人衰老成纤维细胞凋亡的可诱导性

目的 研究体外培养的人成纤维细胞衰老时可诱发凋亡的能力。方法 用于酸钠和去血清两种方法诱导人衰老和年轻或纤维细胞生存曲线、细胞形态和超微结构、ＤＮＡ断裂电科 、流式细胞仪分析凋亡等手段检测凋亡的发生情况。结果 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ的丁酸钠诱导年轻细胞４８ｈ即发生凋亡,而老细胞耐９６ｈ,去血清诱导年轻细胞１５ｄ左右发生凋亡,而衰老细胞此时未出现凋亡现象。结论 人老成纤维细胞可凋亡的能力明显低于年轻细胞。     

p16基因甲基化在人二倍体成纤维细胞衰老中的作用

目的 研究DNA甲基化与衰老细胞中细胞周期负调控因子p16^MTS1/INK4a高表达的关系。方法 应用甲基化敏感的DNA限制性内切酶与PCR相结合的方法,分析特定位点的甲基化状态。结果 人胚肺二倍体成纤维细胞衰老过程中p16基因表达增高,中年细胞与衰老细胞中p16基因的表达水平分别约为年轻细胞的3倍和10倍。p16基因外显子Ⅰ限制性内切酶SmaⅠ位点的甲基化水平则表现出随增龄而降低的趋势,在年轻细胞、中年细胞中分别约为64％和41％,虽然在衰老细胞中仅为24％,但仍保持一定的水平。结论 p16基因外显子Ⅰ的SmaⅠ位点的甲基化水平改变可能与其在衰老过程中的高表达有一定的关联,其重要性值得进一步研究。     

氨基胍延缓人胚肺二倍体成纤维细胞复制性衰老的实验研究

目的探讨人工合成单体抗氧化剂氨基胍（2-AG）对人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）复制性衰老的影响及其分子机制。方法观察2-AG对2BS细胞衰老表型、细胞代龄、传代速度、细胞周期、细胞增殖能力、晚期糖基化终末产物（AGEs）水平及衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性率的影响。结果2-AG可维持细胞的非衰老表型，增加2BS细胞代龄19～20代，MTT法分析发现用2-AG孵育细胞84h，细胞增殖能力较对照组升高36％～40％。2-AG显著加快了细胞的增殖速度，其培养细胞S期的比例较对照细胞升高约1倍。另外，2-AG连续培养的细胞在老龄阶段AGEs、SA-β-Gal阳性率均显著低于老年对照细胞，而与年轻2BS细胞相似。结论2-AG可有效延缓2BS细胞的复制性衰老。     

人胚胎肺成纤维细胞复制性衰老模型的建立

目的建立人胚肺成纤维(HEL)细胞,复制性衰老模型,模拟正常细胞的衰老过程。方法利用HEL细胞的复制性衰老特性,通过细胞传代培养的办法,将获得的原代HEL细胞培养直至其衰老,冻存不同代的HEL细胞备用。然后利用β-半乳糖苷酶染色、端粒长度的检测以及p21蛋白的表达变化检测细胞的衰老状态。结果培养HEL细胞,按1∶2分瓶传代直至其衰老,最终细胞代龄为64。通过染色与分子检测证实细胞随着传代逐渐衰老。结论成功建立了HEL衰老模型,为进一步研究正常细胞复制性衰老奠定了基础。     

抑制细胞间通讯功能可加速人成纤维细胞的衰老

目的研究间隙连接蛋白connexin43在人成纤维细胞衰老过程中的调节作用。方法设计并合成针对人connexin43的双链RNA(siRNA),抑制人二倍体成纤维细胞WI-38细胞的connexin43表达和细胞间通讯功能,观察对其衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色阳性率、细胞增殖能力、细胞周期调节蛋白P27、P21表达水平等衰老表型的影响。结果我们合成的siRNA-cx43可高效、特异的抑制connexin43 mRNA和蛋白质表达及细胞间通讯功能。转染WI-38细胞后,细胞增殖能力降低、细胞SA-β-gal染色阳性率(75.32±5.17)较对照组(32.48±3.94)和转染siRNA-con组(37.81±4.1 2)细胞升高(P<0.05),P27、P21表达增加,转染siRNA-cx43的WI-38细胞增殖能力显著降低,细胞变扁平、肥大,细胞SA-β-gal染色阳性率达100%,细胞提前出现衰老。结论间隙连接蛋白connexin43对WI-38细胞的衰老进程有重要的调节作用,其表达减少和细胞间通讯功能降低,可以促进WI-38细胞衰老进程。     

人参不同部位皂甙对衰老的人胚肺成纤维细胞酶活性的影响

应用细胞化学的定性定位,显微分光光度计定量分析的方法,测定人参不同部位皂甙对体外衰老的人胚肺成纤维细胞内乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、葡萄糖—6—磷酸脱氢酶(G—6—PDH)、葡萄糖—6—磷酸酶(G—6—Pase)、三磷酸腺苷酶(ATPase)、丙酮酸氧化酶(PVO)活性的影响。结果表明,人参根、果和茎叶皂甙(SRG,SFG,SSLG)都可以使衰老细胞内的LDH、SDH、G—6—PDH、G—6—Pase、ATPase和PVO活性增加。但对未衰老细胞的作用却不尽相同。     

Valsartan延缓血管内皮细胞衰老及p16INK4a表达变化的研究

目的 探讨Valsartan对血管内皮细胞衰老与p16INK4a表达变化的影响,为寻求廷缓内皮细胞衰老途径提供理论和实验依据.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,子血管紧张素Ⅱ及Valsartan干预,实验分为空白对照组、血管紧张素Ⅱ诱导组及Valsartan组,采用β-半乳糖苷酶(β-gal)染色鉴定细胞衰老;流式细胞术分析细胞周期变化;免疫细胞化学染色法、Western blot分析各组细胞p16INK4a蛋白的表达.结果 与对照组比较,血管紧张素Ⅱ诱导组β-半乳糖苷酶阳性染色率显著增多81.24％±6.46％,细胞周期停滞于G0-G1(88.36％±6.45％),p16INK4a 蛋白表达水平上调(P＜0.05);予以Valsartan干预后,β-半乳糖苷酶阳性细胞染色率减少,G0-G1细胞减少,p16INK4a蛋白表达水平下调(P＜0.05).结论 血管内皮细胞衰老分子机制可能通过下调p16INK4a的表达,使细胞周期停滞于G1期有关,Valsartan对血管内皮细胞衰老有一定保护作用,可能通过调控p16INK4a的表达发挥其延缓3血管内皮细胞衰老的作用.     

抑制干扰素诱导蛋白p204表达促进大鼠血管外膜成纤维细胞生长与迁移

目的观察干扰素诱导蛋白p204表达抑制后对大鼠血管外膜成纤维细胞(VAF)凋亡、增殖与迁移的影响及其部分机制。方法应用Ifi204小干扰RNA(si RNA)转染VAF使Ifi204基因沉默(Ifi204-si RNA组),以非特异性si RNA转染作为其转染阴性对照组(Con-si RNA组)和未经处理的VAF作为未干预阴性对照组(Neg组)。用MTT法检测VAF细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,细胞划痕法和Transwell法测定细胞迁移情况,应用实时荧光q RT-PCR和Western blot分别检测p204、p53及p21的m RNA和蛋白表达。结果与Con-si RNA组和(或)Neg组相比,Ifi204-si RNA组的p204、p53及p21的m RNA和蛋白表达减少(P0.05),细胞凋亡率下降(P0.05),细胞增殖及迁移速度提高(P0.05)。结论抑制p204表达可减少大鼠VAF细胞凋亡,促进其增殖与迁移,其机制可能部分与抑制p53及p21表达有关。     

血管紧张素Ⅱ通过抑制人心房成纤维细胞BKCa通道诱导心房纤维化

目的 探讨在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心房纤维化的过程中,大电导钙激活钾通道(BKCa通道)的作用机制。方法 通过组织块贴壁法获取原代人心房成纤维细胞,使用免疫荧光染色进行鉴定。用浓度为500 nmol/L的AngⅡ处理人心房成纤维细胞24 h,实时荧光定量PCR与蛋白质印迹法用于检测处理前后纤维化标志基因α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)和胶原蛋白Ⅲ(collagenⅢ),以及BKCa通道的α与β亚基的mRNA和蛋白表达水平,全细胞膜片钳技术检测AngⅡ处理前后的BKCa通道的电流变化。结果 (1)人心房成纤维细胞经AngⅡ处理后,α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ的mRNA和蛋白表达水平升高;(2)经过AngⅡ处理后,BKCa通道α及β亚基mRNA和蛋白表达水平降低;(3)人心房成纤维细胞存在功能正常的BKCa通道,具有电压依赖性;(4)人心房成纤维细胞BKCa通道的宏观电流幅度在经AngⅡ处理后降低;(5)在人心房成纤维细胞上过表达BKCa通道α亚基后,纤维化标志物α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ的表达受到了明显...     

骨形态发生蛋白和白血病抑制因子诱导肝干细胞分化

目的 在永生化的小鼠肝干（祖）细胞(HP)模型上筛选并优化高效的肝细胞定向分化诱导方法,探讨HP向肝细胞定向分化过程及分子机制。 方法分别采用含人白血病抑制因子(LIF)、骨形态发生蛋白(BMP)2和BMP9基因的重组腺病毒感染HP,在病毒感染后第4天、第7天和第10天用糖原染色和吲哚花青绿(ICG)摄取实验观察HP的分化成熟度,并在第4、7、10、14天通过检测白蛋白启动子调控的荧光素酶报告基因活性,观察细胞合成白蛋白情况。计量资料比较用t检验。结果 BMP2和BMP9对HP的诱导作用最强,荧光素酶活性、PAS染色和ICG摄取细胞阳性率随诱导时间的延长明显上升,在诱导后第7天最高,HP对BMP9的诱导应答最强,与对照组相比,酶活性增加了近9倍（t=17.30,P＜0.01）,BMP2处理组增加了5倍（t=16.41,P＜0.01）,LIF处理组增加了3倍（t=6.04,P＜0.01）。诱导第7天时,PAS染色细胞阳性率在BMP2和BMP9组分别为30％和45％; ICG细胞阳性率在BMP2和BMP9组分别为40％和30％。LIF诱导后,PAS染色、ICG摄取细胞阳性率以及荧光素酶活性有一定增加。结论 BMP2、BMP9和LIF能够诱导HP向发育晚期肝细胞分化,并初步具备成熟肝细胞的一些功能。     

人高亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白3对人成纤维细胞衰老进程的影响

目的 探讨人高亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白3(hNaDC3)在人胚肺二倍体成纤维细胞(WI38)衰老中的作用。方法 通过构建逆转录病毒载体．使用含有hNaDC3基因的逆转录病毒液将hNaDC3基因导入WI-38中．并获得表达．观察其对WI-38细胞衰老的影响。结果 与对照细胞相比，hNaDC3基因导入后．WI-38细胞传代数减少10～13代，生长速率降低40％．细胞周期阻滞于G期，细胞形态呈衰老细胞样变化．衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色阳性率上升-线粒体膜电位下降。结论 hNaDC3可能促进人WI-38衰老。     

乙型肝炎病毒X蛋白抑制p16蛋白表达及其促进HepG2肝癌细胞生长

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对肝癌细胞生长的影响及其机制.方法 以HepG2细胞和稳定表达GFP/HBx融合蛋白的HepG2/GFP-HBx为实验细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞吸光度值A490,分析细胞生长增殖;流式细胞术检测细胞周期;甲基化PCR检测细胞p16INK4A基因的甲基化;Western blot检测p16蛋白表达水平. 结果 72 h时HepG2/GFP-HBx细胞组的A490为3.225±0.038,分别与HepG2和HepG2-GFP细胞组的2.012±0.022、2.038±0.029比较,增殖能力明显增强,t值分别为46.86和42.51,P值均＜0.001,差异均有统计学意义.流式细胞术检测示HepG2/GFP-HBx细胞组的G0/G1期细胞占16.45％±0.45％,明显低于HepG2和HepG2/GFP细胞组的44.81％±1.36％、42.76％±1.58％,t值分别为-34.22和-28.88,P值均＜ 0.001,差异均有统计学意义.而5-氮-2 '-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理的HepG2/GFP-HBx细胞G0/G1期细胞比例为33.25％±0.79％,较未处理HepG2/GFP-HBx细胞组的16.45％±0.45％显著增加,两组比较,t=31.85,P＜0.001,差异有统计学意义.甲基化PCR检测显示HepG2/GFP-HBx细胞组发生了p16INK4A基因甲基化,而HepG2和HepG2-GFP细胞组及5-Aza-CdR处理的HepG2/GFP-HBx细胞组未检测到p16INK4A基因启动子甲基化.Western blot检测示HepG2/GFP-HBx细胞组p16蛋白水平低于HepG2和HepG2/GFP细胞组,而5-Aza-CdR处理HepG2/GFP-HBx细胞后,p16蛋白水平高于未处理的HepG2/GFP-HBx细胞. 结论 HBx蛋白可通过缩短HepG2细胞生长的G0/G1期而加快细胞周期进程,从而促进肝癌细胞生长增殖,其机制可能与HBx蛋白诱导p16INK4A基因启动子甲基化及抑制p16蛋白表达有关.     

p16,CDK4和Rb在人肝细胞癌中的表达

目的分析ｐ１６基因、细胞周期蛋白依赖性激酶（ＣＤＫ４）和视网膜母细胞瘤基因（Ｒｂ）在人肝细胞癌中表达的改变。方法用免疫组织化学方法对４０例肝细胞癌和癌分组织作检测。结果肝癌组织中的ｐ１６蛋白、ＣＤＫ４和Ｒｂ蛋白的异常表达分别为９４．４４％（３４／３６）、４０．００％（１６／４０）和４５．７１％（１６／３５）。ｐ１６蛋白阴性或弱阳性而ｐＲｂ呈强阳性者１３例（１３／３４,３８．２３％）,两者的表达呈负相关关系二和Ｒｂ均异常者１５例（１５／３４,４４．１１％）,表明Ｒｂ表达的调节除ｐ１６外,还有其他的途径。ＣＤＫ４过度表达的１４例中大多伴Ｐ１６的改变（１３／１４,９２．８５％）,５０．００％能影响Ｒｂ蛋白的表达,同时伴ｐ１６和Ｒｂ异常者为４６．１５％。三者的异常表达与肝癌的恶性程度无相关关系。结论细胞调节因子Ｐ１６基因、ＣＤＫ４和Ｒｂ的表达异常,均参与肝细胞癌的发生。以ｐ１６蛋白表达的改变最为明显。     

胃癌组织芯片p53、p16及环氧合酶-2表达的研究

目的利用高通量的组织芯片技术,对胃癌组织及癌旁组织的p53、p16和环氧合酶-2（COX-2）蛋白异常表达进行分析,探讨其相关性及临床意义。方法利用组织芯片技术结合免疫组化法检测50例胃癌组织和78例癌旁组织中p53、p16及COX-2蛋白的表达。结果p53、p16和COX-2的阳性表达率在癌旁组织中分别是19％、15％及74％;在癌组织中分别是50％、54％及94％。胃癌组织中p53、p16和COX-2蛋白表达均显著高于癌旁组织,差异具有统计学意义（P〈0．05）。p53与COX-2、p16与COX-2蛋白表达均存在相关性（P〈0．05）。当p53、COX-2表达阳性,p16阴性时;或p16、COX-2表达阳性,p53阴性时;或p53、p16和COX-2同时表达阳性时,组织芯片病理类型为癌性的概率均增加,OR值分别为11．667、30．000及18．889,p53、p16和COX-2三者存在交互作用。结论联合分析p53、p16及COX-2的表达对预测胃癌的发生和发展具有重要意义。     

PTEN在HepG2细胞中诱导凋亡发生及上调p53表达

目的 研究肿瘤抑制基因PTEN对HepG2细胞凋亡及p53蛋白表达的影响,并探讨相关机制。方法 将携带有野生型PTEN基因及突变型G129E-PTEN,C124A-PTEN基因的真核表达载体转染HepG2细胞,利用western印迹杂交检测PTEN表达、蛋白激酶B(PKB/Akt)和焦点粘附激酶(FAK)的磷酸化状态,以及野生型p53蛋白表达水平的变化,并应用流式细胞仪,激光共聚焦技术检测细胞周期及细胞凋亡情况。结果 与对照细胞相比,转染野生型PTEN和G129E-PTEN的HepG2细胞中磷酸化FAK(-65％,-65％)与磷酸化Akt(-93％,-35％)表达均存在不同程度的下调,而细胞凋亡率分别增加至19.8％±1.2％和9.2％±0.6％,并且p53蛋白表达上调( 120%,, 50％);然而转染C124A-PTEN的细胞中各项检测指标均无明显变化。 结论 PTEN依赖其蛋白磷酸酶活性抑制FAK的磷酸化;并主要通过脂质磷酸酶活性抑制Akt的磷酸化,并诱导HepG2细胞凋亡和p53蛋白表达上调。     

肿瘤抑制基因p16在胰腺腺癌细胞系中因纯合性缺失而失表达

目的：检测肿瘤抑制基因p16在胰腺腺癌细胞系中的基因改变和在mRNA以及蛋白质水平的表达。方法：使用PCR方法检测基因的缺失情况;使用单链构象多态性（SSCP）方法检测基因有无突变;使用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测基因启动子区域的甲基化状态;使用RT－PCR方法检测基因在mRNA水平的表达;使用免疫细胞化学染色和Western blot方法检测基因在蛋白质水平的表达。结果：被检测的6个胰腺腺癌细胞系中,有3个细胞系存在p16基因的纯合性缺失,这3个细胞系在mRNA水平和蛋白质水平均无p16基因的表达。在全部6个细胞系中没有发现p16基因突变和启动子区域的过甲基化。结论：在被检测的6个胰腺腺癌细胞系中,纯合性缺失是造成p16基因失表达的原因。     

p16INK4/p15INK4B gene inactivation is a frequent event in malignant T-cell lines

Abstract: The cell cycle regulators p16^INK4 and p15^INK4B have been mapped to the minimal region of overlap for chromosome 9p21 deletions, observed in a number of malignancies, suggesting that they could be tumor suppressor genes (TSGs). In the case of pl6^INK4 this has been further substantiated by the finding of small intragenic mutations. In this study we have investigated the p16^INK4 and p15^INK4B genes in 16 malignant T-cell lines by means of Southern blot, PCR and sequence analysis. p16^INK4 allelic deletions occurred in 15 of 16 cell lines; 12 of which were homozygous and 3 hemizygous. In 1 cell line (DND 41) the remaining p16^INK4 allele carried a microdeletion of 29 bp of exon 2, supporting the concept that p16^INK4 is a target TSG for deletions on 9p21. Most p16^INK4 deletions also included the p15^INK4B gene. However, 4 of the cell lines deleted for p16^INK4 showed no evidence of p15^INK4B loss, indicating that p15^INK4B is not the target in these cell lines.     

叶酸对健康人外周血单个核细胞肿瘤相关基因甲基化状态的影响

目的 探讨叶酸干预对健康人外周血单个核细胞中肿瘤相关基因启动子甲基化状态的影响.方法 健康志愿者10人,均分为2组,分别口服叶酸5 mg或安慰剂,每日1次,连续3个月.于干预前后,以化学发光酶免疫分析试剂盒测定血清叶酸浓度,亚硫酸氢钠测序PCR(BSP)技术分别检测癌基因c-myc、c-Ha-ras,抑癌基因E-cadherin、p16INK4A和错配修复基因hMLH1的启动子甲基化状态.结果 叶酸干预后,干预组血清叶酸水平显著升高(T=-4.739,P<0.05),而对照组无明显变化.叶酸干预3个月后,癌基因c-myc启动子甲基化率分别从干预前的4%、服用1周时的3.3%、服用1个月时的4.1%增加到8%(t=-4.079,P<0.05),而服用安慰剂者无明显变化.叶酸干预前后,其他肿瘤相关基因包括c-Ha-ras、E-cadlherin、p16INK4A和hMLH1的启动子甲基化水平无明显改变.结论 叶酸干预可升高癌基因c-myc启动子甲基化水平,但不影响抑癌基因E-cadlherin、p16INK4A和hMLH1的甲基化状态.

Abstract：

Objective To investigate the effect of folic acid on the DNA methylation of tumorrelated genes promoters in healthy human peripheral blood mononuclear cells(PBMC). Methods Ten healthy volunteers were divided into two groups, and were randomized to receive either 5 mg folic acid (n=5)or placebo(n = 5) , one time per day for 3 months. The serum folic acid concentration was detected with chemiluminescence enzyme immunoassay kit before and after the intervention. The methylation statuses of five tumor-related genes promoter, including oncogenes c-myc, c-Ha-ras,tumor suppressor genes p16INK4A, E-cadherin and mismatch repair gene hMLH1 in PBMC were detected by bisufite sequencing. Results After folic acid intervention, the level of serum folic acid increased significantly in intervention group (t= -4. 739,P<0. 05) , however no significant difference in control group. After three-month folic acid intervention, the level of methylation of oncogene c-myc promoter increased from 4%, 3. 3%, 4. 1% before intervention, one week after intervention, one month after intervention respectively to 8%(t= -4. 079,P<0. 05), while no significant change in placebo taken group. Before and after the folic acid intervention, there was no significant difference of DNA methylation of other tumor-related genes promoter, including c-Ha-ras、E-cadherin、p16INK4Aand hMLH1. Conclusion Folic acid intervention can up-regulate DNA methylation of oncogene c-myc promoter, but can not affect the promoter methylation status of tumor suppressor genes E-cadherin,p16INK4Aand hMLH1.