大肠杆菌偏嗜性人γ干扰素基因编码序列的克隆

目的：获得适于大肠杆菌表达的人γ干扰素(hlFN-γ)基因。方法：用大肠杆菌偏嗜性密码子替换已知hlFN-γ基因编码序列中相应的密码子，将重新设计后的编码序列分为六段进行人工化学合成，通过PCR拼接技术扩增出大肠杆菌偏嗜性hlFN-γ基因编码序列，并进行克隆及序列分析。结果：经序列分析证实，重组pGEM—hlFN-γ质粒含有与预期结果一致的hlFN-γ基因编码序列。结论：成功进行了大肠杆菌偏嗜性hlFN-γ基因的克隆，为hlFN-γ基因的体外高表达奠定了基础。     

大肠杆菌偏嗜性密码子组成的人降钙素(hCT)编码序列的克隆

目的：克隆适于在大肠杆菌(Escherichia coli，E．coli)中表达的人降钙素(hCT)基因，为提高其表达水平奠定基础。方法：根据大肠杆菌密码子频率表，在不改变hCT。氨基酸组成的前提下，设计并合成适于在大肠杆菌中表达的编码hCT的DNA序列，经PCR扩增后，与质粒载体pGEM^R-Teasy进行连接。连接产物转化感受态JM109大肠杆菌，筛选阳性菌落，经扩大培养后，对所含重组质粒进行鉴定。结果：经酶切鉴定及DNA序列分析证实，hCT编码DNA序列成功地克隆人pGEM^R-Teasy载体中，其序列与设计的完全一致。结论：完成了大肠杆菌偏嗜性人降钙素基因的克隆，为下一步hCT表达载体的构建及在大肠杆菌中进行表达的研究奠定了基础。     

人CD40基因的克隆及其胞外段的原核有效表达

目的克隆人CD40基因并原核高效表达其胞外段。方法采用RT-PCR法,从高表达人CD40抗原的XG-2细胞中扩增CD40全长基因,并将其插入pMD18-T载体中进行测序验证。用特异引物扩增CD40抗原分子的胞外段基因（可溶性CD40、sCD40基因片段）,再亚克隆至原核表达载体pGEX-5x-3,将测序正确的重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测目的蛋白。结果 RT-PCR能从XG-2细胞总RNA中扩增出特异的目的基因,测序结果显示与GenBank中登录的完全一致,构建的原核表达重组载体pGEX-5x-3/hCD40ECD在表达宿主菌BL21（DE3）中经IPTG诱导能获得有效表达,Western blot证实了目的蛋白条带的特异性。结论获得了人CD40分子的基因及其胞外段原核表达产物,为进一步研究CD40分子的功能和sCD40的应用奠定了良好的基础。     

大肠杆菌色氨酸酶基因的克隆与表达

应用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５中扩增出长约１．４Ｋｂ的色氨酸酶基因,将其插入高表达载体ｐＥＴ３ａ的ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ位点,转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）,构建高产色氨酸酶基因工程菌。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和薄层扫描表明,工程菌色氨酸酶的表达量占细胞总可溶性蛋白的６９．８％。酶活测定结果表明,７株工程菌色氨酸酶的活力比宿主菌均有不同程度的提高,其中ＷＷ－１１号比宿主菌高１６倍。     

人THANK基因的克隆和表达

目的：克隆人THANK基因全长及胞外区片段，将其胞外区在大肠杆菌中表达。方法：采用RT－PCR技术，从人白血病细胞系HL－60细胞总RNA中扩增人THANKcDNA，并定向克隆于pMD18－T载体，经测序证实，再业克隆THANK的胞外区片段至pET表达载体，在大肠杆菌中进行表达。结果：RT－PCR扩增出一个858bp的DNA片段，该片段与分布的人THANK基因序列一致。诱导后THANK胞外区在大肠杆菌中可表达出相对分子质量为2．6万的蛋白质。结论：成功地克隆了人THANK基因，并在大肠杆菌中获得表达，为其功能的研究打下基础。     

重叠PCR克隆Exendin-4的基因及序列分析

目的克隆Exendin-4 39肽氨基酸序列基因编码区cDNA。方法根据Exendin-4氨基酸序列编码cDNA,设计正、负向引物/模板链,利用重叠延伸PCR法扩增出Exendin-4编码区基因DNA片段;将获得的基因片段插入pGEM-T-Easy质粒中;转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,利用限制性内切酶及核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果经质粒DNA酶切分析及序列测定,获得了Exendin-4 DNA片段序列。结论本研究成功克隆了Exendin-4 cDNA,为下一步构建Exendin-4真核表达载体打下基础,也为Exendin-4基因治疗糖尿病提供了前提条件。     

重组模型人肿瘤坏死因子α的克隆及GST—TNF融合基因的构建

目的：构建膜结合型人肿瘤坏死因子与谷胱甘肽－S－转移酶（GST）的融合基因表达载体。方法：用RT－PCR一步法扩增出人膜结合型TNF基因片段,定向克隆到质粒pUC19中。再通过定向亚克隆插入真核表达质粒pGEX-4T-3中GST下游。结果：从激活的单核细胞中扩增出700bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结论：从激活的单核细胞中扩增出700bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结: 重组模型TNF的GST融合表达及纯化优化,为进一步定点突变,设计高效低毒的非分泌性膜结合TNF,用于肿瘤的基因治疗打下了良好的基础。     

肿瘤坏死因子受体超家族成员TNFRSF19的研究进展

肿瘤坏死因子受体超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily,TNFRSF）通过与肿瘤坏死因子超家族成员相互作用调节免疫应答,调控细胞生存、增殖和分化等。TNFRSF19是TNFRSF家族的新成员之一,主要表达于上皮细胞、毛囊和大脑组织细胞中。近年来相关研究表明,TNFRSF19在调节神经系统发育和维持干细胞干性中发挥重要生理功能。TNFRSF19在不同肿瘤中发挥截然相反的促癌或抑癌功能,其功能与肿瘤的组织来源密切相关。本文就TNFRSF19的生理功能及其在癌症中的最新研究进展进行简要综述。     

B淋巴细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增获得了编码BLys(134—285AA)的cDNA片段，该片段以限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ双酶切插入pET32a载体。测序表明除(ATA^263→ATG^263)突变并导致了氨基酸(1263M)突变外，其余序列与Genbank报道的序列一致。蛋白表达用异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，SDS—PAGE表明：在33ku处有明显的融合蛋白表达，其表达水平高达总茵体蛋白的50％。点印迹证实融合蛋白能与anti—His6Tag抗体反应。生物学活性研究表明BLys协同丝裂霉素能明显地抑制HeLa细胞的生长。     

肿瘤坏死因子超家族成员分子结构的研究进展

肿瘤坏死因子超家族成员(TNFSF)是体内重要的一类细胞因子,其含有共同结构序列——TNF同源结构域(THD),通过THD结构域,TNF配体与富含半胱氨酸结构域(CRDs)的TNF受体相结合。又由于不同分子含有的CRDs数目及类型的不同,使得TNF与TNF-R结合后发挥不同的生物学特点。现对TNF超家族和TNF-R的分子结构的研究进展予以综述。     

结核分支杆菌38KD蛋白基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的构建和克隆结核分枝杆菌38kD蛋白的基因，以转基因技术导入大肠杆菌，诱导表达，以获得大量38kD抗原。方法根据GenBank上编码38kD蛋白的基因系列，设计一对特异引物，通过PCR技术从结核分支杆菌H37Rv基因扩增出38kD蛋白基因片段；目的基因连接到克隆载体pMD 18-T Simple Vector，测序鉴定，目的片段双酶切下来克隆到原核表达载体pET-30a中，成功构建成带有N末6His-tag的融合表达载体。表达载体用化学转化法转化E．coli BL21（DE3），用菌落PCR筛选得到阳性克隆；经1mmol／L IPTG诱导4h表达外源蛋白；而且在37℃时蛋白表达量最高；二烷基磺酸钠一聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析结果。结果38kD序列与GenBank报道完全一致；用菌落PCR筛选得到阳性克隆；经1mmol／L IPTG诱导4h表达外源蛋白；而且在37℃时蛋白表达量最高；二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析结果显示，在大约38kD处有表达产物特异条带；可溶性分析表明，该重组蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在；纯化的包涵体纯度达到90％。结论获得38kD蛋白工程菌株，为将此抗原用于临床诊断应用打下基础。     

重组人可溶性THANK在大肠杆菌中的高效表达

目的:克隆人THANK的全长基因及编码可溶性胞外区的基因 ,并在大肠杆菌中表达可溶性THANK.方法:采用RT-PCR从PMA诱导的 HL60细胞中克隆人THANK全长编码基因,继以PCR扩增出可溶性THANK编码区基因(134～285位氨基酸),PCR产物克隆于pMD-18T,经DNA测序证实后亚克隆到pET-11a中.重组质粒转化B L21,以1 mmol/L IPTG进行诱导表达产物,SDS-PAGE分析表达产物,对重组蛋白经纯化复性后测定生物学活性.结果:RT-PCR扩增出编码人THANK全长编码基因及P CR扩增出THANK134-285基因的cDNA,经序列分析证实与文献报道完全一致.含有THA NK134-285编码基因的表达载体,转化大肠杆菌后表达出相对分子质量约18 000的重组蛋白.该重组蛋白经纯化后能够诱导U937细胞凋亡.结论:成功克隆了人THANK基因,并在大肠杆菌中表达重组可溶性THANK,该重组蛋白在实验条件下具有诱导U937细胞凋亡的作用.     

TRAIL胞膜外段融合蛋白在大肠埃希菌内可溶性表达

目的：研究在大肠埃希菌体内可溶性表达肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）胞膜外段融合蛋白，为其下一步的分离纯化奠定基础。方法：依据原核表达载体pGEX-2T多克隆位点限制性内切酶要求，设计TRAIL胞膜外段PCR引物，对TRAIL的克隆载体进行PCR扩增，回收目的片段后利用DNA连接酶构建TRAIL胞膜外段原核表达载体，应用相关的生物学软件对目的蛋白的理化性质及其溶解性进行预测。酶切鉴定后将阳性重组体转入大肠埃希菌DH5α体内，分别在不同浓度异丙基硫代－β-D－半乳糖苷（IPTG）、不同诱导温度、不同诱导时间作用下，利用SDS－PAGE分析目的蛋白可溶性表达量。结果：PCR扩增得到TRAIL胞膜外段DNA片段，酶切结果证实已成功构建了TRAIL胞膜外段原核表达载体，预测表明95％以上的TRAIL胞膜外段融合蛋白是以可溶性的形式表达，在0.1mmol/L IPTG,20℃诱导3－4h，目的蛋白可溶性表达量达峰值，占菌体蛋白的28％。结论：本实验可在大肠埃希菌体内表达可溶性的TRAIL胞膜外段融合蛋白。     

重组人胰岛素类似物蛋白在大肠杆菌中克隆、表达与纯化

目的:设计合成编码Des30、B26 H、B28D和B26 H-B28D基因,用大肠杆菌BL21(DE3)表达上述4种速效人胰岛素原蛋白,为探知B26 H-B28D功能和用植物系统表达速效胰岛素原类似物研究做必要的准备。方法:基于人胰岛素氨基酸和小C肽(TYPGDVPK)序列,按植物(油菜)偏爱密码子设计合成了198 bp编码人速效胰岛素原基因Des30。随后以Des30为模板,用PCR突变技术扩增并创造了基因B26 H、B28D和B26 H-B28D,并构建了4个原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导、用Ni-NTA亲和柱纯化、复性、胰岛素体外成熟(酶解)获得重组人胰岛素突变体蛋白。结果:4种人速效胰岛素原类似物在宿主菌中均以包涵体形式存在,IPTG诱导时间以8 h为佳。Western blot结果表明,带his-tag的速效人胰岛素原蛋白已成功在宿主菌中表达,用Ni-NTA亲和柱纯化获得了较纯的速效人胰岛素原蛋白。纯化的包涵体蛋白通过低温透析复性,然后用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,Western blot结果显示,释放出的单体胰岛素与阳性对照一样具有免疫活性,RP-HPLC和MALDI-TOF质谱检测表明,酶切产物分子量峰值分别与预测的人胰岛素类似物分子量一致。结论:该研究为B26 H-B28D功能研究和用植物系统表达人类胰岛素的研究奠定基础。     

尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因的克隆和序列分析

目的构建尿路致病性大肠杆菌（Uropathogenic Escherichia coli,UPEC）溶血素A（hemolysin A,HLYA）hlya基因重组质粒。方法根据已知GenBank中的hlya基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因组DNA中扩增编码hlya的基因片段,克隆至pUC18质粒,转化大肠杆菌DH5aЭ感受态细胞,经酶切及PCR鉴定,而后进行测序。结果hlya基因体外扩增产物大小约744bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,测序结果与己知序列基本吻合。结论在国内首次克隆了尿路致病性大肠杆菌hlya基因,为研究hlya的功能和探讨hlya作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒S蛋白受体结合域的克隆测序

目的 从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒S蛋白基因中,获得受体结合域(RBD)基因的克隆.方法 用PCR方法扩增RBD基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,并分析RBD基因序列.结果 获得了人和果子狸来源的RBD的基因片段,长度为579 bp,两者具有高度的同源性.结果 RBD是SARS冠状病毒与靶细胞结合的部位,本工作成功克隆了SARS冠状病毒的RBD基因,为该基因的表达和功能研究奠定了基础.     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆和表达

目的　构建pMal N重组表达载体 ,转化E .coliDH5α ,诱导表达犬瘟热病毒 (CDV)重组核衣壳 (N)蛋白。方法　采用RT PCR技术 ,从CDVRNA中扩增编码N蛋白的基因片段 ,通过连接反应 ,构建重组克隆载体和重组表达载体 ,转化感受态。E .coliDH5α细胞。通过IPTG诱导表达CDV重组N蛋白。结果　扩增出约 1 7kbCDV全长的主要结构蛋白N蛋白基因 ,通过PCR获得 5 36bpN蛋白基因片段。将N蛋白基因片段克隆入原核表达载体pMal C2 ,表达产物麦芽糖结合蛋白 (MAP)与N蛋白的融合蛋白的相对分子质量约 6 0× 10 3,与预期大小一致。结论　构建的pMal N重组载体所表达的CDVN蛋白为进一步研究CDV的特异、敏感的抗体检测方法打下基础