黄连素通过KLF4减轻缺血/再灌注损伤所致的大鼠心肌细胞凋亡的作用机制研究

目的 探讨黄连素（BBR）通过KRUPPEL样因子4(KLF4)减轻缺血/再灌注（I/R）损伤所致的大鼠心肌细胞凋亡的作用机制。方法 将大鼠永久心肌细胞系H9C2细胞按随机数字表法分为4组,即对照组（正常培养4 h）、I/R组（诱导I/R模型）、BBR组（诱导模型期间给予50μmol/L BBR作用4 h）、KLF4小干扰RNA(s i RNA)组（转染KLF4 s i RNA后,诱导模型期间给予50μmol/L BBR作用4 h）。采用细胞计数试剂盒-8检测细胞活力,原位末端转移酶标记法染色和流式细胞术检测细胞凋亡情况,蛋白质印迹法检测细胞凋亡因子[包括B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）]、KLF4蛋白表达水平,实时定量逆转录-聚合酶链反应检测KLF4 mRNA表达水平。结果 BBR组、I/R组、对照组H9C2细胞活力、细胞凋亡因子蛋白表达水平、膜阳性面积百分比、细胞凋亡率以及KLF4蛋白、mRNA表达水平比较,差异均有统计学意义（均P<0.05）;其中BBR组细胞活力、Bc l-2蛋白表达水平以及KLF4蛋白、mRNA表达水平均明显高于I/R组...     

内质网应激PERK途径在高糖诱导血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化中的作用

目的：研究高糖刺激SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）向成骨样细胞转分化中内质网应激蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）途径的作用。方法原代培养VSMCs,分为正常对照组（5mmol/L D-葡萄糖）,甘露醇组（5mmol/L D-葡萄糖＋25mmol/L甘露醇）,高糖组（30mmol/L D-葡萄糖）,高糖＋PERK-小干扰RNA（siRNA）转染组（30mmol/L D-葡萄糖＋PERK-siRNA转染）,高糖＋RNA干扰阴性对照组（30mmol/L D-葡萄糖＋乱序RNA转染）。分别作用48和72h。逆转录-聚合酶链反应及Western blot分别从信使RNA（mRNA）和蛋白质水平检测不同时间点内质网应激相关分子GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4的改变,以及成骨样细胞标志性分子核心转录因子（Cbfα-1）、骨钙素以及平滑肌细胞标志性分子α-SMA的改变情况。应用碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒检测ALP的活性。结果与正常对照组和甘露醇组比较,在mRNA水平,高糖组和高糖＋RNA干扰阴性对照组PERK和eIF2α表达升高（P＜0.05）,PERK-siRNA转染后其表达水平均降低（P＜0.05）,在蛋白质水平,PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α表达升高（P＜0.05）,PERK-siRNA干预后其表达均降低（P＜0.05）。高糖刺激VSMCs后ALP活性升高（P＜0.05）,PERK-siRNA转染后其表达均降低（P＜0.05）。结论内质网应激PERK途径在高糖诱导VSMCs由收缩表型向成骨样细胞表型转化中发挥作用,抑制PERK途径可以部分阻止这一转化过程。     

RNA干扰LOX-1表达对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护机制

目的 构建血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1（LOX-1）基因的RNA干扰慢病毒载体并转染人脐静脉内皮细胞。观察干扰LOX-1表达后对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导内皮细胞损伤的保护机制。方法 针对已经筛选确定的小干扰RNA有效干扰序列,合成慢病毒LV-si-OLR1最佳干扰序列,测定滴度。转染人脐静脉内皮细胞96 h后,通过荧光显微镜观察转染效率,逆转录聚合酶链反应和Western blot检测LOX-1的抑制效率。转染72 h后加入150 mg/L ox-LDL处理24 h;噻唑蓝比色法检测细胞存活率;硝酸还原酶法检测各组内皮细胞培养液一氧化氮（NO）的含量;Western blot检测各组细胞间黏附分子1（ICAM-1）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、RhoA、Rho激酶1（ROCK1）、Rho激酶2（ROCK2）的表达。结果 测序结果证实,靶向人LOX-1的干扰慢病毒载体构建成功,包装后慢病毒滴度为6×10¹¹ TU/L。转染组与未转染组比较,LOX-1 mRNA与蛋白的表达明显减少（P<0.01）。与正常对照组相比,ox-LDL处理组能明显减低内皮细胞的存活率及NO的生成量,增高ICAM-1、MCP-1、RhoA、ROCK1、ROCK2的表达（P<0.05）;与ox-LDL处理组相比,干扰LOX-1表达后对ox-LDL诱导的内皮细胞存活率、NO生成量减低和ICAM-1、MCP-1、RhoA、ROCK1、ROCK2表达增高均有明显抑制作用（P<0.05）。结论 干扰LOX-1表达,对ox-LDL诱导内皮细胞引起的ICAM-1、MCP-1高表达和RhoA/Rho激酶信号通路的激活及细胞存活率、NO生成量的减低均有明显抑制作用,起到对内皮细胞损伤的保护作用。本研究为LOX-1作为靶基因治疗动脉粥样硬化提供了实验依据。     

RNAi对结肠癌HCT-8细胞桩蛋白表达的沉默作用观察

目的观察RNA干扰（RNAi）对结肠癌HCT-8细胞桩蛋白（Paxillin）表达的沉默作用。方法构建针对Paxillin基因序列的短发卡RNA（shRNA）表达载体,并转染至结肠癌HCT-8细胞,72 h后分别用实时定量PCR和Western blot法测定转染细胞中Paxillin mRNA及蛋白。结果根据针对Paxillin基因设计了小干扰RNA（siRNA）序列,构建了shRNA表达载体,并成功转染至HCT-8细胞。以空白对照组作均一化,转染Paxillin-shRNA_1、Paxillin-shRNA_2、Paxillin-shRNA_3、Paxillin-shRNA_NC的细胞及空白对照组细胞Paxillin mRNA相对表达量分别为0.66±0.28、0.31±0.11、1.00±0.22、1.05±0.32、1.00±0.29,Paxillin蛋白相对表达量分别为0.62±0.11、0.39±0.13、0.74±0.21、0.94±0.09、1.00±0.16。结论 RNAi可沉默结肠癌HCT-8细胞Paxillin的表达。     

siRNA抑制survivin基因及其对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响

目的观察特异小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响。方法构建survivin-siRNA真核表达载体,利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测survivin基因mRNA表达水平。针对转染后不同的时间点采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞的增殖以及HepG2细胞的凋亡情况。结果构建的survivin-siRNA转染组survivin蛋白表达较对照组明显下调,差异有显著性（P〈0.01）,其增殖能力较对照组显著下降（P〈0.001）;而阳性对照组及未转染组对survivin表达及mRNA抑制作用不明显（P=0.219）。结论所构建的针对人survivin-siRNA可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞凋亡。     

Peroxiredoxin Ⅱ基因在Hep3B细胞中的生物学功能和作用机制

目的 探讨peroxiredoxin Ⅱ (Prx Ⅱ)基因在肝癌发生发展中的作用及其机制.方法 化学合成两对针对Prx Ⅱ基因的小干扰RNA,即Prx Ⅱ-1和Prx Ⅱ-2,分别用脂质体LipofectamineTM 2000介导转入人肝癌细胞系Hep3B.通过实时荧光定量PCR和Western blot检测确定Prx Ⅱ在转染细胞中mRNA和蛋白表达水平受到明显抑制后,对Prx Ⅱ基因沉默的Hep3B细胞分别进行细胞生长、细胞凋亡、细胞集落形成等检测,观察Prx Ⅱ对Hep3B细胞生物学功能的影响;通过二氯荧光素双乙酸和硫代巴比妥酸试验,检测细胞内过氧化代谢产物活性氧类和丙二醛的水平,探讨Prx Ⅱ的作用机制.结果 与阴性对照组和空白对照组相比,Prx Ⅱ基因沉默的Hep3B细胞生长受到抑制,生长抑制率在转染96h后达40%以上;细胞凋亡增加;细胞形成集落的能力降低,Prx Ⅱ-1组和PrxⅡ-2组的细胞集落形成数分别为42.0±2.8和40.5±0.7,明显低于阴性对照组和空白对照组的121.5±2.1和130.0±1.4 (P<0.05).Prx Ⅱ基因沉默的Hep3B细胞内活性氧和丙二醛水平明显增加(P<0.05).结论 Prx Ⅱ具有促进Hep3B细胞生长的生物学功能,其机制可能与通过抗氧化作用形成有利于肿瘤细胞生长的微环境有关.     

胰腺癌Capan-2细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性抗肿瘤免疫反应的体外研究

目的 观察人胰腺癌Capan-2细胞总RNA转染的树突细胞（DCs）所诱导的抗肿瘤免疫反应.方法 从6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DCs.使用电穿孔法将Capan-2细胞总RNA及MUC4 mRNA分别转染DCs.应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测转染后DCs的存活率.采用蛋白质印迹法检测DCs中MUC4 mRNA的表达.使用IFN-γ酶联免疫法检测DCs诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTLs）的活化反应.采用51Cr标准细胞毒实验检测DCs诱导的抗原特异性CTLs对体外胰腺癌细胞的杀伤效应.结果 Capan-2细胞总RNA转染的DCs（DC-Capan-2-total RNA）的存活率呈时间依赖性下降,转染后96 h的存活率降低至60.8％,而转染MUC4 mRNA的DCs（DC-MUC4 mRNA）的存活率稳定在80.0％左右,两转染组DCs的差异具有统计学意义（P＜0.05）.DC-Capan-2-total RNA的MUC4蛋白表达量亦显著低于DC-MUC4 mRNA（P＜0.05）.DC-Capan-2-total RNA诱导的CTLs 24 h IFN-γ释放量为（89.34±3.85） U/ml,DC-MUC4 mRNA为（21.77±2.14） U/ml,两转染组的差异有统计学意义（P＜0.05）.DC-Capan-2-total RNA诱导的特异性CTLs能够有效识别和杀伤HLA-A2 ＋/MUC4＋的Capan-2细胞及HLA-A2 ＋/MUC4-的PANC1细胞,而不能有效识别和杀伤HLA-A2-/MUC4-的MiaPaCa-2细胞和HLA-A2-/MUC4＋的AsPC-1细胞.结论 胰腺癌细胞总RNA转染的DCs较单个胰腺癌相关抗原转染的DCs能诱导出更加显著的CTLs抗肿瘤免疫反应,但受到MHC Ⅰ类抗原递呈的限制.     

结缔组织生长因子和金属蛋白酶组织抑制因子-1 RNA干扰靶位的筛选

目的筛选能有效抑制肝纤维化形成的结缔组织生长因子（CTGF）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）的RNA干扰靶位。方法根据大鼠CTGF和TIMP-1基因序列,分别设计3个RNA干扰候选靶位,化学合成双链RNA（dsRNA）,各自转染或不同组合后转染经TGF-β1刺激活化的大鼠肝星状细胞（HSC）,48h后抽提RNA并逆转录成cDNA,采用荧光定量PCR法测定并计算CTGF和TIMP-1、Ⅰ型前胶原（procol-α1）mRNA的相对表达量与抑制率,采用RIA法检测HSC培养上清液肝纤维化指标。结果在进行单独针对CTGF基因干扰时,CTGF-3组对CTGF mRNA及其下游产物Procol-α1 mRNA的转录抑制作用最佳（抑制率分别达68.09%与65.03%）,在单独针对TIMP-1基因干扰时,TIMP-1-3组对TIMP-1 mRNA及其下游产物Procol-α1 mRNA的转录抑制作用最佳（抑制率分别达68.55%与62.84%）;在联合干扰时,CTGF-3/TIMP-1-3组联合对CTGF mRNA和TIMP-1 mRNA的抑制最强（抑制率分别达76.60%与79.03%）,而以CTGF-2/TIMP-1-3组联合对Procol-α1 mRNA的抑制作用最强（抑制率达85.79%）。结论成功筛选出针对CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位,联合干扰较单独干扰效果更强。     

α烯醇化酶靶向RNA干扰对原代培养乳鼠心肌细胞能量代谢及收缩功能的影响

目的采用RNA干扰技术抑制培养大鼠心肌细胞α烯醇化酶的表达，探讨α烯醇化酶对心肌细胞能量产生和收缩功能的影响。方法针对α烯醇化酶基因，化学合成3对小片段干扰RNA（siRNA）（分别为针对α烯醇化酶mRNA406-425位点的序列1，针对α烯醇化酶mRNA656～675位点的序列2及针对α烯醇化酶mRNA754～773位点的序列3）并转染原代培养的WKY大鼠心肌细胞。采用Real—time RT-PCR和Western blot技术分别在mRNA和蛋白水平检测α烯醇化酶的表达情况，筛选其中沉默效应最好的序列（序列1）转染心肌细胞，即RNA干扰实验组，以未转染siRNA的心肌细胞为对照组，荧光素荧光素酶法检测细胞ATP水平，视频跟踪计算机测定系统测定细胞收缩反应，参数包括最大收缩幅度（dL），最大收缩速度（dL／dtmax）。结果针对α烯醇化酶mRNA 406-425位点的siRNA显著下调α烯醇化酶mRNA和蛋白的表达，并且呈剂量和时间依赖关系，200nmol／L可达到最大沉默效应，其下调α烯醇化酶mRNA和蛋白表达的最大效应分别出现在转染后24h和48h。α烯醇化酶沉默后细胞ATP产生减少（3．55&#215;10^-7nmol／mg蛋白），dL[（0．82&#177;0．02）μm]和dL／dtmax[（2．7&#177;0．3）μm／s]下降。结论应用siRNA技术靶向α烯醇化酶mRNA406～425位点可有效下调心肌细胞a烯醇化酶的表达，使细胞产能减少，收缩功能下降。     

TOLL样受体4对哮喘气道平滑肌细胞分泌IL-5、IL-8的影响

目的探讨TOLL样受体4（TLR4）在哮喘气道炎症反应中的作用及机制。方法 建立哮喘大鼠模型,分离、培养其气道平滑肌细胞（ASMCs）,传至6代后随机分为转染组和对照组,转染组应用小分子RNA干扰技术、脂质体转染法进行小干扰RNA（siRNA）-TLR4转染,对照组为空白对照。培养24h后应用ELISA法检测两组细胞培养上清液中IL-5、IL-8水平,应用RT-PCR和Western-blot法检测细胞中TLR4 mRNA和蛋白表达水平。结果转染组IL-5、IL-8水平及TLR4 mRNA、蛋白表达水平均显著低于对照组（P均〈0.01）。结论TLR4可能通过促进ASMCs合成分泌IL-5、IL-8而加重哮喘气道炎症反应,此为临床靶向治疗提供了理论依据。     

3种不同培养基体外培养阴道毛滴虫效果的比较

目的　探索阴道毛滴虫体外培养的适宜条件。　方法　用临床分离的阴道毛滴虫 ,按 9.0× 10 4 / ml的接种量转种至 3种不同培养基进行培养 ,p H值为 5 .6。　结果　经 3种培养基培养 ,96 h后阴道毛滴虫数量存在差异 ,其中以半胱氨酸 -肝 -胨 -麦芽糖培养基 培养基 )虫数较多 ,肝 -胨 -麦芽糖培养基 培养基 )次之 ,大豆 -肝 -胨 -麦芽糖培养基 培养基 )较少。培养基 与培养基 及培养基 相比较 ,滴虫存活率差异具有显著性意义 P<0 .0 1,P<0 .0 5 ) ,滴虫生长密度差异也具有显著性意义 P<0 .0 1,P<0 .0 5 ) ,生长密度高峰持续时间分别为 192 h、14 4 h和 96h,最长存活时间分别为 2 88h、2 16 h和 192 h。　结论　半胱氨酸 -肝 -胨 -麦芽糖培养基较适于阴道毛滴虫体外增殖     

抗炎平喘药物对支气管哮喘小鼠骨髓CD+34造血细胞的影响

目的　观察糖皮质激素和白三烯受体修饰剂对支气管哮喘 (简称哮喘 )模型小鼠骨髓CD 3 4 造血细胞的影响 ,研究潜在的以骨髓为靶点的抗炎机制。方法　以 1%卵白蛋白 (OVA)致敏并激发BALB/c小鼠建立哮喘模型。在连续激发 2周期间分为 4组 ,每组 6只 ,分别给予生理盐水 (对照 ,A组 )、泼尼松 (B组 )、孟鲁斯特 (C组 )及泼尼松 孟鲁斯特 (D组 )灌胃 ,末次激发后 2 4h分别取支气管肺泡灌洗液 (BALF)、外周血及骨髓 ,测定BALF、外周血中有核细胞的分类计数及骨髓中有核细胞总数 ;用流式细胞仪测定外周血及骨髓中CD 3 4 造血细胞、CD 4、CD 8T淋巴细胞占有核细胞的比例 ;免疫组化结合原位杂交法检测骨髓内表达白细胞介素 5受体α链 (IL 5Rα)mRNA的CD 3 4 造血细胞 (CD 3 4 IL 5RαmRNA 细胞 )计数。结果　A组BALF中嗜酸粒细胞 (EOS)计数为 [( 18 3± 1 3)×10 5/L]、外周血中EOS为 [( 2 5± 0 4 )× 10 8/L]、CD 3 4 造血细胞为 [( 9 6± 5 1)× 10 7/L]、骨髓中CD 3 4造血细胞为 [( 7 7± 3 2 )× 10 7/根股骨 ];B组分别为 [( 4 6± 1 7)× 10 5/L]、[( 1 5± 0 3)× 10 8/L]、[( 3 9± 2 1)× 10 7/L]、[( 3 3± 1 8)× 10 7/根股骨 ];D组分别为 [( 3 7± 1 4 )× 10 5/L]、[( 1 7± 0 3)× 10 8/L]     

Increase in Trx2/Prx3 redox system immunoreactivity in the spinal cord and hippocampus of aged dogs

We previously reported that no distinct neuronal loss occurred in the aged dog spinal cord, although oxidative stress was increased in the aged dog spinal cord. Thioredoxin 2 (Trx2)/peroxiredoxin 3 (Prx3) redox system is a major route for removing H₂O₂ in the central nervous system. In the present study, we compared the distribution and immunoreactivity of thioredoxin reductase 2 (TrxR2), Trx2 and Prx3 and their protein levels in the spinal cord and hippocampus between the adult (2–3 years) and aged (10–12 years) dogs. The number of TrxR2-immunoreactive neurons was slightly increased; however, its immunoreactivity was significantly increased in the aged spinal cord compared to that in the adult spinal cord. On the other hand, the number and immunoreactivity of both Trx2- and Prx3-immunoreactive neurons were significantly increased in the spinal cord of the aged dog. Similarly, in the hippocampus of the aged dog, TrxR2, Trx2 and Prx3 immunoreactivity and protein levels were markedly increased compared to those in the adult dog. These results indicate that the increases of TrxR2, Trx2 and Prx3 immunoreactivity and their protein levels in the aged spinal cord and hippocampus may contribute to reducing neuronal damage against oxidative stresses during normal aging.     

Short RNA duplexes produced by hydrolysis with Escherichia coli RNase III mediate effective RNA interference in mammalian cells

Small interfering RNA (siRNA) has become a powerful tool for selectively silencing gene expression in cultured mammalian cells. Because different siRNAs of the same gene have variable silencing capacities, RNA interference with synthetic siRNA is inefficient and cost intensive, especially for functional genomic studies. Here we report the use of Escherichia coli RNase III to cleave double-stranded RNA (dsRNA) into endoribonuclease-prepared siRNA (esiRNA) that can target multiple sites within an mRNA. esiRNA recapitulates the potent and specific inhibition by long dsRNA in Drosophila S2 cells. In contrast to long dsRNA, esiRNA mediates effective RNA interference without apparent nonspecific effect in cultured mammalian cells. We found that sequence-specific interference by esiRNA and the nonspecific IFN response activated by long dsRNA are independent pathways in mammalian cells. esiRNA works by eliciting the destruction of its cognate mRNA. Because of its simplicity and potency, this approach is useful for analysis of mammalian gene functions.     

对结核性胸膜炎患者使用分支杆菌类免疫刺激剂的商榷性研究

目的　为观察在结核性胸膜炎患者使用分支杆菌类免疫增强剂的实际疗效并探讨其使用是否具合理性。方法　观察结核性胸膜炎患者分别经单纯抗结核 +胸穿抽液 (对照组 )和抗结核 +斯奇康 +胸穿抽液 (实验组 )的胸液平均消退时间和胸液淋巴细胞密度的动态改变 ,同时采用原位DNA末端标记技术观察两组患者胸液淋巴细胞凋亡时程的动态改变。结果　对照组和实验组的胸液消退时间分别为 (2 1 .2± 5 .4)d和 (2 8.7± 7.1 )d ,两组相比P <0 .0 5。两组患者胸液淋巴细胞密度于用药满 1周、2周、3周时分别为 1 .6× 1 0 9/L与 2 .1× 1 0 9/L(P <0 .0 1 )、0 .83× 1 0 9/L与 1 .52× 1 0 9/L(P <0 .0 1 )、0 .55× 1 0 9/L与 1 .1 6× 1 0 9(P <0 .0 1 )。两组患者胸液淋巴细胞半数凋亡时间于用药满 1周、2周、3周时分别为 94与 1 2 4h(P <0 .0 1 )、84与 1 2 3h(P <0 .0 1 )、79与 1 2 0h(P <0 .0 1 )。结论　分支杆菌类免疫刺激剂可持续活化淋巴细胞 ,延长胸液淋巴细胞凋亡时程 ,从而减缓结核性胸液的消退进程。故该类制剂不宜用于结核性胸膜炎的辅助治疗。     

Double-stranded RNA viral infection of Trichomonas vaginalis infecting patients attending a sexually transmitted diseases clinic

Trichomonas vaginalis (TV) can be infected with double-stranded RNA (dsRNA) viruses that may have important implications for trichomonal virulence and disease pathogenesis. A cross-sectional study was conducted in a sexually transmitted diseases clinic to determine the prevalence and clinical significance of dsRNA viral infection of TV infecting men and women. Overall, dsRNA virus was present in 21 (75%) of 28 TV isolates (95% confidence interval [CI], 55%-89%). dsRNA viral infection of TV was not associated with the presence of discharge, dysuria, genital pruritus, or genital irritation or odor. However, patients with virus-positive isolates were significantly older than patients with virus-negative isolates (median age, 38 vs. 23 years; P=.003), and virus-positive isolates were more prevalent among women (19 [86%] of 22 isolates; 95% CI, 65%-97%) than among men (2 [33%] of 6 isolates; P=.02). The age and sex specificity of virus-positive isolates may aid in understanding the differences in chronicity and clinical presentation of TV in men and women.