低分子量尿激酶与血纤蛋白粘附肽(12肽)融合表达及特性分析

人工合成血纤蛋白粘附肽（１２肽）ｃＤＮＡ，与低分子量单链尿激酶基因重组，获得血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿激酶的融合基因。将此融合基因重组入ｐＢＶ２２０表达载体并在大肠杆菌中表达，表达产物具有与天然尿激酶相同的抗原性和溶纤活性，同时兼具血纤蛋白粘附肽（１２肽）的抗血纤蛋白单体聚合的活性     

水蛭素12肽与低分子量尿激酶融合基因的构建和表达

目的：旨在获得既能抗栓又能溶栓的双功能蛋白，并在大肠杆菌中表达。方法：化学合成水蛭素１２肽基因编码序列，通过ＤＮＡ重组技术将水蛭素１２肽基因片段连接到低分子量尿激酶ｃＤＮＡ片段５′端，构建成融合基因，结果：构建了水蛭素１２肽与低分子量尿激酶的融合基因，在大肠杆菌中获得表达，重组融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。结论：运用ＤＮＡ重组技术可将两种不同功能的蛋白合理地融合在一起，使其具有溶纤活性和抗凝活性。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的高效表达

目的：构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合基因,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ 技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ 片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３ 中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－ ）中,转染细胞经选择培养基筛选,并采用ＭＴＸ加压扩增培养。结果：得到了高效表达融合蛋白的细胞株,表达水平为３００ Ｕ／（１０６ 细胞·ｄ）。通过ＥＬＩＳＡ 和溶解圈方法鉴定,该融合蛋白可与Ｄ－二聚体结合,并具有激活纤溶酶原溶解纤维蛋白的活性。结论：成功构建并获得高效表达双功能融合蛋白的细胞株,为进一步研究这一双功能融合蛋白的体内外特异溶栓活性以及评价其作为新型导向溶栓制剂奠定了基础。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体—低分子量尿激酶融合蛋白在？…

目的;构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合蛋白,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质中粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株中,转染细胞经选择培养基筛选。     

发色底物法定量测定重组u-PA产品的总活性和单链比例

目的建立一种发色底物酶水解方法定量分析重组尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)中的总活性及其单链酶原比例.方法用嗜热菌蛋白酶激活u-PA转化成具有催化活性的双链尿激酶,再用尿激酶的发色底物S-2444测定u-PA的总活性.在非激活条件下,u-PA产品中的单链酶原不会催化水解S-2444底物,因而可以测定其单链酶原比例.结果优化了嗜热菌蛋白酶激活u-PA的反应条件和尿激酶催化水解S-2444的反应条件.用这种方法测定了用CHO细胞表达的基因重组u-PA产品,单链比例大于98%,比活性约为11×104 U/mg.结论用发色底物法测定重组人u-PA产品中的总活性和单链比例具有很好的重复性和准确性.     

单链抗体—碱性磷酸酶检测系统的建立

目的：建立简便快速的单链抗体检测方法。方法：用PCR法和DNA重组技术构建了突变型碱性磷酸酶基因和单链抗体－突变型碱性磷酸酶融合基因;利用IPTG诱导融合基因的表达,并用pNPP底物液检测碱性磷酸酶的活性,用ELISA法检测和比较了不同单链抗体的相对活性。结果：实现重组突变型碱性磷酸酶基因在大肠杆菌中的功能性表达,且活性较重组野生型碱性磷酸酶活性高30倍左右。重组单链抗体－突变型碱性磷酸酶融合基因在大肠杆菌中获得功能性表达,周质中表达产物具有双功能,并成功地利用该系统分析了不同单链抗体的相对活性。结论：该单链抗体－碱性磷酸酶检测系统能够方便地应用于单链抗体的活性分析。     

重组脂联素融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的表达重组脂联素融合蛋白（adiponectin-Trx）,并测定其生物学活性。方法从小鼠脂肪组织提取总RNA,应用序列特异性引物经RT-PCR方法扩增获得全长脂联素基因序列,克隆至pGEM-T载体,序列经DNA测序证实。将目的序列（18-247氨基酸）亚克隆至pET-32（a）表达载体,重组质粒adiponectin/pET32（a）的序列经测序证实。将adiponectin/pET32（a）转化表达宿主菌OrigamiTM（DE3）,在27℃以1mmol/L IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE和氨基酸测序检测目的蛋白的表达,目的蛋白经组氨酸镍螯和树脂亲和纯化。以不同浓度的融合蛋白adiponectin-Trx和Trx蛋白处理体外培养的人脐静脉内皮细胞,细胞增殖法测定其生物学活性。结果小鼠脂肪组织脂联素基因的编码序列,337位点上的碱基A被G置换,导致在113位的蛋氨酸被缬氨酸取代。序列测定表明,构建的重组表达载体adiponectin/pET32a序列完全正确,诱导工程菌主要表达可溶性的融合蛋白adiponectin-Trx,部分以包含体形式表达。表达产物的相对分子量（Mr）同预期分子量相同,adiponectin-Trx Mr为43000,Trx Mr为19000。在低浓度时融合蛋白刺激人脐静脉内皮细胞增殖。结论小鼠脂肪组织脂联素基因编码序列与来自3T3-L1脂肪细胞的编码序列不同。成功地在E.coli中表达了重组脂联素融合蛋白并具有生物学活性。     

RAP结合肽-hFcγ1融合蛋白的表达与初步活性鉴定

目的：将肽库筛选到的正调控金黄色葡萄球菌(金葡菌)外毒素分泌的关键分子RAP(RNA Ⅲ activating protein)的结合肽与人IgG1抗体Fc片段(hFcγ1)融合表达，检测其干扰金葡茵外分泌毒素产生的活性。方法：根据噬茵体肽库筛选到的RAP结合肽序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子合成基因片段，将其融合在人IgGl抗体Fc片段基因序列的5’端，构建pET-rapbp-fc融合表达载体，转化大肠杆菌并诱导表达。以包涵体形式存在的目的蛋白经变性、复性后。ELISA实验分别证实其与抗人IgG抗体及纯化RAP的结合活性。以MDBK细胞株为模型，MTI实验观察融合蛋白对金葡菌196菌株外分泌毒素水平的影响。结果与结论：融合基因在大肠杆菌中获得表达。复性后，融合蛋白的Fc片段及结合肽部分分别能够与抗人IgG抗体及RAP结合，且能在一定程度上降低金葡菌196株上清中的毒素水平。     

新型重组人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体的制备及活性分析

目的：利用大肠杆菌表达新型人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体ScFv,并验证其活性。方法：采用基因融合获得ScFv基因,构建重组表达质粒pET-22b（＋）-ScFv,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达。结果：Western印迹显示目的蛋白表达正确,表达产物以包涵体形式存在,经Ni-NTA柱纯化和体外复性,获得纯度达90%的ScFv蛋白。ELISA结果显示在PBS及人血清中ScFv的结合稳定性有所提高,流式细胞术证明目的蛋白能靶向结合狂犬病毒,通过中和效价测定实验测得ScFv的中和效价为40 U/mg。结论：成功利用原核表达系统实现了对人源抗GPRV ScFv的表达,并且具有一定的中和活性。     

抗Sclerostin单链抗体基因的构建、表达及活性分析

目的 构建抗Sclerostin（SOST）单链抗体原核表达载体并对表达蛋白进行活性分析.方法 提取抗SOST单克隆抗体5H3D1杂交瘤细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体轻链可变区基因（VL）和重链可变区基因（VH）并通过重叠延伸拼接（SOE）PCR方法,在VL和VH基因之间引入Linker（Gly4Ser）3,连接成单链抗体SOST-scFv（VL-Linker VH）.将scFv基因克隆至表达载体PET-22b（＋）后转入HEK293细胞进行分泌表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA和West-blot检测表达蛋白的反应活性,茜素红结节染色法评估单链抗体对体外培养骨髓间充质干细胞成骨矿化的影响.结果 VL基因序列全长为339个碱基对,VH基因序列全长330个碱基对,均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,而SOST-scFv基因全长包括4个框架区（FR）、3个抗原互补决定区（CDR）以及具有抗体特征性的2个半胱氨酸残基;本研究构建的scFv全长687个碱基对,VL-Linker-VH为连接结构,SDS-PAGE分析表明大肠杆菌表达的scFv为可溶性蛋白,ELISA和West-blot检测证实表达scFv具有与SOST特异性结合的活性,细胞实验结果证实scFv能够促进骨髓间充质细胞成骨分化及矿化结节的形成.结论 成功构建抗SOST单链抗体表达载体,而且表达的scFv产物具有确切的免疫结合活性以及体外诱导成骨分化、矿化作用,为该抗体应用于骨质疏松疾病治疗奠定了实验基础.     

一种新的血管生成抑制因子-TSF的设计及表达

目的 选择PF4和TSP1的高活性片段设计融合基因－TSF，在大肠肝菌表达，细胞水平上检测表达产物的生物学活性。方法 PF4的C－末端13肽和TSP1的429－459片断31肽通过Gly-Pro-Gly肽桥设计为融合蛋白－TSF。采用pGEX-2T载体在E.coli JM109中表达TSF蛋白。采用MTT方法测定TSF及其相关性GST－TSF，PF4（58－70），TSP1（429－459）等对血管内皮细胞，平滑肌细胞，QGY7721人肝癌细胞，HLF人肺成纤维细胞等生长的抑制效应。结果 合成的TSF融合基因，克隆到pGEX-2T载体，转化E .coli JM109，获得了TSF蛋白的高效表达。建立了TSF蛋白的纯化复性方法，获得了GST－TSF融合蛋白及TSF蛋白。TSF，GST－TSF，PF4（58－70）和TSP1（429－59）均特异抑制血管内皮细胞的生长，其中TSF的活性最强，活性大小次序为TSF＞GST－TSF＞PF4（58－70）＞TSP1（429－459）。结论 融合表达蛋白－TSF在细胞水平上能高效特异抑制血管内皮细胞的生长。     

人源性抗食管癌细胞单链抗体的表达纯化及活性鉴定

目的研究噬菌体抗体库中筛选得到的抗食管癌细胞的单链抗体的功能,对单链抗体进行包涵体表达纯化。方法将从噬菌体抗体库中筛选到的2个单链抗体基因分别连接到pET-28a、pET-SUMO原核表达载体中,分别构建原核表达重组载体pET-NFC20b、pET-NFC70a,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化。采用盐酸胍稀释滴定复性方法对抗食管癌肿瘤细胞表面抗原的抗体进行复性,并用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果成功构建了重组载体pET-NFC20b、pET-NFC70a,对重组菌株pET-NFC20b、pET NFC70a蛋白表达进行鉴定,诱导条件为0.5 mmol/L IPTG、时间3 h、温度18 ℃,重组蛋白均以包涵体形式表达,经滴定复性后均获得了相对分子量为30 kD和40 kD的重组蛋白。细胞ELISA实验鉴定2种蛋白NFC20b、NFC70a能与KYSE-170、KYSE-150、SMMC7721、A549等细胞结合,具有生物学活性。结论噬菌体抗体库中筛选得到的抗食管癌细胞的单链抗体NFC20b和NFC70a,可以成功地构建到pET28a和pET-SUMO载体内进行包涵体表达,纯化后具有蛋白活性,可为后续实验及检测试剂的研发奠定基础。     

用基因工程技术制备多价微型抗体的研究

单链抗体（ＳｃＦｖ）是利用基因工程技术对抗体进行改造以及降低分子量而有利于放免显像，在此基础上发展的多价微型则进一步提高了抗体的特性，多价微型抗体基因工程的制备是利用ＤＮＡ重组技术在ＳｃＦｖ基因后连续一段前自我折叠形成多聚体的肽段序列，融合基因经Ｆ．Ｃｏｌｉ表达，表达蛋白质由于自我折叠区的肽段相互组合形成多聚体，从而制备出多价微核。目前已有从二阶到四阶微抗的成功制备，其主要区别是自我折叠区肽段的不     

融合蛋白P11-A1的构建、表达及生物活性研究

目的:获得P11-A1融合蛋白并对融合蛋白的生物活性进行分析.方法:将人类栽脂蛋白A1和P11基因进行拼接.然后连接在表达载体pBV220上,将表达载体转化到大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE分析其表达情况.通过离子交换层析对融合蛋白进行纯化、Western印迹检测纯化产物.用液体闪烁计数器检测融合蛋白体外合成高密度脂蛋白(HDL)的能力来测定转酯活性,同时用溶圈法检测融合蛋白的溶栓活性.结果:融合蛋白的表达量为29%;离子交换层析获得纯度约为90%的蛋白;Western印迹显示该重组蛋白能够特异地识别载脂蛋白A1抗体,并且该融合蛋白在浓度为0.28 mg/ml时转酯活性为21.93 nmol/(h·ml),溶栓活性为22.2 U/mg.结论:成功获得具有转酯活性和溶栓功能的P11-A1融合蛋白.     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA在大肠杆菌中的表达研究

将去除信号肽编码序列的组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）结构基因片段插入载体ｐＢＶ２２０的ＥｃｏＲＩ位点。目的基因受λＰ＿ＬＰ＿Ｒ启动子调控，通过温度调节诱导，ｔ－ＰＡ基因获得表达。电镜观察可见表达产物以包含体形式存在；表达量占非溶性菌体总蛋白的５％－８％。包含体产物经溶解及复性处理，可恢复活性；用溶纤维琼脂糖平板法、中和试验等方法证明了复性产物具有特异的ｔ－ＰＡ溶纤活性．     

尿激酶型纤溶酶原激活剂诱发的纤溶反应及其调节因子

目的 研究一些凝血和纤溶因子对尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA)诱发纤溶反应的调节作用及机制。方法 采用凝块溶解测定和纤维蛋白检测板测定观察了一些凝血和纤溶因子对uPA诱导的纤溶反应的影响及相互作用。结果 凝血酶激活的纤溶抑制因子（TAFI）对uPA或单链uPA（scuPA）诱发的纤溶反应具有明显的拮抗作用，凝血酶调节因子（TM）可明显增强其抑制作用，凝血酶对uPA诱导的纤溶反应没有明显的影响，但可抑制scuPA诱导的纤溶反应，该作用亦可被TM所增强或被水蛭素所消除。结论 凝血酶／TM可通过激活TAFI对uPA或scuPA诱导的纤溶反应产生抑制作用，凝血酶对scuPA诱发的纤溶反应的抑制作用亦可通过其对scuPA的裂解失活而实现。     

大肠杆菌表达的单链抗体柱复性的研究

单链抗体（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎＦｖＳｃＦｖ）是由抗体重链要变区ＶＨ和轻链可变区ＶＬ通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，由于其分子量小穿透力强，免疫原性代，利于基因工程操作等特点，而具有良好的应用前景，近年来国内外学者对单链抗体进行了大量研究，本室构建了抗乙肝病毒表面抗原ＨＢｓＡｇ的单链抗体ＳｃＦｖ，并在大肠杆菌表达体系中以包含体工形式获得高效表达，由于包含体为没有活性的变性蛋白，其纯化和复性是大量     

尿激酶型纤溶酶原激活剂及其抑制剂PAI-1 mRNAs的表达与人肝细胞癌的关系

为探讨尿激酶型纤溶酶原激活剂（ｕＰＡ）及其抑制剂ＰＡＩ－１ｍＲＮＡｓ的表达变化与人肝细胞癌（ＨＣＣ）浸润、转移间的关系,应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交技术对３０例新鲜活检肝组织作ｕＰＡ和ＰＡＩ－１ｍＲＮＡｓ表达的研究。结果显示：１６例伴肝内浸润和转移癌组织中ｕＰＡ和ＰＡＩ－１ｍＲＮＡｓ表达水平明显高于１４例无肝内浸润和转移肝组织;１８例高分化ＨＣＣ癌组织与１２例中、低分化ＨＣＣ相比,ｕＰＡ和ＰＡＩ－１ｍＲＮＡｓ含量差异有显著性意义。结果表明,癌组织内ｕＰＡ和ＰＡＩ－１基因转录水平的改变与ＨＣＣ浸润、转移及细胞分化密切相关。     

IIn-UK融合基因在CHO细胞中的高表达研究

目的 :构建新型高效真核表达载体 ,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶 (IIn UK)在CHO细胞中的高表达。方法 :利用常规分子生物学方法 ,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化 ,构建了一系列新型真核表达载体 ,以IIn UK融合基因为目的基因 ,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力 ,然后挑选高表达的克隆 ,通过MTX加压扩增 ,以提高IIn UK融合基因的拷贝数及表达水平。结果与讨论 :构建了 5种新型真核表达载体 ,并筛选出优化的真核表达载体 ,通过MTX加压扩增 ,实现了IIn UK融合基因在CHO细胞中的高表达 ,表达量达到 10 μg/ (10 6细胞·2 4h )。     

u-PA在细胞培养上清中的稳定性

尿激酶型纤溶酶原激活剂 (u_PA)主要是由无酶催化活性的单链酶原 (scu_PA或pro_UK)和具有激活纤溶酶原 (plas minogen)活性的双链尿激酶 (tcu_PA或UK)组成。scu_PA只激活吸附在纤维蛋白表面的纤溶酶原 ,具有选择性溶栓作用[1] 。scu_PA由 411个氨基酸组成 ,可被体内纤溶酶或激肽释放酶催化在Lys15 8～Ile15 9之间的肽键水解断裂转换为双链尿激酶。我所已构建了表达水平为 5 μg/ (10 6细胞·d)的基因重组CHO工程细胞株用于生产u_PA[2 ] ,并已放大至30L培养规模 ,采用多孔微载体无血清连续培养工艺 ,培养上清中u_PA的最高浓度可达 …