转录因子Ets-1表达载体的构建及调控小鼠成釉细胞MMP-20的表达

目的 构建转录因子Ets-1的pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体,转染小鼠成釉细胞,检测Ets-1调控小鼠成釉细胞MMP-20的表达,为研究Ets-1在牙釉质发育过程中的重要作用奠定基础.方法 以从小鼠成釉细胞中提取的总RNA逆转录所得cDNA为模板,用RT-PCR法扩增得出含有kpn Ⅰ和BamH Ⅰ的Els-1目的 基因连接到pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体上.将重组质粒瞬时转染到小鼠成釉细胞中观察,并通过实时定量RT-PCR的方法检测MMP-20 mRNA的相对表达量.结果 ①经过PCR引物扩增得到一约1399bp的基因片段,重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-1双酶切进行初步鉴定后,与GenBank登录基因对比显示生物公司测序结果完全正确.②重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-1转染小鼠成釉细胞后(以转染空载体pcDNA3.1/myc-HisA作为对照),实时定量RT-PCR检测MMP-20 mRNA的相对表达量上升明显.结论 成功构建了Ets-1的真核表达载体,初步研究证明小鼠成釉细胞核中Ets-1可以上调MMP-20基因表达水平.     

激活转录因子-2调控小鼠成釉细胞基质金属蛋白酶-20分子机制的初步研究

目的:通过克隆激活转录因子-2(ATF-2)基因以及真核表达载体的构建,初步研究ATF-2对小鼠成釉细胞基质金属蛋白酶-20(MMP-20)基因表达的影响。方法:根据引物设计原则设计ATF-2基因逆转录-聚合酶链反应(PCR)引物,从小鼠成釉细胞中提取总RNA逆转录所得cDNA为模板,进行PCR法扩增。得出含有Hind Ⅲ 和xhol酶切位点的ATF-2目的基因连接到pcDNA 3.1/myc-HisA真核表达载体上;用重组质粒转染小鼠MMP-20基因,观察其对MMP-20基因转录活性的影响。结果:经过PCR引物扩增得到1 463 bp基因片段,将获得的重组质粒pcDNA 3.1/myc-HisA-ATF-2双酶切分析鉴定,测序结果与Gen Bank登录基因序列完全一致;双荧光素酶结果显示ATF-2可以促进MMP-20启动子的表达(P<0.01),且在-825～+23(848 bp)启动子区段促进作用最明显。结论:成功实现了ATF-2基因克隆及真核表达载体的构建,并发现ATF-2对MMP-20启动子区域活性表达起正向调节作用。     

凋亡抑制蛋白Livin两种异构体真核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建凋亡抑制蛋白Livin两种异构体(Livinα和β)真核细胞表达载体pcDNA3.1-Livin α和pcDNA3.1-Livin β.方法利用分子克隆技术,首先设计合成扩增Livin基因异构体全长cDNA序列的特异性PCR引物,以肺腺癌SPC-A1细胞总RNA为模板,RT-PCR获得Livin基因异构体全长cDNA序列,TA克隆将Livin全长cDNA序列克隆到T载体上,用限制性内切酶HindⅢ和Xba Ⅰ双酶切取所需目的片段,然后将该片段插入真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点,最后对产生的重组子进行双酶切、PCR鉴定,并经过测序证实后,构建成为Livin基因异构体表达载体(pcDNA3.1-Livin).电穿孔法获得稳定表达Livin α和β的A549细胞克隆,Western blot验证Livin蛋白在转染细胞中的表达情况.结果成功获得Livinα和Livin β全长cDNA序列,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1上;基因转染后,阳性细胞分别表达Livinα和β.结论Livin基因两种异构体真核表达载体的构建及在细胞中的表达鉴定,为进一步研究Livin异构体功能及在肺癌细胞中的抗凋亡效应奠定了基础.     

小鼠MME基因真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆小鼠巨噬细胞金属弹力酶(MME)基因结构域Ⅰ和Ⅱ,构建真核细胞表达载体,用于动物肿瘤原位种植模型的研究.方法通过PCR选择性扩增MME基因结构域Ⅰ和Ⅱ,克隆入pGEM-T载体中,限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切及PCR鉴定.结果以MME cDNA为模板进行PCR扩增的特异性片段在750 bp和1 000 bp之间.以此构建的pGEM-T-MME克隆载体和表达载体, 经限制性内切酶酶切证实载体中带有MME目的基因片段; 与小鼠MME cDNA序列的碱基符合率为99.63%; 证明MME基因已正确克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中.结论成功构建了pcDNA3.1-MME重组质粒,奠定了转基因研究MME表达与肿瘤生长转移关系的实验基础.     

带c-Myc标签的Mdfic基因真核表达载体构建及其在成肌细胞中的表达

目的 构建新型转录因子Mdfic和c-Myc标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1-Mdfic-Myc,实现其在成肌细胞C2C12中的表达.方法 PCR方法扩增Mdfic的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c-Myc标签共同克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒.重组质粒经过PCR、双酶切和测序鉴定后,脂质体法转染C2C12细胞.RT-PCR和Western blotting方法检测转染后细胞中Mdfic-Myc的表达.结果 成功构建了peDNA-Mdfic-Myc真核表达质粒;RT-PCR和Western blotting结果表明,Mdfic-Myc融合蛋白在成肌细胞C2C12中获得高效表达.结论 pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒的成功构建及其在成肌细胞中的表达为进一步体外研究Mdfic蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了基础.     

lefty1基因真核表达载体构建鉴定及转染

目的:构建lefty1基因与pcDNA3.1(+)相融合的真核表达载体,并在lefty1基因的下游加上Flag标签,转染人肾小管上皮细胞株验证重组质粒活性。方法:设计并合成lefty1基因上下游引物,同时加上Flag标签序列,PCR扩增基因,并将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,双酶切图谱分析和扩增产物测序鉴定所构建的真核表达载体。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag和pcDNA3.1(+)分别转染至人肾小管上皮细胞株HK-2,qPCR和Western blot检测lefty1在mRNA和蛋白水平的表达。结果:以lefty1基因质粒模板扩增得到的片段约1 150bp,双酶切得到目的基因片段,测序的结果显示与lefty1基因序列相同。转染肾小管上皮细胞后,pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag能表达lefty1蛋白。结论:成功构建lefty1基因真核表达载体,为一步研究lefty1基因功能奠定了基础。     

MCP-1真核表达载体的构建和鉴定

目的构建大鼠MCP-1真核表达载体pcDNA3.1（＋）-MCP-1。方法据Genebank中大鼠MCP-1cDNA序列设计并合成特异性引物,提取糖尿病模型大鼠肾脏总RNA,利用PCR技术扩增出MCP-1全编码区基因片段,并将扩增产物TA克隆至pMD-18T载体,然后分别双酶切pMD-18T-MCP-1回收目的片段再克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中。结果PCR扩增得到大鼠成熟MCP-1的cDNA片段大小为500 bp,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCDA3.1（＋）-MCP-1。结论成功构建了大鼠MCP-1真核表达载体,为进一步研究MCP-1的DNA疫苗奠定基础提供了条件。     

Dnd1慢病毒表达载体的制备及鉴定

目的:构建小鼠Dnd1慢病毒表达载体,以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达。方法:设计引物引入AgeⅠ酶切位点,使用PCR方法从质粒pcDNA3.1-Dnd1中扩增小鼠Dnd1基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化。用In-Fusion技术将AgeⅠ内切酶消化后目的片段交换连接入AgeI酶切的pGC-FU载体,构建Dnd1慢病毒表达载体pGC-FU-Dnd1。酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-FU-Dnd1与慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,Western-blot验证Dnd1在转染293T细胞中表达。结果:通过PCR扩增获得了Dnd1基因,将Dnd1克隆到慢病毒转移质粒pGC-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论:成功构建了Dnd1慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨Dnd1功能奠定了基础。     

日本血吸虫P14钙结合蛋白样蛋白基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出钙结合蛋白样蛋白SjP14编码基因,并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),制备重组分子疫苗.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,逆转录cDNA,设计引物常规PCR法扩增出SjP14编码基因,通过线性T克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),经转染...     

分泌型核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建分泌型核心蛋白聚糖(DCN)真核表达载体,为研究DCN的生物学功能奠定基础。方法：利用特异性引物,应用PCR技术扩增DCN全长基因cDNA片段,与 pcDNA3.1载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体。结果：获得了约1080 bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型DCN cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中。结论：成功克隆了分泌型DCN cDNA,并且构建了真核表达载体pcDNA3.1-DCN。