细菌内同源重组法构建pAd-EGFP-hSDF-1α腺病毒质粒

目的:利用细菌内同源重组法构建和制备含人基质细胞源衍生因子-1α(hSDF-1α)重组腺病毒质粒。方法:设计5'端分别具有EcoR V/Xho I酶切位点的扩增hSDF-1αcDNA片段上下游引物,聚合酶链反应法(PCR)从pORF-hSDF-1α质粒中扩增hSDF-1α的cDNA,插入pGEM-T Easy载体中,构建pGEM-T-hSDF-1α质粒,EcoR V/Xho I双酶切后回收279 bp片段,与经过相同酶切的8.8 kb pShuttle-IRES-hrGFP-2进行连接,连接产物转化感受态DH5α,挑选克隆,重组质粒pShuttle-EGFP-hSDF-1α用EcoR V/Xho I酶切鉴定。pShuttle-EGFP-hSDF-1α经Pm e I酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-EGFP-hSDF-1α;pAd-EGFP-hSDF-1α质粒经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定。结果:线性化的pShuttle-EGFP-hSDF-1α转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183,重组质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,PCR反应扩增出了279 bp的片段。结论:用细菌内同源重组成功地构建了含hSDF-1αcDNA的重组腺病毒质粒,为进行表达hSDF-1α的重组腺病毒的制备及hSDF-1α在骨髓源干细胞动员迁移中的作用研究奠定了基础。     

血红素氧化酶1基因重组腺病毒的构建

目的利用细茵内同源重组法构建含血红素氧化酶1基因的重组腺病毒.方法用限制性内切酶XhoⅠ HindⅢ从克隆载体PRH01中切出血红素氧化酶1基因片段,亚克隆至经Sal Ⅰ HindⅢ酶切的克隆质粒Puc18中,形成转移质粒Puc18-PRHO1,将之用KpnⅠ HindⅢ双酶切,再次亚克隆至经同样酶切的质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrackPuc18-PRHO1,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒,PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒Ad-H01.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果利用CaCl2法由pAdTrack-Puc18-PRHO1和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态菌,可获得阳性重组体细菌克隆.PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因,滴度为1.4×1010pfu/ml.结论细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法.所制备的重组体腺病毒Ad-H01在体外能有效表达相应的基因产物,为今后对血红素氧化酶1的深入研究奠定了基础.     

重组腺病毒载体pAd-NY-ESO-1-EGFP的构建及鉴定

目的:利用细菌内同源重组法构建含人肿瘤特异性抗原的腺病毒质粒。方法:设计NY-ESO-1 cDNA扩增引物,从pET15b-NY-ESO-1质粒中扩增NY-ESO-1的DNA序列,与pShuttle-IRES-hrGFP-2进行连接,PCR和EcoRⅤ酶切鉴定重组质粒pShuttle-NY-ESO-1-EGFP,经Pm eⅠ酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-NY-ESO-1-EGFP;质粒经PacⅠ酶切鉴定,DNA测序。结果:线性化的pShuttle-NY-ESO-1-EGFP转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183大肠杆菌,重组质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,PCR反应扩增出了340 bp的片段。结论:用细菌内同源重组法成功地构建了含NY-ESO-1的重组腺病毒质粒,为进行表达NY-ESO-1的重组腺病毒的制备及肿瘤特异性抗原NY-ESO-1的核酸疫苗在肿瘤方面的研究奠定了基础。     

乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3．1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。     

VCAM-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒的构建

目的 构建VCAM-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因VCAM-1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体.结果 (1)VCAM-1基因与pAdTrack-CMV载体成功连接,经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后电泳可见2个大小约为9kb和2kb左右条带,经PCR法扩增后电泳可见一个600bp左右条带,证明pAdTrack-CMV-VCAM-1重组质粒构建成功;(2)pAdTrack-CMV-VCAM-1质粒与pAdeasy-l质粒同源重组后,产物经PacⅠ酶切后电泳可观察到2个大小约为31kb和4kb左右条带,与预期结果相符.结论 Ad-VCAM-1-EGFP重组腺病毒载体构建成功.     

细菌内同源重组构建携带人DMT1基因的重组腺病毒

目的 利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1(DMT1)编码基因的重组腺病毒.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1-IRE的cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-DMT1-IRE,在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组,利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆,经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1-DMT1-IRE.线性化的重组质粒转染HEK293细胞,获得高滴度的重组腺病毒.结果 RT-PCR反应扩增出1 841 bp的片段,重组质粒阳性克隆pAdEasy1-DMT1-IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20 kb的大片段和4.5 kb的特征性片段,PCR鉴定扩增出DMT1的片段,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的 基因DMT1-IRE.转染293细胞后细胞表达GFP荧光,显示293细胞稳定表达外源性的DMT1-IRE基因.结论 携带DMT1-IRE基因的重组腺病毒质粒构建成功,获得高滴度的重组腺病毒,为DMT1基因进一步功能的研究提供基础.     

细菌内同源重组构建pAdeasy-1/hp27mt腺病毒质粒

目的 :采用细菌内同源重组法高效制备含hp2 7mt基因的重组腺病毒质粒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,亚克隆至腺病毒穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,构成穿梭质粒 pShuttle -CMV/hp2 7mt;然后再用经PmeI酶切的 pshuttle-CMV/hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAdeasy - 1 /hp2 7mt;筛选同源重组质粒阳性克隆 ,提取pAdeasy - 1 /hp2 7mt质粒经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定。结果 :线性化的pShuttle-CMV/hp2 7mt转化含pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,1 2 - 2 0h后获得了30 %阳性重组质粒克隆 ,经酶切获得一大于 2 0kb的大片段和 3 .0kb的特征性片段 ,PCR反应扩增出了 2 75bp的片段 ,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因hp2 7mt。 结论 :用细菌内同源重组法可制备含hp2 7mt的重组腺病毒质粒且经济高效、简便、快捷。为转染 2 93细胞制备高滴度重组腺病毒提供高纯度的重组腺病毒质粒     

细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒

目的 :利用细菌内同源重组快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒。方法 :制备感受态BJ5 183,将pAdEasy - 1转化BJ5 183,制备含 pAdEasy - 1的BJ5 183感受态 ,将线性化的 pShuttle -CMV -LacZ转化含 pAdEasy- 1的BJ5 183感受态菌。采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEasy - 1-LacZ。pAdEasy - 1-LacZ用PacⅠ线性化后 ,再用LipoVec介导其转染至AD2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。采用X - gal染色观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况。将纯化的AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC ,X -gal染色观察基因转染效率及基因表达情况。 结果 :pShuttle -CMV -LacZ成功地转化了含 pAdEasy - 1的BJ5 183,并在其内发生了同源重组。X - gal染色证实了 pAdEasy - 1-LacZ转染AD2 93后 ,产生了重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。病毒滴度为 3.9× 10 12 pfu/ml。AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC后 ,β -gal在HVSMC中得到了有效表达。 结论 :细菌内同源重组法是一种快速构建重组腺病毒质粒的方法 ,AdEasy - 1-LacZ的制备为基因治疗研究提供了一良好对照载体。     

细菌内同源重组法高效制备携带增强型绿色荧光蛋白与人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组腺病毒载体

目的:利用细菌内同源重组法快速构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人内皮型一氧化氮合酶(he-NOS)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达EGFP和heNOS的重组腺病毒。方法:质粒载体pHCMV SP1A-heNOS用EcoRⅠ酶切,回收heNOS cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pShuttle-heNOS-EGFP;然后用PmeI线性化后的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP,纯化,鉴定,滴度测定。结果:heNOS cDNA成功地插入到穿梭质粒中,pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组腺病毒经PCR检测表明携带有目的基因heNOS,滴度约为6.5×1015pfu/L。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP为勃起功能障碍的基因治疗奠定了基础,携带的EGFP标记基因可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。     

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

hNET基因重组腺病毒载体构建和体外表达

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,用细菌内同源重组法构建含有人的去甲肾上腺素转运子(human neurotransmitter transporter,hNET)基因的腺病毒载体。方法利用限制性内切酶KpnⅠ XbaⅠ从pCMV5质粒中切下目的基因hNET,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,形成重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-hNET,PmeⅠ酶切线性化后,与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组体质粒Ad-hNET,PacⅠ酶切后用脂质体Lipofectamine2000转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒。采用PCR技术和Western Blotting对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有绿色荧光蛋白报告基因检测表达,经过扩增和纯化,测定病毒滴度。结果测序结果证明hNET序列的正确,PCR、PacⅠ酶切电泳和Western Blotting证实腺病毒重组质粒Ad-hNET构建成功。扩增纯化后测定重组病毒Ad-hNET的滴度为1.2×1010pfu/mL。结论成功构建了能表达hNET基因的重组腺病毒载体,为肿瘤的靶向治疗提供前期的研究工作。     

携带凋亡抑制蛋白Livinα基因的重组腺病毒载体的构建

目的构建携带凋亡抑制蛋白Livinα和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒pAd-Livinα。方法 PCR扩增Livinα基因片段,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在人胚肾293细胞中包装扩增得到携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒pAd-GFP-Livinα。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果经酶切及PCR鉴定证实携带Livinα的重组腺病毒载体构建成功,并可在人胚肾293细胞中表达,病毒滴度2.15×1010 pfu/mL。结论成功构建了携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒载体系统,为进一步研究Livinα的生物学特性奠定了基础。     

“两步转化法”高效制备携带自杀基因的重组腺病毒载体

目的 采用“两步转化法”高效制备含胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的腺病毒重组载体。方法 将质粒pAdEasy-1线性化后转化于BJ5183菌，制备AdEasy-1细菌；自载体pBS-CD中切出CD基因，亚克隆至穿梭质粒pAdtrackCMV上，构建的pAdtrackCMV-CD线性化后转化AdEasy-1细菌，抽提同源重组腺病毒质粒，PacⅠ酶切后转染293细胞，在293细胞中包装与扩增，利用GFP报告基因进行滴度测定。同时按“一步转化法”进行同样的重组腺病毒制备，比较二的优劣性。结果 “两步转化法”终产物17个克隆中13个正确，正确率为76．5％(13／17)；“一步转化法”重组产物17个克隆中有2个正确，正确率为11．8％(2／17)，两具有显性差异(P=0．00017)。结论 “两步转化法”细菌内同源重组是一种更高效、更方便的重组腺病毒制备方法。     

蛋白连接组织生长因子表达腺病毒的构建及其基因功能

目的构建及鉴定蛋白连接组织生长因子(CTGF)基因过表达腺病毒,初步探究CTGF在糖脂代谢方面的功能。方法克隆CTGF过表达质粒,定向克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV,Pme I酶切线性化穿梭质粒转化改造的E.coliBJ5183(含腺病毒载体pAdEasy-1)感受态细菌产生重组腺病毒载体,用Pac I线性化重组质粒,回收转染293A细胞包装病毒颗粒,经过3轮扩增,感染肝原代细胞,观察感染效率及检测基因表达情况。通过对小鼠不同时间段的饥饿处理,提取肝脏RNA做RT-PCR,实时定量PCR检测CTGF基因在不同营养条件下的变化情况。结果成功包装CTGF的腺病毒,感染效率达90%以上。CTGF在不同营养条件下表达情况不同,并且与糖脂代谢重要基因过氧化物酶体增值激活受体γ共激活因子1α表达情况一致。饥饿24h,CTGF上调(3.38±0.51)倍;饥饿48h,CTGF上调(5.26±1.25)倍(P<0.05)。结论初步认定CTGF可能参与糖脂代谢。