巨细胞病毒单克隆抗体的研制和初步应用

应用人巨细胞病毒(CMV)AD169株,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,得两株(1F9和2H10)能分泌单克隆抗体(McAb)标记酶和荧光素以后,能与AD169株病毒感染的人胚肺二倍体细胞发生特异性染色反应,而与正常细胞和其它疱疹病毒感染的细胞不发生染色反应,说明两株McAb特异性好。用标记酶的1F9 McAb检测抗体,建立抗体捕获EL-ISA(Antibody Capture ELIKA ACEL     

用基因工程表达的HBcAg制备抗-HBcAg单克隆抗体及其初步应用

用基因工程表达的NBcAg免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,以ELISA抑制法检测抗体,获得28株分泌抗-HBc McAb的杂交瘤细胞系。对其中7株进行了克隆化,培养上清抗体滴度1:320～1:2560,免疫小鼠腹水和血清滴度1:10万～1:80万。Ig类型测定2株IgG1、2株IgG2a、1株IgG3、2株IgM。杂交瘤细胞系在体外连续传代培养6个月及液氮冻存的细胞系经复苏后仍能稳定地分泌McAb。得到的McAb只与HBcAg反应且能被HBcAg特异阻断,证明其特异性高。用ELISA间接法测定了McAb的相对亲和力,从50％最大结合的浓度分析结果,7株McAb的相对亲和力为2E6>2F5>2B11>2C10>1A7>1B7>1H7,浓度范围为0.6～10μg/ml。2E6和2C10 2株McAb与HRP结合,用ELISA双抗休夹心法筛选出2F5、2B111和H7 3株McAb适合作为包被抗体。2F5与2E6-HRP配对,建立了快速McAb-ELIS抑制法测定患者血清中抗-HBc。用本法测定了222份临床患者血清标本,结果与“华美”试剂盒测定结果基本一致。     

抗rHIV—env1肽单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

用rHIV-env_1肽免疫BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合,经4次克隆化获5株杂交瘤细胞系,其分泌抗体类型均属IgM。经连续传代6个月及液氮冻存9个月,分泌抗体特性无明显变化。5株McAb对rHIV-env_1肽或HIV-1均能明显地识别。用ELISA间接法测定各株McAb的相对亲和力,有3株(F7、B10、D6)McAb的50％最大结合浓度介于0.9～5μg/ml之间,用已如HIV-gp120抗体阳性血清阻断4株McAb与相应抗原的结合试验,所获结果各异。其中McAb B10与rHIV-env_1肽抗原的结合均可被4份HIV-gp120抗体阳性血清明显阻断,故初步认为B10McAb与抗HIV-gp120抗体中的保守肽段具有共同成分,抗HIV-env_1肽高度保守肽段的McAb,对艾滋病(AIDS)患者和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的诊断具有实际应用价值。     

H5N1流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体的研究

目的 制备抗人流感病毒H5N1株M1蛋白的单克隆抗体,为流感的快速诊断和研究提供新的工具.方法 应用在大肠埃希菌中表达的人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)株M1蛋白,以纯化的表达产物免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与sp2/0细胞系作细胞融合后,间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并应用间接免疫荧光法对抗体的特异性进行鉴定.结果 获得3株能稳定分泌抗禽流感病毒M1抗原的McAb杂交瘤细胞株,交叉反应试验及间接免疫荧光检测表明,三株McAb具有型特异性.结论 用H5N1禽流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体,具有一定的交叉反应性,可用于多种亚型甲型流感病毒的检测.     

抗人肺癌单克隆抗体(3D3)的研制及其特性鉴定

本文用人肺腺癌组织免疫的BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合,获得1株单克隆抗体(McAb 3D3)。Ig类测定为IgG_1型。杂交瘤培养上清液和腹水的效价分别为1∶10~3～10~4和1∶10~6。采用间接免疫荧光法(IFA)观察到McAb3D3主要与肺腺癌细胞株A549和L342反应,与其它组织肿瘤细胞株没有反应。ABC免疫酶染色试验显示McAb3D3主要与肺腺癌组织反应,与正常肺组织没有反应。     

巨细胞病毒单克隆抗体的制备及其初步应用

用CMV AD-169株感染自制人胚肺纤维母细胞,制备抗原,免疫BALB/c小鼠,取其牌细胞与Sp2/0-Ag14细胞融合,建立了一株稳定分泌抗HCMV特异性McAb的3B_6杂交瘤细胞株。3B_6McAb经鉴定属于IgG_3亚类。用间接免疫荧光法和间接酶免疫法证实为抗CMV特异性抗体。用微量细胞培养中和试验证实3B_6McAb在加有豚鼠血清后可阻止HCMV感染后细胞病变的出现。3B_6 McAb经间接免疫荧光法检测中,晚期孕妇羊水细胞中HCMV抗原,在68例标本中有一例为阳性,阳性率为1.47％。该法方便,快速可为在胎儿时期诊断先天性HCMV感染提供依据。     

A组轮状病毒单克隆抗体特性鉴定及临床初步应用

本文报道了A组RV McAb的特性鉴定及临床初步应用。用从河南省腹泻犊牛粪便中分离的HN-7毒株(RV)抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术获得2株分泌A组RV特异性McAb的杂交瘤细胞系。经鉴定,所获2个McAb(2C7.3C9)与A组RV第1血清型Wa株、第3血清型SA-11株,第6血清型NCDV株以及从国内猪、牛粪便中分离的4株未分型毒株的间接ELISA效价达10~(-5)～10~(-6),但与这7R-V毒株的血凝抑制滴度≤1:8,中和效价≤1:100,表明,这2个McAb是针对A组RV共同抗原的。琼脂糖双向扩散结果,2C7为小鼠IgG1亚类,3C9待鉴定。用RVMcAb建立的单夹心ELISA技术测定162例人,牛腹泻粪样,阴阳性总符合率与常规 ELISA相比较,为98.8％(160/162)。     

巨细胞病毒单克隆抗体的制备及其初步应用

用CMV AD-169株感染自制人胚肺纤维母细胞，制备抗原，锣疲BALB／c小鼠，．取其脾细胞与Sp2／0-Ag14细胞融合，建立了一株稳定分泌抗HCMV特异性McAb的3B0杂交瘤细胞株。3B0McAb经鉴定属于IgG3亚娄。用间接免疫荧光法和间接酶免疫法证实为抗CMV特异性抗体。用微量细胞培养中和试验证实3B0McAb在加有豚鼠血清后可阻止HcMV感染后细胞病变的出现。3B0McAb经间接免疲荧光法检测中，晚期孕妇羊水细胞中HCMV抗原，在68例标本中有一例为阳性，阳性率为1．47％。该法方便，快速可为在胎儿时期诊断先天性HCMV感染提供依据。     

EHF病毒感染家兔后血清特异性抗体水平的动态观察

本文报告了流行性出血热病毒(Epidemic haemorrhagic fever virus,EHFV)J10、A9株分别感染实验家兔后,用反向间接ELISA(RIELISA)和间接免疫荧光(IFA)方法,动态观察了家兔特异性IgG抗体水平的变化。发现特异性IgG于感染后第1周开始出现,以后抗体水平稳步上升,于第5—7周便达到最高水平,高滴度的抗体可以维持较长时间。结果还表明;RIELISA检测家兔抗体的敏感性明显优于IFA法。用IFA进行的交叉反应还证实;EHFV-J10、A9两种毒株的抗血清能与不同来源的数株病毒发生特异性结合反应。     

抗白血病患者IgM同种型和独特型McAb识别抗原表位的分析

本文应用间接ELISA试验,混合ELISA夹心试验,ELISA抑制试验对抗B-CLL患者血清IgM同种型和独特型McAb的特异性和亲和力进行了分析。并采用ELISA双抗体相加试验,检测了McAb识别抗原的表位。试验结果表明,14株McAb中10株为抗独特型McAb,4株为抗同种型McAb。对ELISA双抗体相加试验测得结果经微机集群处理分析,可将4株抗同种型McAb分成2组,10株抗独特型McAb分成4组。ELISA相加试验结果与间接混合ELISA抑制试验结果一致。结果提示,14株McAb至少可以识别6个不同的抗原表位。     

人巨细胞病毒单克隆抗体的研制检定和应用

采用人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＡＤ１６９株作为免疫原，制备出１３株鼠－鼠杂交瘤细胞系。对其中的６株进行了检定．免疫印迹试验结果表明：单克隆抗体（ＭｃＡｂ）７Ｂ４、７Ｄ７、７Ｅ１１、８Ｅ８和８Ｄ６相对应的ＨＣＭＶ多肽分子量分别为４６、１５０、３８、５１７２和６５ｋＤ．ＨＣＭＶ感染人胚肺二倍体细胞（２ＢＳ）后不同时间制成抗原片，与ＭｃＡｂ作间接免疫荧光试验。结果表明：ＭｃＡｂ８Ｂ８相应的病毒多肽为即刻早期抗原，其它５株ＭｃＡｂ相应的病毒多肽均为晚期抗原，６株ＭｃＡｂ等量混合后，标上辣根过氧化物酶，用于ＩｇＭ抗体捕获法ＥＬＩＳＡ（ＭａｃＥＬＩＳＡ）中，并与间接ＥＬＩＳＡ（ＩＥＬＩＳＡ）同时检测ＨＣＭＶ－ＩｇＭ．在未经选择的１００份脐带血中，两法均为阳性的３份，两法均为阴性的９４份；ＭａｃＥＬＩＳＡ阳性而ＩＥＬＩＳＡ阴性的２份血清的特异性试验证明，ＨＣＭＶ－ＩｇＭ确为阳性．ＩＥＬＩＳＡ阳性而ＭａｃＥＬＩＳＡ阴性的１份血清的特异性试验证明，它是由ＲＦ引起的假阳性。     

抗人肝再生增强因子单克隆抗体的研制

目的　利用纯化的重组人肝再生增强因子(hALR)制备抗hALR的单克隆抗体,建立hALR的检测方法。方法 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,经ELISA和免疫印迹证明其特异性。结果获得了4株分泌抗hALR特异性抗体的杂交瘤 细胞系;无血清培养液效价为1×10-2,腹水效价为1×10-5;亚类鉴定表明2株单克隆抗体为IgGl,另2株为IgG2b;免疫印迹 显示抗体结合抗原的分子量与hALR相符,为特异性抗hALR抗体。结论通过杂交瘤技术,获得了抗hALR的单克隆抗体 为以后的工作奠定了基础。     

抗Epstein－Bars病毒壳抗原gp125单克隆抗体的研制

用重组痘苗病毒在１４３细胞上表达的ｇＰ１２５粗提物免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，用杂交瘤技术获得７株稳定分泌抗Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｓ（ＥＢ）病毒ｇｐ１２５单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对杂交瘤细胞及单克隆抗体进行一系列分析和鉴定，初步建立了用表达产物及特异性单克隆抗体检测ＥＢ病毒ＩｇＡ／ｇｐ１２５抗体的三步ＥＬＩＳＡ法。用此法检测ＩｇＡ／ＶＣＡ阳性的鼻咽癌病人血清及ＩｇＡ／ＶＣＡ阴性的正常人血清，结果完全吻合。     

一株与正常人细胞成分反应的巨细胞病毒单克隆抗体的鉴定

用ＨＣＭＶ－ＡＤ１６９株抗原建立了一株分泌ＨＣＭＶＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株Ｎ４Ｅ６。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析发现ＭｃＡｂ与ＨＣＭＶ抗原和正常人成纤维细胞（ＨＥＦ）抗原均有多条免疫沉淀带出现：与ＨＣＭＶ－ＡＤ１６９株抗原反应的沉淀带为８９Ｋ，８７Ｋ，７３Ｋ和４２Ｋ；与Ｄａｖｉｓ株抗原反应的为８９Ｋ，８７Ｋ，４４Ｋ；与８１６地方株抗原反应的为８９Ｋ，８７Ｋ，７３Ｋ，４４Ｋ；与ＨＥＦ抗原反应的为８９Ｋ，８７Ｋ，４４Ｋ。表明Ｎ４Ｅ６除能识别ＨＣＭＶ－ＡＤ１６９株和８１６地方株特异成分７３Ｋ，外，尚能识别ＨＣＭＶ和ＨＥＦ共同成分８９Ｋ，８７Ｋ和４４Ｋ。     

抗AIV(H9)独特型单克隆抗体的制备及其免疫原性的研究

用H9N2亚型AIV作为抗原免疫接种SPF鸡制备高免血清,用饱和硫酸铵法从该血清中提取免疫球蛋白G(IgG)。以该IgG制备弗氏佐剂疫苗免疫SPFBALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1在聚乙二醇(PEG)作用下融合,采用间接ELISA检测法,筛选获得3株(2H1D1、2H1G4、3H2D7)分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。3株融合细胞培养上清液中的单克隆抗体效价均为2-4,小鼠腹水中的单抗效价是细胞培养上清液中的300～500倍。经检测表明,3株细胞系产生的单克隆抗体仅与相应的鸡抗H9N2亚型AIV血清发生特异性反应。用2H1D1分泌的抗独特型单克隆抗体制备疫苗与抗AIV灭活疫苗同时免疫SPF鸡收获的高免血清与AIV在MDCK细胞上进行中和实验,中和效价分别为10-1.8/10μl、10-1.6/10μl。由此表明,该抗独特型抗体疫苗具有良好的免疫原性。     

Demonstration of antigenic variation among isolates of human cytomegalovirus using monoclonal antibodies and indirect ELISA

An indirect ELISA was developed for the detection of antigenic differences between isolates of human cytomegalovirus (HCMV) using a monoclonal antibody to an early (67 kDa) antigen. Antibody binding curves were analyzed using a microcomputer program (LISACRV) based on a nonlinear logistical model. The derivation of values for the average intrinsic association constant for seven isolates of HCMV and the prototype AD 169 strain revealed significant differences between them. Because of the importance of HCMV as a pathogen, especially in immunosuppressed and AIDS patients, further investigation of the biological significance of differences between isolates of HCMV is clearly warranted.     

用单克隆抗体作柯萨奇病毒A24型抗原分析

用我国分离的一株C A24 V制备的单克隆抗体,对10株C A24病毒作了抗原分析。8个荧光阳性的单抗对所试验的9株C A24 V均呈现明显荧光反应,其中4个对C A24原型株荧光试验也阳性,另4个则为阴性。5个具有中和作用的单抗均不中和C A 24原型株,其中一个单抗对新加坡E H24/70株有低滴度中和,3个单抗中和日本分离的二株病毒及我国1986年福建分离的一株病毒。而所有这5个单抗均中和我国1986年从河南、上海分离的二株病毒及1988年从北京、辽宁和福建分离的三株病毒。     

抗淋球菌PIA单克隆抗体的制备和应用分析

用淋球菌全菌体免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取脾细胞与Ｓｐ２／０骨髓瘤细胞融合，以纯化ＰＩＡ做ＥＬＩＳＡ间接法筛选，获得５株稳定分泌抗ＰＩＡ的ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株。５株ＭｃＡｂ中３株为ＩｇＭ类（２Ｈ１１，４Ｈ８，４Ｅ１０），另２株分别为ＩｇＧ１（１Ｃ２）和ＩｇＧ２ｂ（５Ａ５）亚类。２Ｈ１１和１Ｃ２为高亲和力抗体，１Ｃ２与５Ａ５识别的抗原表位相同。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ试验表明，５株ＭｃＡｂ均能从复杂的淋球菌菌体崩解物中特异地识别分子量为３５ＫＤａ的ＰＩＡ抗原，与淋球菌ＰＩＢ无交叉反应。     

抗伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立抗伏马菌素B1（FB1）的单克隆杂交瘤细胞株,制备抗FB1的单克隆抗体（McAb）。方法采用FB1-KLH偶联物小剂量长周期免疫BALB/c小鼠后,采用细胞融合方法获得分泌抗FB1的杂交瘤细胞株,采用多次亚克隆的方法建立了4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株。腹水诱生法获得大量McAb,采用抗体亚类测定试剂盒鉴定抗体的亚类,SDS-PAGE测定抗体分子量,McAb的特异性和灵敏度用间接竞争抑制ELISA。结果免疫小鼠血清检测结果显示经过5次免疫后血清的效价稳定在1×10-6,经过4次亚克隆后建立4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株,获得腹水,纯化抗体,抗体亚类属于IgG2a类,轻链为κ,轻链和重链的相对分子质量分别是55000和32000,ELISA检测抗体特异性显示可与FB1发生特异性反应,采用此抗体建立间接竞争抑制ELISA方法的线性范围在2～500ng/ml。结论制备了特异性和灵敏度较高的抗FB1单克隆抗体,为建立伏马菌素免疫学检测方法打下良好基础。     

抗人B因子单克隆抗体的制备及其特性的初步研究

本文以人B因子免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,获得六株(A_2、B_2、B_7、C_9、F_9、F_(10))分泌抗人B因子单克隆抗体(单抗)的杂交瘤细胞系。用ELISA检测细胞培养上清和小鼠腹水的特异性抗体效价,分别为10~(-2)—10~(-3)和10~(-4)—10~(-5)。抗原阻断试验结果,说明这些单抗是B因子特异的。经取代试验和ACH_(50)抑制试验,提示B因子具有耐热和不耐热二组抗原决定基。A_2和B_2针对不耐热抗原决定基,能抑制补体旁路途径活化;B_7和C_9针对耐热抗原决定基,不影响补体旁路途径活化;F_9和F_(10)则既能与耐热决定基发生反应,也具有抑制补体旁路活化的功能。用固相抗原竞争抑制试验,分析B因子的抗原表位,发现6株单抗可识别4个抗原决定基。这些单抗对B因子结构与功能的研究,B因子在补体旁路活化过程中与有关补体成分之间的相互关系的研究,都是很有意义的。