P53和siRNA-c-myc质粒对乳腺癌的抑制作用研究

目的探讨P53和siRNA-c-myc质粒对乳腺癌的抑制作用及其可能的作用机制,从而分析其在临床上治疗乳腺癌的价值。方法共表达P53和siRNA-c-myc的质粒转染人乳腺癌细胞株,对照组则是空白质粒的转染的人乳腺癌细胞株。用半定量RT-PCR法检测两组P53和c-myc基因的表达,用Western blot检测相关蛋白的表达的情况,另外还要用MTT法检测两组乳腺癌细胞的增殖情况。结果与空白质粒组相比,P53和siRNA-c-myc质粒组可以显著地抑制c-myc基因和蛋白的表达情况,同时增强了P53基因及蛋白的表达,另外还能够使乳腺癌细胞的增殖能力大大降低。经统计学处理,两组相关数据具有显著的差异性(P<0.05)。结论采用P53和siRNA-c-myc质粒技术可以有效地增强乳腺癌细胞P53的表达和抑制c-myc的表达,还可以抑制人乳腺癌细胞的分裂及增殖,由此推测上调P53、下调c-myc基因可以到达抑制人乳腺癌细胞的增殖作用,这也为乳腺癌的治疗的研究提供一种新途径。     

β-arrestin2基因转染对人肺腺癌细胞 A549的增殖影响

目的：观察外源性β-arrestin2基因对人肺腺癌细胞A549增殖的影响。方法利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3 c．1-β-arrestin2质粒和空载体pcDNA3．1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,RT-PCR和Western blotting检测β-arrestin2基因表达的影响。采用MTT（四甲基偶氮唑盐）法分析转染细胞的增殖情况。结果经脂质体转染和筛选,建立了稳定表达β-arrestin2基因的A549细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较,转染β-arrestin2基因的细胞生长速度明显减慢（ P ＜0．05）。结论β-arrestin2基因可能通过抑制P65活性而抑制人肺腺癌细胞A549的生长。     

P53和siRNA-c-myc质粒对乳腺癌的作用机制研究

目的探讨P53及siRNA-c-myc对乳腺癌的作用机制。方法测定乳腺癌标本内P53蛋白阳性表达率,采用siRNA干扰乳腺癌细胞株c-myc,检测其癌细胞增殖分化的情况。结果乳腺癌患者中P53蛋白阳性表达率明显高于对照组(P<0.05),siRNA导入组细胞增殖明显受到抑制(P<0.01)。结论 P53和c-myc与乳腺癌的发生发展密切相关,检测乳腺癌中P53蛋白的表达情况可作为判断癌症转移和预后的参考指标,c-myc可作为基因疗法中重要的靶点。     

P53和siRNA-c-myc质粒对乳腺癌的治疗作用研究

目的探讨P53及siRNA-c-myc对乳腺癌的影响。方法测定乳腺癌标本内P53蛋白阳性表达率,采用siRNA干扰乳腺癌细胞株c-myc的表达,检测其癌细胞增殖分化的情况。结果乳腺癌患者中P53蛋白阳性表达率明显高于对照组(P<0.05),siRNA导入组细胞增殖明显受到抑制(P<0.01)。结论 P53和c-myc与乳腺癌的发生发展密切相关,检测乳腺癌中P53蛋白的表达情况可作为判断癌症转移和预后的参考指标,c-myc可作为基因疗法中重要的靶点。     

MDM2基因真核表达质粒构建及对人乳腺癌MCF-7细胞运动与侵袭能力的影响

目的 构建MDM2的pcDNA3.1真核表达质粒(pcDNA3.1-MDM2),并将其转染至人乳腺癌MCF-7中,考察MDM2蛋白过表达对乳腺癌转移的影响。方法 采用PCR方法体外克隆MDM2基因全序列,并将其用同源重组技术连接到真核pcDNA3.1质粒载体上,构建真核表达质粒,并进行测序鉴定,利用脂质体法转染至MCF-7细胞中。通过G418抗生素筛选出单克隆高表达细胞系,使用免疫印迹法考察MDM2蛋白表达。同时,通过划痕试验及transwell法来检测细胞的运动与侵袭能力。结果 测序结果表明pcDNA3.1-MDM2基因序列准确无误,免疫印迹法表明稳定转染细胞系构建成功,划痕试验及transwell试验表明MDM2高表达细胞系的运动与侵袭能力增加。结论 成功构建了pcDNA3.1-MDM2真核表达质粒,转染MCF-7细胞后,可稳定表达,并促进了MCF-7细胞的运动及侵袭,为研究MDM2蛋白表达对人乳腺癌转移的分子机制及作为诊疗的生物标志物奠定了基础。     

前列腺源性ETS因子对HCT116细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨前列腺源性ETS因子(prostate-derived Ets factor,PDEF)对HCT116细胞增殖与凋亡的影响.方法 体外培养HCT116细胞,分成空白对照组,空质粒组和重组表达质粒组,空质粒组转染不含PDEF的空载体,重组表达质粒组转染PDEF重组表达质粒.荧光显微镜下观察PDEF重组质粒表达情况;RT-PCR、Western blot检测3组细胞PDEF mRNA和蛋白的表达情况;CCK8法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 荧光显微镜下空质粒组和重组表达质粒组HCT116细胞均可观察到绿色荧光蛋白的表达,表明质粒已成功转染HCT116细胞;RT-PCR结果显示,与空质粒组相比,重组质粒组PDEF基因表达增高263倍;Western blot结果可见重组质粒组有PDEF蛋白的表达,而空质粒组和对照组没有;CCK8法检测发现PDEF基因的表达能够明显抑制HCT116细胞的增殖(P＜0.05);流式细胞仪结果显示重组质粒组细胞凋亡率显著高于对照组和空质粒组(P＜0.05).结论 在HCT116细胞中表达前列腺上皮源性ETS转录因子,可以抑制细胞的增殖和促进细胞凋亡.     

RNAi沉默生存素基因抑制Raji细胞增殖

目的生存素(survivin)短发夹RNA(shRNA)重组质粒转染B细胞淋巴瘤Raji细胞,体内、外观察对该基因表达的干扰作用及抑制细胞增殖的效果。方法实验分为空白对照(D)组、A组、B组和C组,分别用生存素干扰重组质粒A、B和阴性对照重组质粒转染Raji细胞,经G418筛选获得各重组质粒稳定转染细胞,RT-PCR比较各组生存素mRNA表达差异,FCM测定比较各组生存素蛋白的表达,通过细胞计数比较各组细胞增殖能力的差异。结果成功筛选出稳定转染的Raji细胞。与空白对照组相比,质粒A和质粒B对生存素mRNA的抑制率分别为70.01%和46.46%(P<0.05),对蛋白表达抑制率分别为64.15%和41.16%(P<0.05),两干扰组稳定转染细胞的增殖能力明显下降;质粒A对生存素基因的干扰作用较质粒B明显,抑制瘤细胞增殖的效果也更为明显。结论生存素干扰重组质粒A和B能干扰Raji细胞生存素基因表达,抑制B细胞淋巴瘤Raji细胞增殖。     

Notch1(NICD)过表达真核载体构建及对大鼠BMSCs增殖分化的影响

目的 构建Notch1(NICD)过表达真核载体,探讨其对大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenehymal stem cells,BMSCs）增殖分化的影响。方法 以大鼠BMSCs为研究对象,构建Notch1(NICD)过表达真核载体,将pEGFP-N1-NICD质粒转染BMSCs,实验分为空白对照CON组、空载体组和转染组,转染48h后观察细胞一般形态,Realtime PCR和Western blotting检测NSE、GFAP 和Notch1基因和蛋白表达,流式检测转染后细胞凋亡和细胞周期情况;MTT检测增殖情况。结果 经DNA测序结果,重组质粒pEGFP-N1-NICD编码序列与设计完全一致,转染48h后转染组和空载体组的BMSCs均可表达绿色荧光。转染组Notch1、GFAP基因相对表达量显著高于空载体组和CON组（P＜0.05）,Western blotting检测结果与之类似。转染48h后,转染组活细胞比率及早期凋亡率、晚期凋亡率与CON组和空载体组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）;空载体组与CON组晚期凋亡率比较差异具有统计学意义（P＜0.05）,转染组细胞处于G1/G0细胞比例显著高于CON组和空载体组（P＜0.01）,而处于S和G2/M期细胞比例显著低于CON组和空载体组（P＜0.01）,转染组增殖曲线值随时间逐渐低于CON组和空载体组,到第4d时显著低于CON组和空载体组（P＜0.05）。结论Notch1(NICD)过表达真核载体构建成功,高表达Notch1(NICD)基因可能在一定程度上诱导BMSCs凋亡、抑制其增殖,且表现诱导向神经胶质样细胞分化。     

肝细胞生长因子在LO2细胞表达的实验研究

目的 将肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)真核表达栽体,转染培养的LO2肝细胞,观察其表达。方法 将含肝细胞生长因子cDNA真核表达栽体PEGFP-HCF,脂质体(Lipofectauline)转染培养的LO2肝细胞;PCR鉴定外源基因的导入,绿荧光蛋白检测肝细胞生长因子的表达。结果 (1)重组质粒PEGFP-C1-HGF转染峨肝细胞,5d后,细胞内可检测到绿荧光蛋白。(2)PCR结果显示：转染PEGFP-C1-HGF质粒组可见306bp特征条带与阳性对照大小一样,假转染组与空质粒组无特征条带。结论 人肝细胞生长因子基因真核表达栽体,PEGFP-C1-HGF,能成功转染LO2细胞并获表达。     

FAM3B基因cDNA克隆及其在胃癌细胞系BGC-823的表达

目的克隆FAM3B cDNA,构建FAM3B重组表达载体并在胃癌细胞系BGC-823中表达,观察其对细胞系的影响,探索新的肿瘤治疗途径。方法构建pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒,将pEGFP-N2-FAM3B转染人胃癌细胞系BGC-823,研究其对胃癌细胞产生的作用。结果重组pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒构建成功,经pEGFP-N2-FAM3B转染后,荧光显微镜下可见转染的BGC-823细胞有绿色荧光蛋白的表达,转染后的BGC-823细胞生长减慢。结论构建完成真核表达载体pEGFP-N2-FAM3B,重组pEGFP-N2-FAM3B质粒在胃癌细胞系BGC-823细胞内成功表达。     

人雌激素受体β绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人雌激素受体β(ERβ)绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体,并稳定转染乳腺癌MCF-7细胞。方法通过双酶切将pCMV5-hERβ中的人ERβcDNA克隆到pEGFP-C3中,构建并鉴定重组质粒pEGFP-hERβ,然后转染乳腺癌MCF-7细胞,采用G418(500μg/mL)筛选出稳定转染的细胞系,在荧光显微镜下观察融合蛋白质在真核细胞内的表达分布,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ERβ的mRNA转录水平。结果成功构建重组表达载体pEGFP-hERβ,有效转染并筛选出稳定转染ERβ基因的MCF-7细胞系,外源性ERβ基因在MCF-7细胞中获得了有效转录,并在细胞质和细胞核中均广泛分布。结论建立了稳定表达ERβ的MCF-7细胞系,为筛选ERβ调节剂和进一步研究ERβ在乳腺癌中的作用及其机制奠定基础。     

hi FGF2真核表达载体的构建及其高表达对细胞凋亡的影响

目的构建hi FGF2(high molecular weight isoform fibroblast growth factor-2,hi FGF2)真核表达载体,并观察其过表达后对细胞凋亡的影响。方法设计合成hi FGF2 cDNA模板引物,Nhel和Hind III双酶切pDsRed1-N1质粒,T4DNA连接酶重组hi FGF2质粒,PCR扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳检测及测序鉴定。将重组hi FGF2质粒瞬时转染HEK293细胞,荧光倒置显微镜检测转染效率。AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 hi FGF2真核表达载体符合设计要求,瞬时转染HEK293细胞的转染率达70%以上。过表达hi FGF2,HEK293细胞FITC/PI双染阳性率达(29.12±2.81)%,与正常组、转染空载体组差别有显著性(P<0.01或P<0.05)。结论成功构建hi FGF2真核表达载体,过表达hi FGF2导致细胞凋亡。     

HCV Core基因真核表达载体构建及其对HeLa细胞自噬的影响

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（Core）真核表达载体,并研究其对人宫颈癌 HeLa细胞自噬功能的影响。方法 以 HCV复制子质粒 pJFH1为模板,PCR法扩增 HCV Core 基因片段,经纯化回收后与 PLVX-IRESZsGreen1载体用同源重组法相连,构建 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,并经测序验证其序列的正确性。转染宫颈癌 HeLa细胞,并设 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组、PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组以及未转染质粒空白对照组,通过免疫印迹法验证 HCV Core蛋白在 HeLa细胞中的表达,并用免疫荧光（IF）和免疫印迹检测自噬生物标记物微管相关蛋白 1轻链 3（LC3）的表达水平。结果 获得 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,测序结果表明构建的重组质粒序列完全正确,HCV Core重组蛋白可在 HeLa细胞中有效表达;免疫荧光和免疫印迹结果表明,HCV Core过表达细胞 LC3焦点和 LC3 Ⅱ蛋白表达水平明显增多,PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞 LC3 Ⅱ水平（1.069±0.049）高于 PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组（0.776±0.047）,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 成功构建了 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core 重组质粒,HCV Core 蛋白过表达可诱导 HeLa 细胞自噬。     

关于Tollip在宫颈癌发生过程中的作用及机制探讨

目的探讨Tollip在宫颈癌发生过程中的作用机制。方法 2012年~2014年,收集正常宫颈组织、CIN1、CIN2、CIN3及宫颈浸润癌癌组织各80例,对比HPV感染情况,检测宫颈鳞状上皮凋亡,Cyclin D1、c-myc、p53表达。取细胞分为正常鳞状上皮组,Siha组,Siha+Tollip质粒转染组,Siha+空质粒对照组,进行Tollip的细胞转染实验。结果 TLR4、My D88与宫颈鳞状上皮凋亡(r=0.484、0.427)、HPV感染(r=0.671、0.405)、P53(r=0.487、0.581)存在相关性(P<0.05)。正常鳞状上皮组、Siha组、Siha+Tollip质粒转染组、Siha+空质粒对照组的细胞增殖、培养第3代贴壁生长比重差异显著。Tollip过表达对象,P53表达明显上调。结论 Tollip在宫颈癌发生过程中可能通过调节TLR4、My D88、NF-KB、P53表达,最终影响细胞凋亡、宫颈上皮内瘤病变与宫颈癌的发生。     

HGF基因对大鼠血管内皮细胞增殖的作用

目的构建肝细胞生长因子(HGF)真核细胞表达质粒pEGFP-HGF-C1,探讨HGF对大鼠血管内皮细胞(VECs)的作用。方法通过亚克隆技术,构建含有人HGF cDNA全长的真核细胞表达质粒pEGFP-HGF-C1并测序;向大鼠原代骨骼肌细胞转染质粒pEGFP-HGF-C1,测定转染效率;ELISA法测定细胞上清液中HGF蛋白表达浓度;MTT法测定HGF表达产物对大鼠VECs促增殖作用。结果成功构建正向表达HGF的真核细胞表达质粒pEGFP-HGF-C1,该质粒可有效转染原代培养的骨骼肌细胞并表达HGF,且其表达产物HGF对大鼠VECs的促增殖作用具有量效和时效关系(P<0.05或P<0.01)。结论成功构建的真核表达质粒pEGFP-HGF-C1能有效转染大鼠骨骼肌细胞,分泌的HGF对大鼠VECs有促增殖作用。     

转染bFGF基因对人骨髓间充质干细胞增殖特性的影响

目的 探讨作为组织工程种子细胞的人骨髓间充质干细胞,在体外培养条件下转染bFGF基因对其增殖特性的影响.方法 利用脂质体将含人pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代人BMSCs,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR和免疫荧光检测转染bFGF的骨髓间充质干细胞bFGF基因及其产物的表达,MTY法检测和流式细胞仪检测细胞的增殖情况和细胞增殖周期,并将转染和非转染BMSCs分别成骨诱导分化,对其碱性磷酸酶活性进行测定.结果 脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染BMSCs,经荧光定量PCR和免疫荧光检测.证实转染细胞表达bFGF.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高（P〈0.05）.碱性磷酸酶活性检测结果表明转染细胞的碱性磷酸酶活性高于非转染细胞（P〈0.05）.结论 用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的hBMSCs,bFGF基因改良的BMSCs可以改善其生存状态、促进其增殖,并可促进向成骨细胞分化.     

miR-214对人肺癌A549细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:通过构建miR-214的真核表达载体,研究其对人肺癌A549细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:以A549细胞基因组DNA为模板,扩增得到miR-214前体序列,插入表达载体pcDNA3.1(+)克隆获得pcDNA3.1(+)-miR-214。将真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-214转染到A549细胞中,并采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)对其表达情况进行验证。采用MTT和transwell小室等方法分别检测转染重组质粒pcDNA3.1(+)-miR-214对A549细胞增殖能力和侵袭能力的影响。结果:成功构建了miR-214稳定过表达的真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-214;real-time PCR检测结果表明,转染pcDNA3.1(+)-miR-214后A549细胞中miR-214过表达(P<0.05)。miR-214过表达后A549细胞的增殖和侵袭能力均明显降低。结论:miR-214在A549细胞中过表达能够抑制细胞的增殖和侵袭能力,为进一步深入研究miR-214在肿瘤中的作用机制提供了实验依据。     

体外导入IL-2R反义RNA表达质粒对小鼠脾细胞活化增殖的影响

目的　观察导入白细胞介素 2受体 (IL 2R)反义RNA真核表达质粒对体外培养的小鼠脾细胞活化增殖的影响及其机制的探讨。方法　用粘附辅助脂质体法把IL 2R反义RNA真核表达质粒转染脾细胞 ,用丝裂原刺激脾细胞活化增殖 ,MTT法检测细胞生长情况。狭线杂交法检测IL 2RmRNA的表达水平 ,流式细胞仪检测IL 2R的蛋白表达水平。结果　转染各重组质粒后 ,脾细胞的生长增殖受到明显抑制 ,且 pcAnti mIL 2Rαβ与 pciAnti mIL 2Rαβ组抑制率较 pcAnti mIL 2Rα及pcAnti mIL 2Rβ组的大 ,pcAnti mIL 2Rα组抑制率较pcAnti mIL 2Rβ的大。转染各重组质粒对NIH3T3细胞生长增殖无影响。转染各重组质粒后IL 2RmRNA及蛋白表达水平明显降低。结论　IL 2R反义RNA能有效抑制体外培养的小鼠脾细胞的生长 ,IL 2Rαβ融合基因反义RNA较α、β单基因反义RNA的抑制率高 ,IL 2Rα反义RNA较 β反义RNA抑制率高。初步推断 ,IL 2R反义RNA抑制细胞生长的作用是特异的 ,只针对功能性表达IL 2R的细胞。反义RNA封闭IL 2R的表达很可能是其抑制脾细胞活化增殖的直接原因     

P53 对蛋白激酶 R 和宫颈癌 HeLa 细胞生物学行为的影响

【摘要】 目的 探讨 P53 蛋白对蛋白激酶 R（PKR）表达和活性以及对宫颈癌 HeLa 细胞生物学行为的影响。方法 构建过表达 p53 基因的重组质粒 pEGFP-C1/p53, 转染 HeLa 细胞, 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测 pEGFP-C1/p53 转染组、空质粒 pEGFP-C1 转染组及空白对照组（仅加入转染试剂）p53 及 PKR mRNA 的表达; 采用 Western Blot 法检测上述 3 组中 P53、 PKR、 磷酸化型 PKR(p-PKR), PKR 下游底物真核细胞翻译启始因子 2α （eIF2α）的磷酸化型 p-eIF2α的表达; 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测 HeLa 细胞增殖活性变化, Transwell 侵袭实验检测 HeLa 细胞侵袭能力变化。 结果 pEGFP-C1/p53 转染组 p53 及 PKR mRNA 的相对表达量高于 pEGFP-C1 转染组和空白对照组（均 P＜ 0.05）, pEGFP-C1 转染组和空白对照组比较, 差异无统计学意义; pEGFP-C1/p53 转染组 P53、PKR、p-PKR 及 p-eIF2α蛋白的相对表达量高于 pEGFP-C1 转染组和空白对照组（均 P＜ 0.05）, pEGFP-C1 转染组和空白对照组比较, 差异无统计学意义; pEGFP-C1/p53 转染组 HeLa 细胞增殖活性及侵袭能力均显著低于 pEGFP-C1 转染组和空白对照组（ 均 P＜ 0.05）, pEGFP-C1 转染组和空白对照组比较, 差异无统计学意义。 结论 P53 能上调 PKR 的表达及活性, 激活 PKR/eIF2α信号通路, 抑制宫颈癌 HeLa 细胞增殖及侵袭。     

携带白细胞介素2和NK4双基因真核共表达质粒的构建及活性观察

目的 构建同时携带白细胞介素2（IL-2）和NK4基因的真核表达载体（pIRES-IL-2-IRES-NK4）,观察其在防治肿瘤中的潜在应用前景.方法 根据Pubmed上公布的IL-2及NK4 mRNA序列,设计扩增IL-2及NK4 cDNA的特异性引物,以PBV220-IL-2质粒和PCAGGS/hNK4质粒为模板,分别扩增IL-2及NK4基因,并将IL-2及NK4基因分别克隆在真核表达载体pIRES-SEQ的XhoI、MLuI位点和SalI、NotⅠ位点.获得同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4.该重组质粒转染肝癌细胞HepG2后,检测目的基因的转染表达及表达产物对HepG2细胞增殖的影响.结果 通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带IL-2和NK4双基因的真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4构建成功.用pIRES-IL-2-IRES-NK4转染HepG2细胞后24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48 h时荧光更强;逆转录聚合酶链反应结果表明转染pIRES-IL-2-IRES-NK4质粒细胞的IL-2及NK4基因表达明显增强.酶联免疫吸附测定检测结果表明,转染组细胞较对照组细胞培养上清中IL-2及NK4蛋白表达水平明显增强.转染组48 h后的IL-2、NK4蛋白表达水平为2.139、1.956 mg/L,明显高于未转染组的0.492、0.620 mg/L.四甲基偶氮唑盐法结果表明转染真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4的细胞表达上清,有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,且有剂量效应关系.结论 本研究成功构建了同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4,该质粒可有效转染肝癌细胞,且转染细胞表达上清有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,提示该重组质粒有潜在防治肿瘤的应用前景.