大鼠椎间盘纤维环细胞的培养和鉴定

背景:许多学者认为椎间盘退变必有其细胞学改变,而探讨椎间盘退变机制必须有可靠的细胞模型.目的;尝试建立大鼠椎间盘纤维环细胞体外培养体系,并对其表型进行鉴定.设计、时间及地点:以细胞为观察对象的随机分组实验,于2005-09/2006-05在解放军第三军医大学新桥医院实验中心完成.材料:清洁级1月龄SD大鼠30只,体质量100g左右,雌雄不拘.方法:采用酶消化法分离大鼠椎间盘纤维环细胞,进行单层培养.主要观察指标:观察其形态结构和生物学特性,通过甲苯胺蓝、免疫细胞化学和碱性磷酸酶染色等方法对其细胞表型进行鉴定.结果:成功进行细胞单层培养,细胞形态为圆形或多角形,胞质含有大量的粗面内质网;原代细胞生长较慢,第2代细胞生长加快;细胞具有甲苯胺蓝异染性;有Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的阳性表达;细胞碱性磷酸酶染色阳性.结论:采用酶消化法可成功培养大鼠椎间盘纤维环细胞,表型鉴定符合纤维环细胞特征.     

大鼠椎间盘纤维环细胞的培养及鉴定

背景:目前关于椎间盘纤维环细胞的培养方面还没有形成统一的标准,导致实验的操作性和重复性存在缺陷。目的:通过对椎间盘纤维环细胞的体外培养,观察细胞的演变,以期为组织工程研究椎间盘纤维环提供方法和体外模型。方法:采用酶消化法分离SD大鼠椎间盘纤维环细胞,进行单层培养,实验在原代培养中使用体积分15%胎牛血清的DMEM培养基,细胞传代培养一代后可换成体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基。倒置相差显微镜观察其形态结构和生物学特性,通过甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色等方法对其细胞表型进行鉴定。结果与结论:培养的椎间盘纤维环细胞形态为圆形或梭形;原代细胞生长较慢,传代细胞生长增快;细胞具有甲苯胺蓝易染性;免疫细胞学方法检测表明纤维环细胞有Ⅰ,Ⅱ型胶原表达。结果证实,实验成功在体外培养了大鼠椎间盘纤维环细胞。     

大鼠椎间盘纤维环细胞的培养及鉴定

背景：目前关于椎间盘纤维环细胞的培养方面还没有形成统一的标准,导致实验的操作性和重复性存在缺陷。目的：通过对椎间盘纤维环细胞的体外培养,观察细胞的演变,以期为组织工程研究椎间盘纤维环提供方法和体外模型。方法：采用酶消化法分离SD大鼠椎间盘纤维环细胞,进行单层培养,实验在原代培养中使用体积分15％胎牛血清的DMEM培养基,细胞传代培养一代后可换成体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基。倒置相差显微镜观察其形态结构和生物学特性,通过甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色等方法对其细胞表型进行鉴定。结果与结论：培养的椎间盘纤维环细胞形态为圆形或梭形;原代细胞生长较慢,传代细胞生长增快：细胞具有甲苯胺蓝易染性：免疫细胞学方法检测表明纤维环细胞有I,II型胶原表达。结果证实,实验成功在体外培养了大鼠椎间盘纤维环细胞。     

细胞凋亡与大鼠椎间盘纤维环退行性变的关系

目的：观察增龄和负重对椎间盘纤维环细胞凋亡与形态的影响。方法：通过手术截肢及特殊饲养建立双后肢大鼠模型（实验组）,取同龄正常大鼠作为对照组。在第3,6,9,12个月时实验组和对照组分别随机选取8只处死观察,取出L4-5椎间盘及相邻上下椎体组织。椎间盘取材后,行HE染色以及TUNEL染色。计数纤维环活细胞以及凋亡细胞数目,并且观测纤维环破损程度。结果：①凋亡显著出现于纤维环中,随着大鼠月龄的增长凋亡加剧且细胞密度显著降低。实验组纤维环的凋亡率在6个月时较对照组明显增加,实验组6个月、9个月组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。②实验组的纤维环结构较对照组发生更严重的退变,细胞显著减少、胶原纤维粗大、走行紊乱、纤维环变薄并伴随裂隙出现。结论：除增龄外,负重是增加纤维环细胞凋亡、加重椎间盘纤维环破损和退变的重要因素。     

纤维环损伤对椎间盘的影响

椎间盘突出症是脊柱外科的常见病和多发病,椎间盘切除术作为一种行之有效的治疗方法在临床上应用广泛,手术方法多种多样,近年来又出现了内窥镜下髓核摘除术等微创手术。然而即使是微创手术,对纤维环的损伤也是不可避免的。学者们也日益关注椎间盘手术本身对脊柱的负面影响,提出     

组织工程椎间盘纤维环的研究与进展

背景：组织工程是永久性修复退变椎间盘的新策略,然而髓核组织工程方法无法完整重建椎间盘的结构和功能,所以,相应的纤维环组织工程被认为是组织工程椎间盘治疗策略的主要限制因素之一。目的：综述组织工程椎间盘纤维环的研究与进展,为组织工程椎间盘研究提供理论基础。方法：由第一作者用计算机检索Pubmed、CNKI及维普数据库,限定时间为2000/2010,中英文检索词分别为＂组织工程、椎间盘、纤维环、种子细胞、支架材料、生长因子＂和＂tissue engineering,intervertebral disc,annulus fibrosus,seed cell,scaffold,growth factor＂,语言分别设定为中文和英文。从组织工程椎间盘纤维环的种子细胞来源,支架材料选择,生长因子3方面进行归纳介绍。结果与结论：共检索到106篇文章,按纳入和排除标准对文献进行筛选,保留34篇文章进行综述。目前组织工程椎间盘研究重点在构建纤维环组织与髓核组织上。关于功能化纤维环的构建还处于起始阶段,种子细胞、支架材料以及生长因子的选取仍需进一步的实验研究。     

组织工程椎间盘纤维环的研究与进展

背景:组织工程是永久性修复退变椎间盘的新策略,然而髓核组织工程方法无法完整重建椎间盘的结构和功能,所以,相应的纤维环组织工程被认为是组织工程椎间盘治疗策略的主要限制因素之一.目的:综述组织工程椎间盘纤维环的研究与进展,为组织工程椎间盘研究提供理论基础.方法:由第一作者用计算机检索Pubmed、CNKI及维普数据库,限定时间为2000/2010,中英文检索词分别为"组织工程、椎间盘、纤维环、种子细胞、支架材料、生长因子"和"tissue engineering,intervertebral disc,annulus fibrosus,seed cell,scaffold,growth factor",语言分别设定为中文和英文.从组织工程椎间盘纤维环的种子细胞来源,支架材料选择,生长因子3方面进行归纳介绍.结果与结论:共检索到106篇文章,按纳入和排除标准对文献进行筛选,保留34篇文章进行综述.目前组织工程椎间盘研究重点在构建纤维环组织与髓核组织上.关于功能化纤维环的构建还处于起始阶段,种子细胞、支架材料以及生长因子的选取仍需进一步的实验研究.     

纤维环切口方式与椎间盘愈合强度的实验性研究

目的了解纤维环的愈合能力和三种纤维环切口对椎间盘愈合强度的影响,寻找较为合理的切口方式。方法21只新西兰大白兔经腹膜外入路暴露5个连续腰椎间盘。对实验组的椎间盘施行纤维环切开并髓核部分摘除术,分别采用线性、矩形和弧形三种纤维环切口,每种切口有24个椎间盘。分别于术后2、4和6周三个时段将兔处死后取出脊柱,每个时段有8个椎间盘,分别测定椎间盘最大承受压力,以评价其在不同时段的愈合强度,并行椎间盘组织学观察。结果组织学观察发现无论切口形式,纤维环均于术后4到6周显示出纤维愈合,但线形切口及弧形切口在各时段伤道较矩形切口为窄。各切口组椎间盘的愈合强度在术后2和4周均显著低于对照组。矩形切口组在2周时愈合强度显著地低于线形和弧形切口组,2周以后仍低,但差异没有显著性。结论①纤维环具有一定纤维性愈合的能力。②纤维环切口方式对椎间盘愈合强度存在一定的影响,保留更多的纤维环可能获得更好的愈合。③弧形切口兼具线形切口组和矩形切口组的优势,可能是一种较为合理的纤维环切口方式。     

颈椎间盘纤维环组织的成骨潜能

背景：椎间盘组织的骨化机制及脊柱韧带、纤维组织的骨化演变过程尚不清楚。目的：实验拟观察颈椎间盘纤维环组织在骨融合过程巾的成骨潜能。设计、时间及地点：对比观察，于2006—10在解放军第二军医大学实验动物中心和上海市伤骨科研究所充成。材料：健康实验山羊10只，雄性6只，雌性4只。羊用钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器由常州康辉医疗器械有限公司参照羊的颈椎仿人用钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器定制。方法：实验山羊按常规颈椎前路减压、内固定施术，随机取颈2-6椎间隙中相邻的2个间隙，每个间隙各置入2枚钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器，共4枚。3枚钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器中的填充组织分别为：单纯松质骨，松质骨＋纤维环，纤维环。1枚不充填任何组织作为空白对照。主要观察指标：术后6，12周分别拍摄山羊颈椎正侧位X射线平片、颈椎CT平扫观察植入物在位及融合情况。组织学观察各组植骨融合情况及局部组织反应。结果：①X射线平片及CT显示实验山羊内植钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器在整个实验过程中均在位，无松动、移位、脱落。山羊内植钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器与椎体的骨-金属界面周围有骨组织生长，与椎体终板接触部位有成骨现象，骨桥形成。②单纯松质骨组新生软骨、骨小梁存在，原植入骨坏死；松质骨＋纤维环组纤维组织有坏死、原骨小梁、纤维环周围新生骨存在，新生软骨堆积；纤维环组术后6周纤维组织内有纤维软骨存在，12周新生软骨存在；空白组对照组术后6周组织学观察无阳性染色结果，12周有少量新生软骨。结论：颈椎间盘纤维环组织的成骨形式可能是成纤维细胞的软骨化骨生成。     

纤维环穿刺法与纤维环切开法建立兔椎间盘退变模型

背景:椎间盘退行性变模型的建立,是研究椎间盘退行性变病理过程和尝试基因治疗等的基础,建立的动物模型要求与人类椎间盘退行性变具有相似性和可比拟性,但目前尚缺乏公认的最佳实验动物模型.目的:比较纤维环穿刺法和纤维环切开法建立兔椎间盘退变动物模型的差异.方法:将32只新西兰大白兔以数字表法随机分为纤维环穿刺组和纤维环切开组.经腹膜外入路暴露L_(3/4)、L_(4/5)、L_(5/6)椎间隙,纤维环穿刺组采取针刺纤维环,纤维环切开组采取尖刀切开纤维环,控制穿刺或切开的深度及方向.术后2,4,12,20周通过MRI和组织病理学检查观察腰椎间盘髓核变性及组织病理情况.结果与结论:术后4周,兔椎间盘髓核面积缩小,纤维环面积增大,髓核内T2加权像信号降低、变暗,椎间隙高度也开始下降,纤维环穿刺组T2信号强度评分较纤维环切开组低(P＜0.05);随着时间的进展,兔椎间盘T2信号强度评分逐步增高,椎间隙逐渐变窄,术后20周椎间盘T2信号强度评分达最高,两组比较差异无显著性意义.随着时间的进展,两组髓核内细胞含量逐渐减少,纤维软骨形成.提示纤维环穿刺法和纤维环切开法均可成功建立椎间盘退变模型,但纤维环切开法椎间盘的退变程度较纤维环穿刺法剧烈,建立的模型过程可能不是人体椎间盘自然退变的模拟过程,纤维环穿刺法比较真实地模拟了人类椎间盘损伤后的退变过程.     

芍药苷促椎间盘纤维环细胞增殖的作用

背景：芍药在颈椎病治疗中使用频率超过30%,其主要单体之一芍药苷具有抗炎、抗凋亡等作用,芍药苷对椎间盘纤维环细胞是否有保护作用,国内外未见报道。目的：探讨芍药苷对椎间盘纤维环细胞的增殖和保护作用。方法：采用酶消化法体外培养椎间盘纤维环细胞。取第3代纤维环细胞,培养过程中加入20μg/LFas配体诱导建立纤维环细胞凋亡模型,通过MTT法测定芍药苷干预纤维环细胞的最适宜浓度,AnnexinV/FITC-PI法观察芍药苷对椎间盘纤维环细胞的保护作用。结果与结论：芍药苷浓度20.8和2.08μmol/L对椎间盘纤维环细胞具有明显的促增殖作用。20μg/LFas配体能诱导细胞凋亡,20.8μmol/L芍药苷对Fas配体诱导椎间盘纤维环细胞有保护作用。     

芍药苷促椎间盘纤维环细胞增殖的作用

背景:芍药在颈椎病治疗中使用频率超过30%,其主要单体之一芍药苷具有抗炎、抗凋亡等作用,芍药苷对椎间盘纤维环细胞是否有保护作用,国内外未见报道。目的:探讨芍药苷对椎间盘纤维环细胞的增殖和保护作用。方法:采用酶消化法体外培养椎间盘纤维环细胞。取第3代纤维环细胞,培养过程中加入20μg/LFas配体诱导建立纤维环细胞凋亡模型,通过MTT法测定芍药苷干预纤维环细胞的最适宜浓度,AnnexinV/FITC-PI法观察芍药苷对椎间盘纤维环细胞的保护作用。结果与结论:芍药苷浓度20.8和2.08μmol/L对椎间盘纤维环细胞具有明显的促增殖作用。20μg/LFas配体能诱导细胞凋亡,20.8μmol/L芍药苷对Fas配体诱导椎间盘纤维环细胞有保护作用。     

兔纤维环干细胞与猪脱细胞纤维环基质的生物相容性

背景：脱细胞纤维环基质和纤维环干细胞均来源于纤维环组织,二者复合构建的组织工程复合物可能具有更好的生物相容性。
　　目的：将兔的纤维环干细胞和猪的脱细胞纤维环基质进行体外共培养,观察细胞在脱细胞基质支架上的生长状态。
　　方法：制备猪脱细胞纤维环基质,通过扫描电镜和 DAPI 染色观察材料制备效果,傅里叶红外光谱仪鉴定基质的成分;分离和培养兔纤维环干细胞,将第1代纤维环干细胞种植于脱细胞纤维环基质表面,行细胞骨架染色,倒置免疫荧光显微镜和扫描电镜下观察细胞形态,并绘制细胞生长曲线。
　　结果与结论：制备成的猪脱细胞纤维环基质呈白色半透明状,扫描电镜下为纤维网状结构,DAPI染色显示无细胞残留,红外光谱分析显示脱细胞纤维环基质主要成分是胶原蛋白。细胞在支架材料上生长第1,3,7天的细胞骨架染色显示细胞很好的黏附于支架表面,生长状态良好,表明脱细胞纤维环基质有着良好的生物相容性,纤维环干细胞在其表面生长良好。     

脱矿脱细胞骨基质环孔隙度作为组织工程椎间盘纤维环细胞支架材料的可行性

目的：观察脱矿脱细胞骨基质环孔隙度是否适合作为组织工程椎间盘纤维环细胞支架：方法：实验于2005—08／2006-01在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。①选用成年健康新西兰兔10只，按随机抽签法分为2组：实验组和对照组，每组5只。实验组取兔股骨近端骨制成环状，改进一般制备脱矿骨基质的方法，删除明胶化步骤，并进行脱细胞处理。使骨组织保留多孔结构，制成支架材料；对照组取兔股骨近端骨制成环状，不进行脱矿脱细胞处理。②两组均使用Zhang氏液体置换法测定材料的孔隙度。结果：新西兰兔10只均进入结果分析。实验组支架材料孔隙率为82．5％～91．1％，平均（87．8&;#177;2.8）％；对照组孔隙率为81.3％-88.4％，平均（85．5&;#177;2.2）％：两组标本孔隙度比较，差异不明显（P〉0．05）。结论：经改进的方法制备的脱矿脱细胞骨基质环保持了骨的多孔结构，孔隙度指标达到作为支架材料的基本要求。     

脱矿脱细胞骨基质环孔隙度作为组织工程椎间盘纤维环细胞支架材料的可行性

目的:观察脱矿脱细胞骨基质环孔隙度是否适合作为组织工程椎间盘纤维环细胞支架。方法:实验于2005-08/2006-01在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。①选用成年健康新西兰兔10只,按随机抽签法分为2组:实验组和对照组,每组5只。实验组取兔股骨近端骨制成环状,改进一般制备脱矿骨基质的方法,删除明胶化步骤,并进行脱细胞处理,使骨组织保留多孔结构,制成支架材料;对照组取兔股骨近端骨制成环状,不进行脱矿脱细胞处理。②两组均使用Zhang氏液体置换法测定材料的孔隙度。结果:新西兰兔10只均进入结果分析。实验组支架材料孔隙率为82.5%～91.1%,平均(87.8±2.8)%;对照组孔隙率为81.3%～88.4%,平均(85.5±2.2)%。两组标本孔隙度比较,差异不明显(P>0.05)。结论:经改进的方法制备的脱矿脱细胞骨基质环保持了骨的多孔结构,孔隙度指标达到作为支架材料的基本要求。     

经皮纤维环穿刺与经肌间隙纤维环刀刺建立兔椎间盘退变模型

背景：有研究表明椎间盘退变模型的建立可为椎间盘退变治疗提供实验载体,但目前尚缺乏公认的最佳实验动物模型。 目的：比较经皮纤维环穿刺法和经肌间隙纤维环刀刺法建立兔椎间盘退变模型的差异。 方法：将新西兰大白兔分别采用经皮纤维环穿刺法和经肌间隙纤维环刀刺法建立兔椎间盘退变模型,穿刺后4,8,16周通过磁共振和组织病理学检查观察腰椎间盘髓核变性及组织病理情况。 结果与结论：穿刺后4周,两组兔椎间盘髓核内T2加权像信号降低、变暗,椎间隙高度下降,但经皮纤维环穿刺组T2信号强度评分较经肌间隙纤维环刀刺组低（P〈0.05）;穿刺后8周,两组T2信号强度评分均增高,经皮纤维环穿刺组T2信号强度评分较经肌间隙纤维环刀刺组低（P〈0.05）;穿刺后16周,两组兔椎间盘髓核内T2信号强度评分达最高且差异无显著性意义,两组椎间隙均明显变窄,椎间盘均亮度变黑,两组差异不明显;经皮纤维环穿刺组手术时间少于经肌间隙纤维环刀刺组（P〈0.05）,经肌间隙纤维环刀刺组感染率为5.6%,而经皮纤维环穿刺组无感染。结果证实,经皮纤维环穿刺法建立兔椎间盘退变模型建模时间短,感染率低,效果优于经肌间隙纤维环刀刺法造模。