丙型肝炎病毒高变区基因序列的比较研究

探索丙型肝炎预后的规律。方法用ＲＴ-ＰＣＲ方法从１例丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）持续感染者和１例ＨＣＶ感染恢复者血清中扩增出ＨＣＶ高变区基因片段,并用标准的分子生物学方法对ＰＣＲ产物进行多个克隆的序列分析。结果两者在突变位点的百分率、核苷酸类似株（ｑｕａｓｉｓｐｅＣｉｅｓ）的多样性、与国内ＨＣＶⅡ型参考株的同源性及各克隆间的遗传距离等方面差异均无显著性。在ＨＣＶ感染恢复者所测得的２０个克隆中有２个克隆１个碱基的插入突变,而在ＨＣＶ持续感染者的高变区１６个克隆中没有发现此现象。结论ＨＣＶ高变区基因变异程度似乎与ＨＣＶ感染后恢复与否无必然联系。表明在考虑基因变异的同时,还需考虑其它因素,才能判断基因变异与预后的关系。     

乙型肝炎病毒基因组S区编码产物的检测及临床意义

为了进一步明确 ＨＢＶ基因组 Ｓ区编码产物对乙型病毒性肝炎诊断的临床价值，用双抗体夹心 ＥＬＩＳＡ法检测 ９０份乙型病毒性肝炎患者血清标本ＨＢｓＡｇ·ＰＨＳＡ－Ｒｅ、Ｐｒｅ－Ｓ１和 Ｐｒｅ－Ｓ２，并与 ＨＢＶＭ及 ＨＢＶＤＮＡ ＰＣＲ进行对比分析。结果以抗 ＨＢｃ、ＨＢｓＡｇ·ＰＨＳＡ－Ｒｅ、ＨＢＶＤＮＡ（ＰＣＲ）及 Ｐｒｅ－Ｓ２的阳性检出率为最高，分别为８７．８％、７３．３％、７２．２％和６４．４％，以ＨＢＶＤＮＡ作为ＨＢＶ感染的金标准，无显著性差异（Ｐ＞０．０５）；其中ＨＢｓＡｇ·ＰＨＳＡ－Ｒｅ与 ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢｅＡｇ的符合率最高，分别为 ７６．７ ％和 ７４．７ ％；ＭＢｓＡｇ·ＰＨＳＡ－Ｒｅ与 ＨＢＶＤＮＡ具有高度相关性。ＨＢｓＡｇ·ＰＨＳＡ－Ｒｅ做为早期诊断ＨＢＶ感染及判断是否具有传染性方面，是一项非常重要的血清学指标，Ｐｒｅ－Ｓ２也可作为ＨＢＶ复制活跃的标志之一，用于急慢性肝炎的预后判断．     

丙型肝炎病毒高变区基因序列的变化

目的 观察丙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC）体外长期存活状态下是否仍有丙型肝炎病毒（HCV）存在及其不同时期高变区基因序列的变化。方法 用EB病毒感染并使HCV阳性PBMC转化,获得HCV的外周血永生化B细胞（LCL）。而后,每个月应用逆转录-套式-聚合酶链反应（RT-net-PCR）检测1次培养细胞和上清液中的HCV RNA,并用原位RT-net-PCR观察HCV RNA在细胞中存在的部位;应用基因测序技术分析LCL传代培养1个月和9个月后HCV高变区（HVR）核苷酸序列,并以原患者半年后血清作对照。结果 经连续1年检测,HCV在传代细胞中持续存在,培养细胞中的HCV RNA负链和培养上清液中的HCV呈间断阳性;原位PCR发现HCV RNA阳性信号弥散性、簇状和团块状分布于胞浆中,细胞膜、核膜和细胞核阴性;患者血清HCV核苷酸变异集中在第1491-1583位核苷酸（即384-414位氨基酸）和第1761-1781位核苷酸（即473-479位氨基酸）两个区域,而LCL传代培养1个月和9个月后细胞中HCV HVR核苷酸同源性为99.37%。结论 HCV可以在LCL中较长时间存在,而HVR基因序列无明显变化。     

乙型肝炎病毒基因组新基因的研究及意义

乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝部分双链DNA病毒，不仅引起急慢性病毒性肝炎，而且与肝纤维化(LF)、肝细胞癌(HCC)的发生发展密切相关^[1]。全世界约有3．5亿人受到HBV感染，危害严重但目前还没有特效的治疗技术和方法。我们对HBV基因组准种特点进行长期而广泛研究^[2-5]。最近我们对于中国HBV流行株的全基因序列进行克隆和序列分析，发现了前-前-S和前-X基因序列，并利用分子流行病学、分子生物学技术对其进行了验证，从而改写了HBV DNA编码基因序列研究的历史。     

乙型肝炎病毒逆转录酶区预存耐药研究

目的探讨未经核苷(酸)类似物治疗的乙型肝炎病毒(HBV)感染者HBV P基因逆转录(RT)区准种异质性及预存耐药情况,为临床抗病毒治疗药物选择提供理论依据。方法 2011年10月至2013年4月期间于中国医科大学附属盛京医院感染科住院的60例慢性HBV感染者为研究对象。检测HBV P RT区准种异质性及预存耐药情况;乙型肝炎病毒血清学标志物检测采用化学发光法;乙型肝炎病毒载量测定采用Tag Man实时荧光定量PCR法。HBV P RT准种异质性及预存耐药检测应用克隆测序法。结果 60例患者中32例(53.3%)检测出RT区基因变异,其中乙肝病毒携带者组、慢性乙型肝炎组和乙肝肝硬化组之间相比差异无统计学意义(P0.05)。对HBV RT区的核苷酸序列分析共发现31种变异模式。拉米夫定预存耐药8例(1.33%)、恩替卡韦预存耐药5例(0.83%),阿德福韦酯预存耐药7例(1.16%)。乙肝肝硬化组准种复杂性(38.3%)明显高于慢性乙型肝炎(2.83%)和乙肝病毒携带者(1.33%)。e抗原(HBe Ag)阳性组RT区变异发生率为52.6%,阴性组为54.5%,两组差异无统计学意义。结论 HBV逆转录酶区核苷(酸)预存耐药天然存在,变异模式多种多样。HBV不同感染阶段RT区各耐药位点变异发生率差异无统计学意义,但乙肝肝硬化组准种复杂性明显高于慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒携带者。HBe Ag阳性和阴性HBV感染者RT区基因变异率差异无统计学意义。     

丙型肝炎病毒高变区_1的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)是肠道外传播的非甲非乙型肝炎(NANBH)的主要致病因子。它是单股正链的RNA病毒,基因组全长约9400个核苷酸,排列顺序为:5’-UTR-C-E_1-E_2/NS_1-NS_2-NS_3-NS_4-NS_5-UTR-3’。研究发现:HCV基因组中存在不同程度的基因变异,其中非翻译区UTR、编码核心蛋白的C区基因序列相对保守,编码非结构蛋白的NS_2-NS_5区基因序列     

20-fold increase in risk of lamivudine resistance in hepatitis B virus subtype adw

We investigated subtype-dependent development of lamivudine resistance in hepatitis B virus (HBV) longitudinally in 26 consecutive patients (13 adw and 13 ayw carriers) during antiviral treatment of chronic hepatitis B. Lamivudine resistance developed in seven adw carriers and one ayw carrier. Risk of lamivudine resistance was significantly higher for adw carriers than for ayw carriers (p=0.03). We believe that the adw subtype of HBV is associated with a high risk of lamivudine resistance, which might be linked to simultaneous changes of the HBsAg that occurs with the emergence of resistance.     

adw亚型HBV突变体与ayw亚型辅助质粒之间相互包装的研究

目的探讨adw亚型HBV突变体与ayw亚型辅助质粒之间相互包装。方法构建C基因截短adw亚型HBV表达载体pHBV-ΔC。重组载体与ayw亚型辅助质粒pHBV3142共转染HepG2细胞。以与PGEm共转染为对照。用PCR检测细胞核内重组HBV载体cccDNA生成和培养上清中rcDNA的形成,用Native westernblot和Soutern blot检测重组HBV载体在辅助质粒pHBV3142辅助下的包装。结果在实验组细胞核内可检测到cccDNA、培养上清中可检测到rcDNA,对照组中无此结果。实验组Soutern blot见阳性信号而对照组无阳性信号。结论重组adw亚型HBV载体在辅助质粒ayw亚型pHBV3142辅助下能进行有效复制且有效完成病毒包装。     

Establishment of transgenic mouse harboring hepatitis B virus (adr subtype) genomes

INTRODUCTIONHepatitis B virus (HBV) belongs to the group ofhepatovirus, a major pathogen of human acute andchronic hepatitis B[1 4], which has a very closeassociation with human hepatocellular carcinoma(HCC)[5-8], For example, a statistical data from ahospital in Shanghai showed that 80% of HCCpatients were positive for HBsAg ( personalcommunication).     

Establishment of transgenic mouse harboring hepatitis B virus (adr subtype) genomes

Hepatitis B virus (HBV) belongs to the group ofhepatovirus, a major pathogen of human acute andchronic hepatitis B, which has a very closeassociation with human hepatocellular carcinoma(HCC). For example, a statistical data from ahospital in Shanghai showed that 80% of HCCpatients were positive for HBsAg (personalcommunication). The published data reported thatpeople infected with HBV have a 200-fold greater     

乙型肝炎病毒基因组全序列的扩增及高效克隆

我们使用一步法扩增得到乙型肝炎病毒（HBV）基因组全序列，与T载体连接，并转化人自制的超高效TOPO10感受态细胞，获得了较高的转化效率。为今后深入进行HBV全基因组的研究提供了基础和工具。     

乙型肝炎病毒(adr亚型)重组逆转录病毒包装及滴度测定

目的包装乙型肝炎病毒（adr亚型）重组逆转录病毒并进行滴度测定，为下一步构建乙型肝炎病毒（adr亚型）转基因小鼠奠定基础。方法将乙型肝炎病毒（adr）全基因组插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了乙型肝炎（adr）重组逆转录病毒载体，鉴定正反向后，脂质体转染PA317包装细胞，G418抗性压力下进行筛选得到阳性细胞克隆，扩大培养后进行滴度测定，选取产毒率高细胞克隆株，然后扩大培养、浓缩，进行滴度测定。结果分别获得HBV（adr）全基因组正向和反向插入的重组逆转录病毒。正连重组逆转录病毒载体经PA317细胞包装，经筛选、浓缩后滴度为10^6CFU／ml，反连重组逆转录病毒载体经PA317细胞包装，经筛选、浓缩后滴度为10^5CFU／ml。结论PA317细胞包装了含乙型肝炎病毒（adr）全基因组的重组逆转录病毒。