理机制奠定基础.     

新疆市售驴乳粉蛋白质含量和氨基酸组成分析

对3家不同企业生产的驴乳粉中蛋白质含量、17种氨基酸含量和氨基酸组成进行测定和分析,结果表明:驴乳粉平均含蛋白质17.5%,总氨基酸含量为15.84%,占蛋白质90.5%;驴乳粉氨基酸种类齐全,人体必需氨基酸占总氨基酸42.39%;按生驴乳总干物质含量和蛋白质含量进行折算,驴乳粉蛋白质含量和生驴乳蛋白质含量基本相符;驴乳粉的氨基酸组成和必需氨基酸占总氨基酸的比例和生驴乳接近。     

运动心脏重塑中大鼠右心室肌的差异蛋白质组学研究

目的:探讨在运动心脏的发生过程中,右心室肌蛋白质组的差异表达,筛选对研究运动心脏重塑机制有重要意义的右心室蛋白质.方法:18只雄性SD大鼠按运动能力和体重随机配伍分为对照组和运动组,每组9只.运动组进行12周中等强度有氧运动(70～80%VO2max),后与对照组同时称取体重、麻醉处死,称取心脏重量,提取右心室肌的全蛋白,对样品蛋白用双向凝胶电泳技术分离、后固定染色.运用Bio-rad PD quest图像分析软件对双向凝胶电泳图谱进行分析,选取差异蛋白进行质谱鉴定.结果:经过12周运动后,运动组心脏出现明显形态学变化.此次实验获得了重复性和分辨率较好的双向凝胶电泳图谱,与对照组相比,通过软件分析,上调到10倍以上或下调至1/10及以下的差异点31个,其中7个上调,24个下调.这些点最多位干分子量50～70kDa和10～20kDa、等电点7.0～9.0范围内.质谱分析并鉴定了其中2个蛋白点,包括丙酮酸脱氢酶E1α1(运动12周后下调)和一个未知蛋白.结论:12周运动后大鼠右室肌蛋白质组发生了明显变化.能量代谢酶的变化提示中等强度运动对心脏产生的重塑作用可能主要引起右心室肌能量代谢水平的变化.     

姜黄素对人结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR蛋白质双向电泳图谱的影响

目的 探讨姜黄素处理对人结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR蛋白质表达谱的影响.方法 实验分两组,姜黄素处理组用25-μmol/L的姜黄素作用于人结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR 24h,对照组加入相应体积的生理盐水.应用同相pH梯度双向凝胶电泳技术分离姜黄素处理组与对照组人结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR的总蛋白,凝胶银...     

胃粘膜组织蛋白质组双向凝胶电泳技术的初步建立与优化

为建立并优化人类胃粘膜组织蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术 ,提高其分辨率及重复性。采用刮取手术胃粘膜组织 ,对以固相pH梯度为第一向的双向凝胶电泳的关键因素与环节 ,如样品处理、上样量、电泳参数、凝胶浓度和SDS凝胶电泳染色方法等进行一系列的优化。结果以固相pH梯度———IPG胶条 (pH =3～10 )进行第一向等电聚焦 ,以SDS均一胶 (13% )的垂直电泳为第二向 ,成功地得到了胃粘膜组织的双向凝胶电泳图谱     

应力性骨折的血清蛋白质组学分析

目的 采用双向电泳-串联飞行质谱技术分析应力性骨折(SF)患者的血清蛋白质组变化,筛选可用于SF早期诊断的生物标志物.方法 SF组和正常对照组血清样本均为混合血清,各由21例平均年龄为19岁的SF战士和正常对照战士的血清分别混合而成.血清样本去除高丰度蛋白后进行双向凝胶电泳(2-DE),比较两组血清蛋白质谱图,寻找差异蛋白点.采用基质辅助激光解吸串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)技术,结合生物学软件和数据库检索对差异蛋白点进行鉴定.结果 初步筛选出7个差异蛋白点,经质谱鉴定得到6种蛋白质,分别与新陈代谢、维持正常渗透压、免疫应答及氧化反应相关.在SF组中,对氧磷酶1、白蛋白对碘氧基苯甲醚CRA_h、血清白蛋白前体、白蛋白、甲状腺素结合前白蛋白表达量减少(P<0.05),而血红素结合蛋白前体表达量增加(P<0.05).结论 基于凝胶电泳的蛋白质组学分析可发现与SF相关的血清生物标志物;机体的免疫应答及氧化反应系统可能参与了SF的发生发展.     

蛋白质组研究中肽质量指纹图制备与鉴定方法初探

蛋白质组（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）是指一个基因组、一种细胞或组织所表达的所有蛋白质成分。蛋白质组的研究是为了识别及鉴定一种细胞或组织所表达的全部蛋白质及它们的表达模式〔１，２〕。蛋白质组研究技术包括对细胞内所有蛋白质的分离以及对分离得到的蛋白质的鉴别和认定...     

利用酪蛋白遗传工程技术改进牛奶加工的功能特性(上)

近年来人们对用遗传工程方法修饰食物蛋白质越来越感兴趣,本文将着重讨论这一技术的某些内容。重组DNA技术和分子生物学的最新进展能被应用于系统地改换蛋白质一级结构中各个氨基酸。即使只改变蛋白质中的一个氨基酸,也能显著地改变蛋白质的功能特性。 一、食物蛋白质的遗传修饰 1.方法 食物蛋白质遗传修饰技术主要是根据对氨基酸组成,顺序的分析,对经化学和酶学修饰的蛋白质的物理化学研究,图1就是根据酶工程实例所画的这一方法的广意图。     

鼻咽癌细胞辐射抗拒的比较蛋白质组学分析

目的 通过分离并鉴定具有不同辐射抗拒的人鼻咽癌细胞株CNE-2R与CNE-2的差异表达蛋白,探讨与鼻咽癌细胞辐射抗拒相关的分子机制.方法 分别提取鼻咽癌辐射抗拒细胞株CNE-2R及其亲本细胞株CNE-2的总蛋白,采用双向凝胶电泳分离,经软件分析识别差异表达蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质.结果 两种不同辐射敏感性的鼻咽癌细胞株CNE-2R和CNE-2中,共筛选出差异表达明显的蛋白质点有32个,其中11个蛋白质被鉴定成功,在CNE-2R中上调的蛋白有3个,下调的蛋白有8个.结论 不同辐射敏感性的鼻咽癌细胞的差异表达蛋白,主要涉及调节凋亡、DNA损伤与修复、细胞周期调控、RNA转录、细胞信号转导、细胞骨架组成及辐射应激反应等多个方面.     

腹泻型肠易激综合征患者结肠黏膜组织异常表达蛋白质的筛选与鉴定

目的 筛选及鉴定腹泻型肠易激综合征(D-IBS)患者与正常人结肠黏膜组织中的差异表达蛋白.方法 D-IBS患者及健康志愿者各4例,分别为D-IBS组和正常对照组.通过结肠镜取回盲部及乙状结肠黏膜进行活检,用含0.1% PMSF的冰盐水将标本洗净后立即置于液氮中保存.提取蛋白质,采用双向凝胶电泳法筛选差异表达蛋白,并采用质谱法对变化最明显的蛋白点进行鉴定.结果 利用双向凝胶电泳技术成功得到人结肠黏膜组织的蛋白质组图谱.正常对照组图谱平均得到蛋白点336个,组内图像平均匹配率92%,D-IBS组图谱平均得到蛋白点426个,组内图像平均匹配率95%.D-IBS组与正常对照组之间进行平均胶图谱的比较,两组间匹配率为74%.Volume值变化大于2倍以上的点共24个,其中21个点表达上调,3个点表达下调.表达上调最明显的2个蛋白点经鉴定分别为免疫球蛋白J链(Ig-j)和热休克蛋白27(HSP27),表达下调最明显的2个蛋白点则分别为血红蛋白β亚基和果糖二磷酸醛缩酶A.结论 采用双向凝胶电泳法可以成功得到人结肠黏膜组织蛋白质组表达图谱,D-IBS患者与正常人结肠黏膜组织蛋白质表达存在差异,已经鉴定出来的4个蛋白可能在D-IBS的发病机制中起一定作用.     

急性力竭运动后大鼠骨骼肌蛋白质组差异性表达的研究

目的:应用双向凝胶电泳技术(2-DE),分析探讨急性大强度力竭运动后大鼠骨骼肌组织蛋白质组的表达变化及其意义。方法:10只雄性SD大鼠按体重配对随机分为安静组(5只)和运动组(5只)。运动组大鼠按Bedford模型运动至力竭。力竭后3小时处死大鼠,取其后肢腓肠肌全蛋白质进行SDS-固相pH梯度聚丙烯酰胺双向凝胶电泳,运用Bio-radPDquest图像分析软件对2-DE图谱进行分析。结果:安静组显示667±35个蛋白质点,运动组显示572±28个蛋白质点,蛋白质点的匹配率为75%;运动后消失88个蛋白质点,新增32个蛋白质点;运动后蛋白质量上调2倍以上的蛋白质点有12个,蛋白质量下调至1/2以下的蛋白质点有10个,共有282个蛋白质点表达有差异。结论:大鼠大强度力竭运动后3小时,腓肠肌蛋白质发生了明显的质和量的变化。     

鼠疫耶尔森菌菌株91001的蛋白质组学初步研究

目的建立鼠疫耶尔森菌的蛋白质组学研究方法,获得鼠疫耶尔森菌的基本蛋白质组数据。方法以对人无致病能力的布氏田鼠疫源地菌株91001为研究对象,按照溶解性的不同分别收集菌体蛋白,以3种不同方法(Shotgun-LC-MS-MS,1D-LC-MS-MS和2D-MS)进行分析,将分析数据与基于91001菌株基因组全序列建立的蛋白质理论数据库进行比对,确定91001菌株本实验培养条件下所表达的蛋白组分。结果Shotgun-LC-MS-MS方法鉴定了971种蛋白,1D-LC-MS-MS鉴定了915种,而2D-MS方法则鉴定了233种蛋白质,三者合计为1193种蛋白质,占基因组预测CDS的28．7％(1193／4143)。结论不同的蛋白质组分析方法鉴定的蛋白质种类和数目都存在差异,为更全面地获得鼠疫耶尔森菌蛋白质组数据,有必要同时采取多种方法进行分析。     

蛋白组学相关技术在运动对骨骼肌重塑研究中的进展

运动对身体最直接的作用为重塑骨骼肌,但其潜在的分子机制仍不清楚。蛋白组学技术可为特定刺激物调节分子通路提供一个整体的视角,目前已在运动对骨骼肌重塑的作用机制方面取得一定进展。本文通过广泛查阅近些年来有关运动对骨骼肌重塑的蛋白组学研究报道,并进行总结分析。结果发现,可通过蛋白质分离技术结合蛋白质鉴定技术有效地检测出运动前后或运动组与安静对照组骨骼肌差异表达的蛋白质。通过运动可引起骨骼肌的适应性应答,蛋白质组会发生相应的调整。不同运动的类型、强度和持续时间以及肌纤维类型可引起骨骼肌蛋白质组的不同变化。随着现有技术的不断完善和更多新技术的产生,蛋白组学研究会为阐明运动对骨骼肌重塑及其改善健康的机制研究等做出更大的贡献。     

一次性力竭运动后大鼠心室肌蛋白质组的差异性表达

目的:探讨力竭运动对大鼠心室肌蛋白质组表达的影响,初步筛选出对运动应激具有重要意义的心室肌目标蛋白质。方法:将10只雄性SD大鼠随机分为安静对照组和运动组(n=5)。运动组大鼠采用三级递增运动负荷跑台训练建立一次性力竭运动实验动物模型。取心室肌,提取心室肌组织全蛋白进行双向凝胶电泳(2-DE)分离。通过图像分析软件PD Quest进行分析后,选择运动后消失和表达量上调5倍或下调4/5以上的蛋白质点作为备选质谱鉴定蛋白点。结果:在电泳图谱上对照组平均检测到蛋白质点332±17个,运动组平均检测到347±22个。运动后共有47个蛋白质点发生了变化:5个点在运动后消失;表达量上调3倍以上的点有28个,下调2/3以上的点有14个,其中上调5倍以上的点14个,下调4/5以上的点4个。对6个备选蛋白质点进行了质谱鉴定,共鉴定出心肌α-肌球蛋白重链、原肌球蛋白-1、甘露糖结合蛋白C前体、腈水解酶和一个未知的分子量为21kD的蛋白质。结果表明,力竭运动后大鼠心室肌蛋白质组发生了明显变化;本研究为寻找新的运动性疲劳的生物标志物提供了新的思路。     

应力作用下成骨细胞的差异蛋白质组学研究

目的 探讨应力作用下鼠成骨细胞蛋白质表达谱的变化.方法 将鼠成骨细胞分为加载组和对照组,采用四点弯曲细胞力学加载装置,以频率为0.5 Hz,应变水平2000 με条件下加载6 h后,运用双向凝胶电泳分离蛋白样品、分析差异表达蛋白点.结果 加载组和对照组分别得到（533±14）和（512±11）个蛋白点,其中有9种蛋白质表达出现明显差异,7种在应变作用后表达增高,2种降低.结论 应力作用下鼠成骨细胞的蛋白表达发生了显著变化,这些差异蛋白可能参与成骨细胞力学反应机制的不同过程.