初治与复发B细胞急性淋巴细胞白血病患者白血病相关免疫表型的比较

目的比较初治和复发时B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的白血病相关免疫表型（LAIP）特点,探讨其对微量残留病（MRD）监测的影响.方法标记4～6组四色抗体组合,利用多参数流式细胞术（FCM）以CD45/SSC设门对410例初治和6例复发的B-ALL患者进行免疫分型检测.并采用CD34/CD10/CD45/CD19为主的2种四色荧光标记抗体组合,对98例B-ALL患者进行多参数FCM MRD检测.结果与初治B-ALL患者相比,复发患者中CD45异常表达者明显增多,分别为37.8%和69.2%（P=0.000）.通过对15例初治和复发患者的配对样本分析,9例患者（包括8例骨髓复发,1例中枢神经系统复发）出现免疫标志变化,其中4例患者CD45表达减弱,2例增强;4例患者CD34表达减弱;2例患者CD10表达增强,而CD19较稳定.对7例骨髓复发患者进行了MRD随访检测,均在复发前的2～4个月发现MRD,并且表型与复发后一致.结论较高比例的复发患者出现免疫表型变化,这种改变在复发前的MRD状态时已经出现,但不影响MRD监测的准确性.     

多参数流式细胞术在儿童急性B淋巴细胞白血病微量残留病检测中的应用

目的:探讨多参数流式细胞术在儿童急性B淋巴细胞白血病微量残留病检测中的应用价值。方法:基于初诊儿童急性B淋巴细胞白血病相关的免疫表型,采用四色流式细胞术、CD45/SSC和CD45/CD19双参数散点图设门,以CD19-APC/CD45-PerCP/CD10-FITC/CD34-PE为主的抗体组合检测53例68份完全缓解后儿童急性B淋巴细胞白血病的微量残留病细胞。结果:53例初发儿童急性B淋巴细胞白血病检测出18种白血病相关的免疫表型,98.11%患儿存在CD45、CD10、CD19、CD34表达量的异常。12例存在0.012%～0.55%的白血病细胞,为微量残留病阳性,5例保持初诊时的免疫表型异常,7例发生免疫表型变化,占58.33%,只用CD19-APC/CD45-PerCP/CD10-FITC/CD34-PE一组抗体组合发现10例微量残留病阳性(83.33%)。结论:根据儿童急性B淋巴细胞白血病初诊白血病相关的免疫表型,用CD19/CD45/CD10/CD34为主的抗体组合能够有效监测微量残留病。     

四色流式细胞术检测B细胞急性淋巴细胞白血病微量残留病的临床意义

目的探讨利用四色流式细胞术（FCM）检测B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）微量残留病（MRD）的临床意义.方法采用以抗CD34/CD10/CD45/CD19为主的两种四色荧光标记抗体组合,对98例B-ALL患者的671份骨髓标本和1份脑脊液标本进行FCM多参数MRD检测,98例随访患者中26例无发病初期的免疫分型资料.结果FCM检测显示白血病细胞＜0.0001（MRD阴性）的标本为579份;白血病细胞＞0.0001的样本数为93份,其中64份骨髓标本白血病细胞比例＜0.05,29份标本白血病细胞比例＞0.05,我们将其归为复发病例（包括治疗后未达CR的病例）.共20例患者复发,其中19例血液学复发,1例中枢神经系统复发.15例血液学复发者在复发前7～17周发现MRD阳性,包括发病时免疫分型资料不明者6例,MRD水平均＞0.0001;2例分别在复发前3个月和9个月检测MRD为阴性,此后中断检测.在诱导治疗结束和治疗3个月时,如果MRD水平＞0.0001,复发率为50%（12例中有6例复发）,而MRD阴性组复发率为7.5%（40例中有3例复发）（P=0.000）.结论利用FCM进行MRD跟踪监测可预测复发,治疗初期患者MRD＞0.0001,复发的危险性较高.而在掌握了正常B祖细胞抗原表达规律的基础上,可不完全依赖于发病时的免疫表型资料.     

急性白血病患者造血B祖细胞分析及其意义

正常造血B祖细胞与急性B淋巴细胞白血病细胞在形态学和免疫表型等方面极其相似,易造成诊断失误。本研究回顾性分析664份样本,通过造血B祖细胞的免疫表型鉴别并观察其在急淋、急非淋患者初诊及化疗后不同时期造血B祖细胞数量的变化,探讨其在临床中的鉴别诊断意义。采用流式细胞术检测方法,以非恶性血液病病例87份样本作为对照组,以急性白血病患者不同进展期的577份样本作为检测组（其中T-ALL 26份、BALL 261份、AML 290份）,共计664份样本通过CD34/CD10/CD19/CD45抗体组合鉴定并定量造血B祖细胞群,以不同进展期的临床状态（初诊、缓解、复发）、年龄、瘤细胞浸润度为分类基础,进行了与造血B祖细胞含量的相关性分析。结果表明：1造血B祖细胞：CD45呈阴性至弱阳性连续分布,SSC（侧向散射信号）较低,早期造血B祖细胞群CD34阳性,随着细胞成熟度的增加,CD34消失。CD19、CD10在造血B祖细胞整个阶段均为阳性,早期CD10表达强度更高。2造血B祖细胞百分含量：在对照组、T-ALL、B-ALL、AML患者中分别为1.36%、0.60%、1.39%、0.80%;检出率分别87.4%、61.5%、83.5%、75.9%;初诊、缓解、复发组造血B祖细胞含量分别为0.37%、1.66%、0.55%。3随着年龄的增长及瘤细胞侵润度的增加,造血B祖细胞有逐渐下降的趋势。4造血B祖细胞含量超过5%的样本主要分布于白血病患者缓解期。结论：造血B祖细胞群在造血系统/非造血系统疾病中均有不同程度的存在,其数值的变化与疾病进展状态、年龄、瘤细胞浸润度密切相关。造血B祖细胞数量在化疗缓解期后有一过性增加,此阶段出现的CD19、CD10双阳性群体是否来源于正常造血细胞克隆还是恶性血细胞克隆,需谨慎诊断。利用流式细胞术多色分析的优势,优化抗体组合,准确鉴定正常造血B祖细胞对临床诊疗及微小残留病的检测均有重要意义。     

八色流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病微小残留病方法的建立

目的 建立八色流式细胞术(8c-FCM)检测急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)微小残留病(MRD)的方法,并进行初步验证.方法 采用CD19/侧向角散色光(SSC)、CD45/10和CD34(或cTdT)联合设门,两管八色抗体组合检测B-ALL的MRD.将B-ALL细胞株Nalm-6细胞掺入正常人骨髓细胞中,使Nalm-6细胞占有核细胞比例为10.00％、1.00％、0.10％、0.01％和0.005％,采用已建立的8c-FCM,进行回收试验和重复性试验,评价检测方法的准确度和精密度.检测抗体标记Nalm-6后保存不同时间的荧光强度变化,评价各荧光抗体的稳定性.检测并分析39份骨髓细胞免疫表型,包括对照者9例,初发或复发B-ALL患者9例,B-ALL化疗或骨髓移植(BMT)后缓解期病例21例,评价8c-FCM方法检测正常骨髓B淋巴系细胞群和B-ALL细胞的免疫表型结果,以及对B-ALL的MRD 检测结果,并探讨其与现用四色流式细胞术(4c-FCM)的可比性.结果 建立了以CD19、CD45、CD10为主的两管八色抗体组合检测MRD的方法;当掺入的细胞株占有核细胞比例≥0.10％时,变异系数(CV)＜2.5％,平均回收率为95.81％;当获取106个细胞,Nalm-6细胞比例10.00％ ～0.01％时,检测到的Nalm-6细胞占骨髓有核细胞比例与实测值呈线性相关(r=0.99,P＜0.05),该法检测骨髓中Nalm-6细胞的灵敏度达到0.01％.Nalm-6细胞株标记抗体后随时间延长略有降低,但24h内平均荧光强度减低＜10％.应用该方法检测骨髓中CD19阳性的B淋巴系细胞,对照组呈现4个连续发育阶段,可分为4期:Ⅰ期CD45low/CD10stro/CD20 -/CD38stro/CD34+或cTdT+,Ⅱ期CD45 +/CD10+/CD20-/CD38stro/CD34+或cTdT+,Ⅲ期CD45 +/CD10 +/CD20-/CD38stro/CD34 -或cTdT-,Ⅳ期CD45stro/CD10 -/CD20 +/CD38low/CD34 -或cTdT -.初发和复发B-ALL患者骨髓中白血病细胞与对照组相比,均存在抗原表达异常;8c-FCM检测B-ALL缓解组,有5例存在MRD,主要抗原表达与4c-FCM检测结果一致,5例MRD细胞的范围为0.02％～5.42％.结论 本研究所建立的两管8c-FCM新方法检测骨髓中白血病细胞的重复性好、准确度高,可鉴别骨髓正常B淋巴系细胞群、B-ALL治疗缓解后骨髓造血重建的B系前体细胞与MRD细胞群;和4c-FCM比较,两管8c-FCM新方法的标本用量少,检测速度快,能够有效诊断B-ALL的MRD.     

CD123在淋巴细胞白血病细胞中的表达及在微量残留病监测中的作用

目的 探讨CD123在淋巴细胞白血病中的表达特点及意义.方法 应用多参数流式细胞术检测139例淋巴细胞白血病患者CD123的表达.以10名正常人骨髓淋巴细胞作对照.对105例急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患者行细胞遗传学分析.对97例B-ALL患者进行白血病微量残留病(MRD)分析.结果 ①10名正常人骨髓中B淋巴干/祖细胞、成熟B淋巴细胞及T淋巴细胞均不表达CD123.139例淋巴细胞白血病患者中,5例T-ALL和23例慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)患者CD123均阴性.111例B-ALL患者中106例CD123阳性(阳性率95.49%),其中包括12例早期前B-ALL、57例普通B-ALL、37例前B-ALL;5例成熟B-ALL患者CD123阴性.②在B-ALL患者中,CD123表达水平与p-Akt表达水平呈正相关,超二倍体患者组CD123表达水平高于非超二倍体患者组.③MRD阳性与阴性组患者比较,12个月内复发率分别为63.04%和21.56%,差异有统计学意义(P<0.01).MRD阴性组无病生存率[(48.23±1.82)%]高于MRD阳性组[(36.06±2.62)%].CD123在复发B-ALL患者中表达稳定性高.结论 CD123在B-ALL患者中普遍中度至强度表达,复发时表达稳定性高,是MRD分析较好的标志之一.     

多参数流式细胞术分析415例成人和儿童B-ALL白血病相关免疫表型

为了探讨FCM在微量残留病（MRD）检测中的意义，利用4—6组4色抗体组合，以CD45／SSC设门法对273例成人和142例儿童B系急性淋巴细胞白血病（B—ALL）患者进行了多参数流式细胞术（FCM）免疫分型检测和白血病相关免疫表型（leukemia associated immunophenotyping，LAIP）分析。结果表明：根据CD34和CD10的表达特点，可将B—ALL患者分为Ⅰ型（CD34^＋CD10^-）；Ⅱ型（CD34^＋CD10^＋）；Ⅲ型（CD34-CD10^＋）；Ⅳ型（CD34^-CD10^-）。Ⅰ型和Ⅱ型患者LAIP的阳性比例分别为100％和92％，但Ⅲ型患者LAIP阳性率只有79．2％，显著低于Ⅰ型和Ⅱ型患者。总体B—ALL患者LAIP的检出率为90％，成人与儿童组无明显差异。而利用CD34／CD10／CD19／CD45一组抗体，LAIP检出率达到77．6％。结论：90％成人和儿童B-ALL白血病患者具有LAIP，因此对这类患者适宜用多参数流式细胞术进行MRD监测。     

高表达 CD123 的 CD34+CD19+细胞为 Ph 染色体阳性急性淋巴细胞白血病复发预测的新标记简

本研究探讨CD123在成人Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia,Ph＋ ALL）患者CD34＋ CD19＋细胞上的表达特点及其在复发预测中的作用.2010年1月-2012年4月北京大学血液病研究所经规范化诊治的49例18-60岁初诊Ph＋ ALL患者纳入本研究,在初诊及治疗后不同时间点通过多色流式细胞术监测CD34＋ CD19＋细胞上CD123的荧光强度及表达比例,同时利用实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RQ-PCR）监测BCR-ABL1融合基因变化.与正常B祖细胞相比,获得完全缓解后任意时间点骨髓标本中异常高表达CD123的CD34＋ CD19＋细胞大于10个定义为免疫残留阳性（FCM阳性）.结果表明,①初诊及复发Ph＋ ALL患者CD34＋ CD19＋细胞上CD123的平均荧光强度（mean fluoresce intensity,MFI）[8.52（3.71-32.35）vs8.93 （4.79-29.74）vs1.31（0.21-1.75）,P＜0.05],以及异常高表达CD123的CD34＋ CD19＋细胞比例（84.63％（55.07％-99.96％）vs 84.50％（57.68％-99.80％）vs0.99％ （0.45％-1.83％）,P＜0.05]均显著高于健康供者的正常B祖细胞.入组的全部初诊及复发Ph＋ ALL患者的CD34＋CD19＋细胞均高表达CD123.②多色流式细胞术监测异常高表达CD123的CD34＋ CD19＋细胞和RQ-PCR检测BCR-ABL1融合基因的结果之间具有良好的相关性（n=49例,360对,Spearmanr=0.90,P＜0.0001）.③13例复发患者中有11例在复发前3个月MRD监测表明,在复发前中位时间60（30-73）天均检出FCM阳性.结论：通过多色流式细胞术检测异常高表达CD123的CD34＋ CD19＋细胞可与RQ-PCR检测BCR-ABL1融合基因互为补充,共同应用于Ph＋ ALL患者的MRD监测以及复发预测.     

三染色-流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病微量残留病的研究

目的 建立三染色－流式细胞术检测微量残留白血病细胞。方法 利用三染色－流式细胞仪检测急性B淋巴细胞白血病患独骨髓中的CD10^ CD22^ CD45^-或dim表现型白血病细胞。结果 在23例急性B淋巴细胞白血病患儿骨髓中均可检测到CD10^ CD22^ CD45^-或dim表现型细胞,检测敏感度约为10^－4。正常人骨髓、化疗后再和髓和长期完全缓解的白血病患儿的未检测到CD10^ CD22^ CD45^-或dim表现型细胞。该法可在化疗后50d内监测到白血病细胞的变化,并且在骨髓细胞形态学确认复发之前即可检测到白血病细胞逐渐增加。结论 利用三染色－流式细胞仪检测骨髓中的CD10^ CD22^_CD45^-或dim表现型白血病细胞可以敏感地监测到急性B淋巴细胞白血病患儿微量残留病的变化。     

CD10在儿童期B-急性淋巴细胞白血病中的表达特点及其在微小残留病检测中的意义

本研究的目的是观察CDl0在儿童期B急性淋巴细胞白血病(BALL)中的表达情况，并探讨CDl0在白血病微小残留病检测中的应用价值。用流式细胞术分析58例儿童期急性淋巴细胞白血病表型，观察CDl0在BALL病例骨髓细胞中的表达特点，并将CDl0抗体与其它多种抗体构成四色组合用于B-ALL的微小残留病检测，评价其所起到的作用。结果表明，65、5％(38／58)的BALL具有CDl0过强表达(CDl0^bright)的特点，而且CDl0^bright与CD34的阳性表达率有关——CDl0^bright多出现于CD34阳性率高的B-ALL中。CDl0^bright在微小残留病检测中，与其它异常表达的抗原形成的组合能够在双参数点图上很好地区分出白血病细胞群与正常细胞群。即使在其他抗原表达无异常时，也可因CDl0的过强表达而使白血病细胞群与正常细胞群区分开。结论：CDl0^bright与BALL中CD34的高比例表达相关，CDl0^bright也是微小残留病检测的一个很好的指标，CDl0的表达与其他用于微小残留病检测的抗原表达的应用有互补作用。     

动态监测微小残留病对B—ALL预后的临床意义

目的探讨微小残留病（MRD）监测在B急淋（B-ALL）复发预测及指导治疗中的临床意义。方法选择2008年1月到2012年7月32例初治急性B淋巴细胞白血病160份骨髓标本,利用四色多参数流式细胞术（FCM）进行微小残留病检测。以CD45／SSC设门,选择2-3组四色抗体组合,从诱导化疗第33天开始,每1—3个月监测MRD一次,动态监测MRD变化与白血病复发的关系。结果按照诱导治疗第33天的MRD水平分成三组,高（MRD〉1×10^-2）,中（1×10^-2≥MRD≥1×10^-4）,低（MRD〈1×10^-4）;MRD〉10^-2组与MRD％10^-4组比较复发率筹异有统计学意义（P〈0．05）;10^-4≤MRD≤10^-2组与MRD％10^-4组比较复发率差异无统计学意义（P〉0．05）。MRD％10t是预后好的指标。儿童B-ALL多次发现MRD阴性、阳性（10^-4≤MRD％10^-2）交替出现,一直未复发;B-ALL。病人复发前次MRD值均大于10^-2,且在g-6个月内复发。结论MRD阳性比形态学复发出现早,凼此连续监测MRD对白血病预测复发和指导个体化治疗有重要意义。     

人急性B淋巴细胞白血病-NOD/SCID/IL2rγnull新生小鼠异种移植模型的建立

本研究旨在应用NOD/SCID/IL2rγnull新生小鼠建立人急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的异种移植模型。NOD/SCID/IL2rγnull新生期(出生48 h之内)小鼠经亚致死剂量(100 cGy)137Cs全身照射后,由面静脉输注FACSAria流式细胞仪分选纯化的B-ALL患者骨髓CD3-CD4-CD8-CD34+CD19+细胞,于移植后8-12周用流式细胞术检测受鼠外周血、骨髓和脾脏中人源细胞的植入水平及其免疫表型,并通过HE染色评价人源B-ALL细胞在受鼠各组织器官中的迁移浸润能力。结果表明,在接受B-ALL患者CD34+CD19+细胞移植的受鼠外周血、骨髓和脾脏细胞中,不仅检测到了不同程度的人源B-ALL(huCD45+CD19+)细胞的植入〔(83.36±10.05)%,(93.88±5.05)%,(88.31±5.01)%〕,而且植入细胞具有与B-ALL患者相似的细胞形态和免疫表型特征。此外,人源B-ALL细胞广泛迁移浸润到受鼠的肝脏、肺脏、肾脏和脑等组织器官中。结论:NOD/SCID/IL2rγnull新生小鼠模型能够支持B-ALL患者CD34+CD19+细胞的高水平植入,是对人B-ALL进行体内功能性研究的新型异种移植模型。     

B淋巴细胞白血病骨髓B细胞CD34+CD38+和CD34+CD38low/-细胞亚群的临床意义

本研究比较发病时免疫表型为CD34+CD38+和CD34+CD38low/-两组B淋巴细胞白血病(B-ALL)的生物学特性,并探讨其临床意义。选取54例初发B-ALL并经多参数流式细胞术检测为CD34+的B-ALL患者,根据CD38表达不同将其分为CD34+CD38+组(n=35)和CD34+CD38low/-组(n=19)。利用实时定量PCR的方法分别进行BCR-ABL,TEL-AML1和WT1基因的检测。随访标本利用7色流式细胞术检测微量残留病(MRD),平均随访时间12个月(1-28个月),平均随访间隔2个月(1-5个月)。结果表明,两组患者发病时WBC,血小板和血红蛋白水平及BCR-ABL,TEL-AML1和WT1基因阳性表达的比例均无统计学差异(P>0.05)。在诱导缓解后,CD34+CD38+组微量残留病阳性(MRD+)为28.57%(10/35),CD38low/-组MRD+为68.42%(13/19),CD34+CD38low/-组MRD+的检出率明显高于CD34+CD38+组(P<0.01)。在复发率上,CD34+CD38+组有2例,分别在第94天和第245天复发,复发率为5.71%(2/35)。CD34+CD38low/-组有7例复发,复发率为36.84%(7/19),中位复发时间263 d(46-468 d),两组间具有明显统计学差异(P<0.01)。本研究以16岁为年龄分界点,CD34+CD38+组16岁以上患者为8人(8/35),CD34+CD38low/-组16岁以上患者为10人(10/19),两组间有统计学差异(P<0.05)。结论:CD34+CD38low/-患者在成人中比例较高,且CD34+CD38low/-组在治疗后更易出现MRD+和复发。     

流式细胞术对急性白血病免疫分型的临床意义

目的探讨流式细胞术(FCM)在急性白血病免疫分型中的临床意义。方法利用CD45/SSC设门的四色荧光FCM检测42例急性白血病病人骨髓细胞表面标记。结果分别以cCD3c、CD79a、cMPO作为T-ALL、B-ALL、AML的系列特异性标记。30例AML中cMPO阳性率为90.0%;12例B-ALL中cCD79a阳性率为91.7%.42例患者中有交叉免疫标记的占40.5%,其中髓系白血病中常见交叉表达淋系抗原CD56、CD7、CD19、CD10;淋巴细胞白血病中常见交叉表达髓系抗原CD13、CD33等。M2出现交叉表达现象最多见,阳性率为76.9%,常见表达CD56。伴CD56、CD7交叉表达的AML预后差。结论利用流式细胞术进行免疫表型分析对急性白血病的诊断及预后判断具有重要临床意义。     

淋巴细胞功能相关抗原-3(CD58)在儿童期急性B淋巴细胞白血病近期疗效判断中的应用

本研究评估CD58在急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)近期疗效判断中的价值。应用四色流式细胞分析技术观察135例儿童期B-ALL患者CD58分子的表达特点;建立用CD58/CD10/CD34/CD19抗体组合检测B-ALLMRD的方案;结合CD58的表达情况和MRD监测结果分析CD58在B-ALL中的预后价值。结果表明135例B-ALL的平均CD58MFI为113.08±63.33,15例正常骨髓的CD19+CD10+细胞的平均CD58MFI为14.68±5.26,两者差异显著(P<0.01);51.9%(70/135)B-ALL患者的CD58分子强表达,可以用CD58为指标进行MRD检测;CD58/CD10/CD34/CD19抗体组合的有效频率仅次于TdT/CD10/CD34/CD19,为51.9%;CD58高表达组的MRD阳性率显著低于CD58低表达组(P<0.05)。结论CD58可以作为B-ALLMRD检测的指标,此结果丰富了MRD检测的组合;CD58的高表达可以作为B-ALL预后较好的指标。