针刺治疗脑梗死大鼠血清的蛋白组学研究

目的：研究针刺治疗对脑梗死大鼠血清蛋白的影响。方法： 雄性SD大鼠20只,线栓法建立脑梗死模型,其中对照组10只,针刺组10只。针刺后1周,取血清,二维电泳分离蛋白,PDQ软件寻找差异表达的蛋白,用MALD I TOF /TOF串联质谱仪分析蛋白质,所得的质谱图通过GPS 软件在MASCOT数据库中检索并鉴定蛋白质。结果： 针刺后血清中有13种蛋白的表达下调,2种蛋白表达上调。选取3种蛋白进行鉴定,针刺后表达下调的蛋白是血清淀粉样蛋白P,表达上调的是丝氨酸蛋白酶抑制剂和白蛋白。结论 针刺可能通过提高丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达和肝合成蛋白的功能对脑缺血起保护作用。     

针刺治疗对脑梗死大鼠血清蛋白的影响

目的研究针刺治疗对脑梗死大鼠血清蛋白的影响。方法雄性SD大鼠20只,线栓法建立脑梗死模型,其中对照组10只,针刺组10只。针刺后1周,取血清,二维电泳分离蛋白,PDQ软件寻找差异表达的蛋白,用MALD I TOF/TOF串联质谱仪分析蛋白质,所得的质谱图通过GPS软件在MASCOT数据库中检索并鉴定蛋白质。结果针刺后血清中有13种蛋白的表达下调,2种蛋白表达上调。选取3种蛋白进行鉴定,针刺后表达下调的蛋白是血清淀粉样蛋白P,表达上调的是丝氨酸蛋白酶抑制剂和白蛋白。结论针刺可能通过提高丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达和肝合成蛋白的功能对脑缺血起保护作用。     

CD45在克罗恩病患者血清中的表达

目的 应用蛋白质组学方法在患者血清中寻找与克罗恩病相关的蛋白质.方法 采取克罗恩病患者以及正常成人血清蛋白样本各4例,用不同的CyDye荧光染料标记后进行胶内差异双向凝胶电泳(2-D DIGE),并对获得的图谱进行分析及对差异蛋白质进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱鉴定.结果 通过2-D DIGE分析,发现克罗恩病患者中存在29个表达异常蛋白质点,其中胶号为973的蛋白质点,在克罗恩病患者患者血清中比正常成人组表达升高2.55倍(P<0.05),该蛋白点经质谱鉴定为CD45.结论 CD45在克罗恩病患者血清的高表达提示在克罗恩病的病程中免疫系统失衡可能起着一定作用.     

卡维地洛预处理对大鼠缺血再灌注损伤心肌蛋白质组影响的初步研究

目的:研究卡维地洛对大鼠心肌缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I/R)损伤蛋白质组的影响,探讨其新的心肌保护机制.方法:18只大鼠随机分为假手术组、I/R损伤组和卡维地洛预处理组.经结扎冠脉左前降支30 min钟再灌注2 h建立大鼠心肌I/R损伤模型,测定血清丙二醛(Malondiadehyde,MDA)浓度,采用二维电泳技术分离心肌富胞浆蛋白质,应用PDQuest软件寻找差异表达的蛋白质点,并通过搜索二维电泳数据库进行蛋白的初步鉴定.结果:与假手术组比较,1/R损伤后血清MDA升高(P<0.05).有8个蛋白点表达下调(P<0.05),其中1个鉴定为超氧化物歧化酶,1个蛋白点表达缺失.与I/R损伤组比较,卡维地洛预处理组大鼠血清MDA浓度明显下降(P<0.01),5个蛋白点表达上调、4个蛋白点下调(P<0.05).3个蛋白点表达缺失,出现1个新表达蛋白点.卡维地洛预处理使I/R损伤后下调的超氧化物歧化酶表达正常化,使转甲状腺蛋白前体(Transthyretin precursor,TTRP)表达上调,肌球蛋白重链1碎片明显减少,使线粒体ATP合成酶α链前体和线粒体烯脂酰-CoA水化酶前体表达缺失.结论:心肌I/R损伤后胞浆蛋白质表达的变化以下调为主,其中超氧化物歧化酶的下调参与了心肌I/R损伤的分子机制;卡维地洛不仅通过恢复超氧化物歧化酶的表达,还通过上调TTRP表达这一新机制发挥其对心肌线粒体和结构收缩蛋白的保护作用.     

血清蛋白双向凝胶电泳-质谱分析诊断早期肺腺癌的临床研究

目的分析肺腺癌患者与正常人血清双向凝胶电泳的差异蛋白质,从而寻找肺腺癌早期特异性的诊断指标。方法用固相IPG梯度双向凝胶电泳分离肺腺癌患者及正常人血清总蛋白,用PDQuest凝胶图像软件分析,以识别差异蛋白质点。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI—TOF—MS）分析获得肽质量指纹图,然后利用Mascot查询软件搜寻数据库鉴定蛋白质。结果①获得了重复性较好的双向电泳银染图谱。②经PDQuest7．1软件匹配分析,共筛选出22个差异的蛋白点,对7个差异蛋白点进行胶内原位酶解-质谱指纹图分析,获得了7张肽质量指纹图谱,查询数据库鉴定出1个蛋白质-血清淀粉样蛋白A（SAA）。结论①固相pH梯度双向凝胶电泳分离血清总蛋白获得了重复性较好的双向电泳凝胶图谱。②肺腺癌患者血清和正常人血清的蛋白质组表达存在明显差异,这些差异蛋白点为进一步建立人肺癌的2-DE数据库奠定了基础。③SAA蛋白很可能是肺癌的一个潜在标志物。     

克罗恩病患者蛋白质组学差异表达的研究

目的 探讨克罗恩病患者血清中的差异表达蛋白.方法 选取在本院诊治的克罗恩病患者20例,采用各种CyDve染料实施交叉标记后,依据顺序实施MALDI-TOF-MS、2-D DIGE等鉴定操作.结果 对二者双向电泳图对比,发现克罗恩病患者在表达异常蛋白质点方面有多个,其中1058蛋白质点,相比于正常成人组,则存在明显升高,即1.67倍(P<0.05),此蛋白质通过质谱鉴定得知,乃是一种结合珠蛋白质.结论 在克罗恩病血清中,结合珠蛋白所存在的高表达,提示在其病程中免疫系统失衡可能存在一定作用.     

肝素治疗烧伤的蛋白质组学研究

[目的]利用蛋白质组学的方法,寻找肝素处理烧伤后差异表达的蛋白质,进一步探索肝素治疗烫伤过程的相关蛋白质,以期阐明肝素治疗烫伤的机制。[方法]制作小鼠Ⅱ度烫伤模型,使用肝素外敷治疗,并在第3天从肝素组（烫伤后用肝素治疗）、烫伤组（烫伤后自然愈合）和对照组（未进行烫伤处理）中各取5只小鼠处死,提取烫伤及其周围皮肤组织的蛋白质,采用双向凝胶电泳（2-DE）技术分离各组的蛋白质,用考马斯亮蓝方法染色。通过凝胶成像系统获得双向电泳凝胶图谱后,用PD Quest图像分析软件比较分析,从而确定差异表达的蛋白质。选取差异最明显的蛋白质点,经胰蛋白酶水解后,通过基质辅助激光解吸附飞行时间串联质谱（MALD I-TOF-MS/MS）对其进行肽质谱分析并与数据库比对,鉴定待测蛋白质。[结果]烫伤组共检测出75个蛋白质点,肝素组共检测出95个蛋白质点,其中肝素处理后上调2倍以上的蛋白质点有10个,下调2倍以上的点有4个。质谱分析初步鉴定表达差异最大的蛋白质点为载脂蛋白A-I前体。[结论]烫伤创面经肝素处理后表现出不同的蛋白质表达谱。     

胰腺癌肝转移相关分泌蛋白质的筛选

目的：比较人胰腺癌不同肝转移潜能细胞株分泌蛋白质谱的差异,筛选鉴定与胰腺癌肝转移相关的分泌蛋白质。方法：应用双向电泳技术分离一对来自同一亲本、具有不同肝转移潜能的人胰腺癌细胞株L3.6pl和Colo-357的分泌蛋白质,图像分析软件筛选出两者差异表达的蛋白质点,利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对部分差异蛋白质点进行鉴定。结果：建立了L3.6pl和Colo-357细胞分泌蛋白质的双向电泳图谱,识别出差异表达的蛋白质点20个,质谱鉴定出5个蛋白质点,其中组织蛋白酶D前体、表皮型脂肪酸结合蛋白在高肝转移潜能细胞株L3.6pl中的表达水平高于低肝转移潜能细胞株Colo-357,而视黄醛脱氢酶1、二磷酸核苷激酶B、膜连蛋白A1在L3.6pl细胞株中的表达水平低于Colo-357细胞株。结论：高、低不同肝转移潜能的胰腺癌细胞株分泌蛋白质的表达存在明显差异,两者间的差异蛋白可能与胰腺癌肝转移密切相关,胰腺癌肝侵袭转移的特性可能是诸多蛋白共同作用的结果。     

双向电泳联合串联质谱技术筛查人胃癌血清蛋白质标记物

目的:通过血清蛋白质组学技术寻找胃癌标记物,是目前肿瘤研究的热点.文中比较胃癌患者与正常人血清蛋白质的差异,以寻找候选血清标记物. 方法:①随机选取20例胃癌患者(胃癌组)血清,pTNM分期(Ⅰ～Ⅳ期)各5例,10例正常人(对照组)血清作对照.②血清样品处理:通过蛋白亲和柱去除血清清蛋白和IgG两种高丰度蛋白.③通过双向电泳进行差异比较,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI/TOF/TOF/MS)鉴定差异蛋白点.④利用免疫印记方法对筛选的标记物蛋白质进行验证. 结果:发现胃癌患者较正常人存在多个蛋白质点差异,差异蛋白质点质谱鉴定结果显示,补体 C4-B 前体在胃癌血清中含量明显增高;补体因子Ⅰ前体和血清结合珠蛋白前体则含量显著降低(P＜0.01). 结论:利用血清蛋白质组学技术可筛选出胃癌血清蛋白标记物,为胃癌的血清学诊断提供依据.     

结直肠癌有无肝转移血清差异蛋白质表达的研究

目的:利用蛋白质组学技术分离、鉴定结直肠癌有无肝转移患者血清中差异蛋白质,筛选诊断肝转移的血清蛋白标志物。方法:根据入组条件,收集结直肠癌无肝转移病例、有肝转移病例,在两组中随机抽取12例血清样本,同组血清等量混合进行双向凝胶电泳,建立两组血清蛋白质双向电泳图谱,用Image-Master V5.0软件寻找两组差异蛋白质点,MALDI-TOF-MS对差异蛋白质进行鉴定,查询生物信息数据库对差异蛋白质进行初步分析。结果:两组比较差异在2倍以上蛋白质有8种,其中5个蛋白质表达上调,3个蛋白质表达下调;两组每个差异蛋白灰度体平均值比较差异均有统计学意义(P0.05)。通过数据库搜索鉴定出7种蛋白质,上调的5个蛋白质分别是Transferrin、Complement component C9、RNA directed DNA polymerase(RNA指导的DNA合成酶)、Conserved hypothetical-protein(假定蛋白质)、SEC14L1 7 kDa protein;下调的2个蛋白质分别是Haptoglobin和Isoform 1 of Serum albumin。结论:结直肠癌有无肝转移患者血清中的蛋白质表达谱有一定的差异性,这些差异蛋白质可能成为诊断肝转移的血清标志物。     

Characterization of acute renal allograft rejection by human serum proteomic analysis

To identify acute renal allograft rejection biomarkers in human serum, two-dimensional differential in-gel electrophoresis （2-D DIGE） and reversed phase high-performance liquid chromatography （RP-HPLC） followed by electrospray ionization mass spectrometry （ESI-MS） were used. Serum samples from renal allograft patients and normal volunteers were divided into three groups： acute rejec- tion （AR）, stable renal function （SRF） and normal volunteer （N）. Serum samples were firstly processed using Multiple Affinity Removal Column to selectively remove the highest abundance proteins. Differentially expressed proteins were analyzed using 2-D DIGE. These differential protein spots were excised, digested by trypsin, and identified by RP-HPLC-ESI/MS. Twenty-two differentially expressed proteins were identified in serum from AR group. These proteins included complement C9 precursor, apolipoprotein A-IV precursor, vitamin D-binding protein precursor, beta-2-glycoprotein 1 precursor, etc. Vitamin D-binding protein, one of these proteins, was confirmed by ELISA in the independent set of serum samples. In conclusion, the differentially expressed proteins as serum biomarker candidates may provide the basis of acute rejection noninvasive diagnosis. Confirmed vitamin D-binding protein may be one of serum biomarkers of acute rejection. Furthermore, it may provide great insights into understanding the mechanisms and potential treatment strategy of acute rejection.     

紫外线照射前后日本血吸虫尾蚴可溶性虫体蛋白组分的比较

目的利用蛋白质组学技术分离、鉴定日本血吸虫正常尾蚴及紫外线致弱尾蚴虫体间差异表达蛋白。方法分别收集与制备血吸虫正常尾蚴和致弱尾蚴虫体总蛋白,经固相pH梯度双向凝胶电泳分离。凝胶银染并利用ImageMaster2DSoftware5.0凝胶图像分析软件进行比较分析,选取差异表达蛋白点经基质辅助激光解析离子飞行时间质谱仪进行鉴定。结果二维凝胶电泳图像分析结果显示:正常尾蚴和致弱尾蚴各分离出至少1277、1173个清晰、独立的蛋白点,蛋白点匹配率为72.7%,大多数蛋白点相对分子量处于22000～95000范围内,理论等电点为5～8。尾蚴经紫外线致弱前后共发现18个差异表达蛋白,其中5个蛋白于致弱尾蚴中表达消失,12个表达下调,1个表达增强,未见新增表达蛋白。其中13个差异表达蛋白经MALDI-TOF-MS鉴定分析,获悉其肽指纹图谱、理论等电点、分子量及表达水平变化等相关信息。结论利用二维电泳、MALDI-TOF-MS等蛋白质组学技术,共鉴定出13个致弱尾蚴差异表达蛋白,为进一步阐明致弱尾蚴诱导宿主产生高免疫保护力的分子机制提供了实验基础。     

乙腈预处理血清寻找肝细胞癌发病相关的蛋白质

【目的】 应用乙腈(ACN)预处理血清的方法,对肝细胞癌(HCC)患者的血清进行蛋白质组分析,寻找与HCC发病相关的蛋白质&#65377; 【方法】 收集原发性HCC患者和健康人的血清各12例,首先使用乙腈预处理,然后去除白蛋白和免疫球蛋白等高丰度蛋白质,再进行双向电泳(2-DE)分析,筛选HCC与健康对照血清中有显著性差异的蛋白质斑点,并进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定&#65377; 【结果】 血清经0%&#65380;20%和30%浓度的乙腈预处理后,进行2-DE分析发现蛋白质斑点的检出数量分别为532 ± 96&#65380;623 ± 102和674 ± 123;对预处理后HCC患者和正常人的血清进行差异分析,发现甲状腺素(Tetraiodo-L-Thyronine)和Proapolipoprotein的表达上调,而维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding Protein)和铁传递蛋白(Transferrin)的表达下调&#65377; 【结论】 对血清样本的蛋白质组分析,应用乙腈预处理会增加与白蛋白非特异性结合的蛋白质的检出;HCC患者血清中甲状腺素等4个蛋白的表达异常与HCC相关&#65377;     

荧光差异双向凝胶电泳筛选肾透明细胞癌及癌旁组织中的差异表达蛋白

目的 寻找肾癌相关肿瘤标记物,用于肾癌临床诊断、药物治疗靶点的选择及预后监测.方法 采用荧光差异双向凝胶电泳技术筛选15例肾透明细胞癌及癌旁正常肾组织差异表达蛋白质点.统计学采用t检验进行定量比较,以两组蛋白含量比值在1.5倍及以上,P<0.05,被认为是差异表达蛋白质点.用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱或串联质谱技术进行差异表达蛋白质点鉴定.结果 共筛选分离出27个差异表达蛋白质点,经质谱技术共成功鉴定了26种蛋白质,11种蛋白质在肾癌组织中上调,15种蛋白质下调.其功能覆盖细胞活动的多个方面,其中线粒体短/支链特异性酰基辅酶A脱氢酶、醛糖1-表异构酶、PRDX4、CAPG、β-防御素107、微纤丝相关糖蛋白4等6种蛋白是我们首次采用蛋白质组学技术成功筛选的肾癌差异表达蛋白质,并发现了1个预测蛋白(UCRIL).结论 荧光差异双向凝胶电泳在肾癌组织中获得较好的筛选效果,新筛选的差异表达蛋白有望成为肾癌分子生物学标记物,为后续研究提供了实验依据.     

肝纤维化组织相关功能蛋白质组的差异分析

目的建立肝纤维化组织双向凝胶电泳图谱,初步分析蛋白质组的变化与差异表达。方法利用2-DE分离肝纤维化组织和正常肝组织总蛋白质后,经图像分析识别差异表达的蛋白点,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异蛋白质,并用Western印迹方法对其中3个蛋白质的表达水平变化进行验证。结果比较分析肝纤维化组织和正常肝组织的2-DE图谱,找到差异蛋白点59个,其中在肝纤维化组织表达上调30个,下调29个。并对其中15个表达差异3倍以上的蛋白点进行了肽质量指纹图分析,鉴定出10个与细胞信号转导、细胞增殖、氧化应激有关的蛋白质,14-3-3β、DJ-1及PEBP蛋白的Western印迹验证结果与2-DE的检测结果相一致。结论肝纤维化组织和正常肝组织之间存在一些差异表达的蛋白质,为进一步阐明肝纤维化的发生机制奠定基础。     

慢型克山病患者血清蛋白质双向凝胶电泳图谱分析

目的 分析克山病(KD)患者差异表达的血清蛋白质。 方法 以慢型KD和正常血清标本为研究对象,利用双向凝胶电泳(2-DE)分离KD和健康人血清蛋白质,银染显色,PowerLook2100XL扫描仪(Umax)透射扫描获取图像,ImageMaster 2D Platinum 5.0软件分析图像。并通过与ExPASy-SWISS-2DPAGE数据库关联,推测KD相关的差异蛋白。 结果 建立了稳定的慢型KD和健康人血清蛋白质2-DE图谱,分别检测到808和814个蛋白质点,匹配率96.5475%。软件分析显示2组样本共有44个差异蛋白质点,11个仅在KD组血清中表达,12个仅在正常血清组出现,21个为共有蛋白但在表达量上存在差异(KD组14个上调、7个下调,差异倍数 ≥ 3倍,P<0.01)。将差异蛋白与ExPASy-SWISS-2DPAGE数据库关联,在匹配值范围内出现的353个蛋白中,仅比对出KD 2-DE图谱胶内编号为1177的蛋白点在属性上与数据库中的P02774 2-D0004T6名为维生素D结合蛋白(VDBP)匹配度最高,推测编号为1177的差异蛋白是VDBP。 结论 KD患者与正常人血清蛋白质组存在明显差异。推测VDBP可能通过炎症免疫反应途径参与了KD的心肌损伤。     

下咽癌相关血浆肿瘤标志物的蛋白质组学筛选

目的分析下咽癌患者与健康人血浆中差异表达的蛋白质组,筛选潜在的与下咽癌诊断密切相关的血浆肿瘤标志物。方
法取下咽癌患者与健康人空腹血浆标本各6 例分别等量混合成2 组样本,去除血浆高丰度蛋白后,利用双向电泳（2-DE）进行分
离,经软件分析后找出表达量变化2倍以上的差异蛋白点,接着利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）
进行差异蛋白质鉴定,然后利用Western blotting 对α2-HS-糖蛋白的表达量进行验证。结果下咽癌患者与健康人血浆相比较,
筛选出表达量差异2倍以上的差异蛋白点共11 个,其中表达上调的有5个,表达下调的有6个,进行质谱分析后,表达上调的蛋
白有α2-HS-糖蛋白、结合珠蛋白;表达下调的蛋白有免疫球蛋白κ链C结构域、载脂蛋白A1。Western blotting结果表明,α-2-HS-
糖蛋白的表达上调,与双向电泳结果一致。结论下咽癌患者与健康人血浆的蛋白质表达谱表现出一定差异,这些差异蛋白有可
能成为下咽癌患者早期诊断的特异性血浆肿瘤标志物。
     

癌胚抗原阴性的人大肠癌组织蛋白质组的研究

目的：比较癌胚抗原（CEA）阴性的人大肠癌组织与CEA阳性的人大肠癌组织之间的蛋白质表达差异。方法：收集大肠癌患者切除癌组织的新鲜标本,根据血清CEA分为阴性组、阳性组,同时取正常黏膜作对照组,提取各组组织的总蛋白,进行双向凝胶电泳和凝胶图谱差异分析,比较各组组织之间表达差异点,将这些差异蛋白点进行质谱分析数据库鉴定。结果：各组双向电泳胶上蛋白癍点图象清晰,阴性组和阳性组中差异表达的蛋白点18个,成功鉴定其中10个为9种蛋白质。其中,在阴性组中特异表达的蛋白质点为含波形蛋白的混合物1、肝脂肪酸结合蛋白,表达上调的蛋白质点为肌动蛋白结合蛋白22-a．、热休克蛋白27序列、血红蛋白B链突变体;在阳性组中特异表达的蛋白质点磷酸甘油醛异构酶、角蛋白10、角蛋白1,表达上调的蛋白质点为13微管蛋白链。结论：CEA阴性的人大肠癌组织与CEA阳性的人大肠癌组织存在蛋白质组差异表达,这些蛋白可能与大肠癌表达CEA有关。     

蛋白质组学方法筛选维甲酸耐药相关蛋白

目的比较维甲酸耐药细胞与敏感细胞的差异蛋白表达谱,分析、筛选维甲酸耐药相关蛋白。方法双向凝胶电泳分离维甲酸耐药细胞株MR2及维甲酸敏感细胞株NB4的全蛋白,经PDQuestv 7．1分析软件筛选出差异表达的蛋白质点,质谱分析获得差异蛋白质的肽质量指纹图谱,以此通过Mascot软件查询SWISS-PROT蛋白数据库,进行差异蛋白质的鉴定,获得候选维甲酸耐药相关蛋白。采用蛋白质印迹试验及半定量RT-PCR在蛋白水平和mRNA水平对差异蛋白质进行验证。结果获得了分辨率高、重复性好的APL细胞的双向电泳图谱,维甲酸耐药细胞株MR2及维甲酸敏感细胞株NB4的pH4-7双向凝胶电泳图谱显示平均蛋白点分别为890±45和912±56。在二者间分析到57个差异蛋白点,23个蛋白点在RA耐药细胞株MR2中上调,34个蛋白点下调。25个差异蛋白点经质谱鉴定,17个获得成功鉴定,对应于13个不同分子,其中一个是未知功能的新蛋白FLJ00279,其余分属于癌蛋白（DJ-1）,转录相关蛋白（MYC启动子结合蛋白1）,分子伴侣[热应激蛋白（HSP）HSPT0、HSP60及蛋白质二硫键异构酶],代谢类蛋白（抑制素、磷酸丙糖异构酶1及钙网蛋白）和信号转导（Rho GDP dissociation inhibitor beta）以及细胞骨架蛋白（ACTG1蛋白、β-5-微管蛋白抑制素及角蛋白10）。癌蛋白DJ-1、calreticulin、HSP60及ACTG1在RA耐药细胞株MR2中为高表达,其余为低表达。蛋白印迹试验结果与双向电泳结果一致且展现了DJ-1和calreticulin在多个异构体上有差异表达。但半定量RT-PCR显示HSP70和HSP60的蛋白质表达差异与其mRNA水平变化无相关一致性。两种实验结果提示翻译后蛋白的修饰或剪切介导了蛋白的表达差异。结论应用双向凝胶电泳连接质谱的蛋白质组学方法筛选到新蛋白FLJ00279以及功能已知的DJ-1、calreticulin、HSP70、HSP60、抑制素及MYC启动子结合蛋白1等维甲酸耐药相关蛋白,虽然它们与维甲酸耐药的直接关系还需进一步证实,但为从多因素角度上认识维甲酸耐药机制提供了新的线索。