结核分枝杆菌利福平耐药的分子基础与检测技术

自20世纪80年代以来,结核病疫情重新上升,成为严重危害公共卫生的问题之一。据世界卫生组织估计,目前全球约有20亿人感染结核分枝杆菌(结核菌),其中约有5,000万人感染耐药结核菌[1]。中国是世界上结核病负担最重的22个国家之一,因此对结核菌耐药机制和耐药性检测的研究意义重大。结核菌的耐药性的产生主要是由于不合理用药引起的结核菌内抗结核药物作用靶基因突变所致[2],而利福平(RFp)作用方式及耐药机制一直是分支杆菌病基础研究的热点之一。近年来,随着分子生物学技术的不断发展,人们对结核分支杆菌RFP耐药的分子机制逐步有了认识,并在…     

耐异烟肼结核分支杆菌分子生物学研究进展

近年来结核病再度流行,耐药结核菌株的出现是重要原因之一。异烟肼作为治疗结核病最主要的一线药物,其耐药率显著上升,我国异烟肼耐药率已达20％以上。结核分支杆菌对异烟肼的耐药机制较为复杂,涉及多个分子靶位,近年来在结核病研究中倍受关注,国内外已有这方面的研究报道。本文对近年来耐异烟肼结核分支杆菌的分子生物学研究进展作一综述。     

结核分枝杆菌耐药基因突变的研究

结核病在许多国家出现回升的一个主要原因是细菌耐药性问题 ,随着联合药物治疗的使用 ,又出现了耐多药结核分枝杆菌 (结核菌 ) ,使许多结核病 ,难以治疗 ,增加了死亡率[1] 。目前对于结核菌的耐药机制的研究已有了较大的进展 ,细菌内一些酶的基因突变或缺失是导致耐药的重要原因。随着分子生物学技术的发展 ,通过聚合酶链反应 (PCR)等方法对耐药基因进行快速检测 ,大大缩短了检测时间 (2～3d) ,为耐药结核菌的治疗提供参考。本研究通过PCR -SSCP ,PCR -测序技术检测结核菌临床分离株的katG、rpoB和rpsL基因序列 ,分析济南军区结核菌…     

广西结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因突变特征

目的 了解广西壮族自治区结核分枝杆菌乙胺丁醇(EMB)耐药基因突变特征及其影响因素，为结核病的分子诊断和临床治疗用药提供依据。方法 对2018-2019年广西30个结核病耐药监测点连续不间断收集的655株结核分枝杆菌(其中52株乙胺丁醇耐药菌株，603株乙胺丁醇敏感菌株)进行全基因组测序，分析乙胺丁醇耐药基因突变特征及其影响因素。结果 655株结核分枝杆菌中，54株发生乙胺丁醇耐药基因突变，突变率为8.24%(54/655)。在比例法检测EMB耐药的52株菌株中，21株发生基因突变，突变率为40.38%(21/52);603株EMB敏感株中，33株发生基因突变，突变率为5.47%(33/603)，耐药株中的基因突变率高于敏感株(χ²=77.133,P=0.000)。EMB耐药表型与基因突变的符合率为40.38%(21/52)，二者检测结果吻合度不高(Kappa值=0.343,P <0.001)。54株发生基因突变的菌株，突变基因为emb A、emb B和emb C，突变形式有20种，其中单位点突变29株，占53.70%(29/54)，联合位点突变25株，占4...     

结核分枝杆菌耐药机制及耐药性检测的研究进展

自 2 0世纪 80年代以来 ,结核病疫情重新上升 ,成为严重危害公共卫生的问题之一。据世界卫生组织估计 ,目前全球约有 2 0亿人感染结核分枝杆菌 (结核菌 ) ,其中约有 5 0 0 0万人感染耐药结核菌[1] 。因此对结核菌耐药机制和耐药性检测的研究意义重大。结核菌的耐药性的产生主要是由于不合理用药引起的结核菌内抗结核药物作用靶基因突变所致[2 ] 。目前检测结核菌耐药性的方法有表型检测和基因型检测两大类。一、结核菌的耐药机制染色体基因变异是结核菌产生耐药性的主要机制。结核菌 95 %以上的基因变异是直接由于抗结核药物引起[2 ] 。细菌…     

结核分枝杆菌对乙胺丁醇耐药突变基因检测方法的建立

乙胺丁醇 (EMB)是一线抗结核药物 ,最近的研究结果表明 ,结核分枝杆菌 (结核菌 )对EMB耐药的产生与阿拉伯糖基转移酶编码基因embB改变有关。其中embB基因 (尤其是 30 6位密码子 )突变是产生对EMB耐药的主要分子机制。聚合酶链反应 -单链构象多态性分析 (PCR SSCP)是近年发展起来的最常用的基因突变分析技术 ,结合染色法 (silverstaining) ,使其应用前景更为广阔。我们应用PCR SSCP银染技术和PCR 直接测序法对河南省耐药监测中收集的 87株结核分离株embB基因进行了研究。一、材料和方法1 .结核菌H3 7Rv标准株来源于中国药品生物…     

聚合酶链反应-单链构象多态性检测利福平结核分子杆菌rpoB基因突变

结核病耐药趋势严峻 ,传统的检测结核分子杆菌耐药方法均操作繁杂、费时。聚合酶链反应单链构象多态性(PCR SSCP)方法是一种快速检测基因突变与缺失的方法〔1〕。我们采用该方法分析 80株结核分支杆菌 rpo B基因突变情况 ,研究 rpo B基因与耐利福平(RFP)之间的关系 ,报告如下。     

耐药结核分枝杆菌基因突变分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药表型与基因突变位点之间的相互关系.方法 采用序列特异性引物分别扩增92株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB,异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC,链霉素耐药基因rrs、rpsL,乙胺丁醇耐药基因embB及喹诺酮耐药基因gyrA,SSCP筛选出突变序列,DNA测序分析突变性质.结果 59株利福平耐药株rpoB基因突变检出率94.9%(56/59),以Ser450Trp突变最多;90株异烟肼耐药株中,katG基因突变检出率38.9%(35/90),以Ser315Thr最多,3株检出inhA基因突变,ahpC基因无突变检出;34株喹诺酮耐药株中gyrA基因突变检出率82.4%(28/34),主要为Asp94Gly,其次为Ala90Val;31株链霉素耐药株中,15株检出rrs突变,最常见为A514C和A1041G,10株发生rpsL Lys88Arg突变,总的链霉素基因突变检出率为77.4%(24/31);31株乙胺丁醇耐药株中embB 基因突变检出率19.4%(6/31),主要为Met306Val.结论 耐药结核分枝杆菌耐药情况较为严重,以DNA测序为基础的基因突变分析能快速有效地检测结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA、rrs、rpsL、embB 等耐药分子标识,显示了西安地区耐药性结核分枝杆菌的突变特点,为结核病的临床诊断和合理用药提供了实验依据.     

293例耐多药结核可疑者结核分枝杆菌培养及耐药分析

近年来,结核病流行又呈持续上升趋势,结核菌耐药性的增加和天然耐药株的产生是主要原因之一.MDR-TB(耐多药结核)是指肺结核患者感染的结核分枝杆菌至少同时对异烟肼和利福平耐药.结核菌耐药趋势是反映某一地区结核病防治工作实施效果的重要指标.为了了解聊城市耐多药结核可疑者结核分枝杆菌培养及耐药情况,尽可能的发现耐多药结核患者,我们对293例痰涂片抗酸杆菌阳性耐多药结核可疑者,进行分枝杆菌培养及药敏监测,现报告如下.     

结核杆菌利福平耐药水平与rPOB基因突变率的关系

目的：调查临床分离结核菌株剂福平耐药水平与rPOB基因突变率的关系。方法：以结核分杆菌标准株H37RV为对照，采用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）方法对100株利福平高耐药菌、16株利福平低耐药菌和20株利福平敏感菌进行了分析。结果：利福平高耐药、低耐药和敏感结核菌株rPOB基因发生点突变的比率分别为96%、31%和0%。结论：结核分支杆菌对利福平高度耐药主要因rPOB基因发生突变所致；而对利福平低度耐药的大部分结核菌株其rPOB基因未检测到点突变，可能与适应性耐药有关。     

结核分枝杆菌耐药特点分析

目的分析临床分离结核分枝杆菌的耐药特点。方法用改良罗氏培养基间接药敏实验绝对浓度法检测结核菌的耐药情况。结果210株临床分离株中对6种药物全部敏感仅有1株;两种以上药物耐药的有148株,耐药率70.48%;同时耐INH和RFP的菌株有90株,耐药率42.86%。结论耐药及耐多药结核菌感染是临床治疗结核病的一个严重问题;临床分离的结核杆菌耐药率和耐多药率高;分析临床分离株的耐药特点,对控制结核病传染及指导临床合理用药具有重要意义。     

浙江省丽水市结核分枝杆菌临床分离株耐药性及基因突变情况

目的 调查浙江省丽水市结核病定点医院患者结核分枝杆菌（MTB）临床分离株耐药特征及耐药基因突变情况，为该地区耐药结核病防控提供依据。方法 采用荧光PCR熔解曲线法对培养自丽水市结核病定点医院结核病患者MTB临床分离株进行抗结核药物耐药性及耐药基因突变位点检测及分析。结果 242株MTB总耐药突变占16.53%(40/242)，耐多药率为4.96%(12/242)，耐药顺位分别为异烟肼>链霉素>利福平>氟喹诺酮类>乙胺丁醇。链霉素耐药株基因突变位点主要发生在rpsL43位密码子，占比为65.00%(13/20)；异烟肼耐药基因突变位点主要发生在katG315密码子，占比为76.19%(14/21)；利福平耐药基因突变位点主要发生在rpoB基因529-533位密码子，占比为61.11%(11/18)；乙胺丁醇耐药基因突变位点主要发生在embB306位密码子，占77.78%(7/9)。结论 丽水市结核患者总体耐药突变低于全国耐药水平，但耐药模式和耐药基因突变情况仍较为复杂，需进一步加强耐药结核病监测及防控工作。     

多种耐药结核病及其治疗

多种耐药结核病(multidrug resistant tuberculosis,MDR—TB)指结核患者的结核菌株体外检测对两种或更多种的一线抗结核药物耐药。1990年全国第三次结核病流行病学抽样调查结果显示,耐两种以上抗结核药物的多耐率为20.2％。近几年有些作者把MDR-TB定义为结核菌株体外检测至少对异烟肼(INH)和利福平(RFP)同时耐药,因为这是两种最有效的抗结核药。过去,曾一度认为耐药性结核菌传染性低,但现在发现有同样的传染性。多种耐药结核病的传播,将可导致     

应用聚合酶链反应-寡核苷酸探针快速检测结核菌耐药基因突变

目的应用聚合酶链反应(PCR)-寡核苷酸探针快速检测结核菌耐药基因突变，建立一种新的分子药敏试验方法。方法以传统药敏试验、PCR-单链构象多态性和PCR-直接测序方法为对照，对利福平、链霉素(SM)和乙胺丁醇耐药的结核菌基因rpoB、rpsL、ITS和embB的寡核苷酸探针，通过反向斑点杂交检测78株结核菌临床分离株PCR产物。结果18株结核菌药物敏感株的4种耐药基因均为野生型。60株结核菌耐药分离株中，59株为耐RFP株，rpoB基因突变率为93．2％，最常见的突变位点为531位和526位密码子，33株为耐SM株，rpsL基因突变率为75．8％，均为43位密码子AAD AGG突变，ITS基因突变率为9．1％，均为513位A→C突变，rpsL和ITS基因总突变率为84．8％；43株为耐EMB株，embB基因突变率为58．1％，均为306位密码子突变。结论应用PCR一寡核苷酸探针反向斑点杂交技术可简便、快速、准确地分析大多数结核菌耐药基因突变，检测其耐药性。     

江西省3个监测点结核分枝杆菌耐药性及耐药基因检测分析

  目的  了解江西省国家级结核病耐药监测点确诊病例的分枝杆菌分离菌株耐药性及耐药基因突变情况,为耐药结核病防治策略制定提供科学依据。  方法  采用罗氏药敏方法测定结核分枝杆菌的耐药性,并采用PCR-线性杂交酶法进行表型耐药菌株耐药基因检测。  结果  2019年3个监测点共纳入病例280例。 获得264株分离菌株,250株为结核分枝杆菌,14株为非结核分枝杆菌。 大余县、进贤县和广丰区3个监测点的分离株总耐药率、单耐药率、多耐药率、耐多药率分别为25.60%（64/250）、7.20%（18/250）、3.20%（8/250）、5.60%（14/250）;男性分离株耐药检出率高于女性;S315T1是本地区异烟肼耐药基因突变的主要型别,gyrA基因突变是江西省结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物耐药的主要基因。  结论  使用PCR-线性杂交酶法筛查一线药、二线药耐药基因突变,对确定治疗方案及结核病的防控有重要意义。 江西省要加强对耐药结核病患者的管理,控制传染源,从而减少耐药菌株的产生和传播。     

结核分支杆菌喹诺酮耐药基因的研究

[目的]了解结核分支杆菌耐喹诺酮耐药基因突变情况,建立快速分子药敏实验方法。[方法]通过PCR—SSCP和直接测序技术(PCR～DS)分析结核分支杆菌的gyrA基因突变的情况。[结果]以结核分支杆菌标准菌株H37Rv和卡介苗做对照,30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱均泳动正常,测序分析与对照株相同。45株喹诺酮耐药株中,34株(75．6％)gyrA基因SSCP图谱泳动异常;测序证实10株为90位密码子的突变,24株为94位密码子突变,符合率100％。[结论]gyrA基因突变是结核分支杆菌耐喹诺酮的主要分子机制,PCR—SSCP可能成为测定部分结核分支杆菌耐喹诺酮株的简便、快速的方法．并有望直接用于临床标本喹诺酮敏感性试验。     

结核杆菌异烟肼表型耐药与katG基因突变相关性研究

目的:探讨结核分支杆菌异烟肼(INH)表型耐药与KatG基因密码子315位和463位基因改变的相关性。方法:采用基因直接测序法对结核分支杆菌分离株KatG基因进行分析。结果:132株异烟肼耐药菌株中68株KatG基因密码子315位有基因突变,突变率51.52%(68/132),野生型密码子315AGC(Ser)突变成ACC(Thr)60株,AAC(Asn)6株,ACA(Thr)1株,GGC(GIy)1株。133株INH敏感菌株未发现KatG 315位基因突变。132株INH耐药菌株中123株KatG基因密码子463位有基因突变,突变率为93.18%,野生型密码子463CGG(Arg)突变成CTG(Leu)123株;133株敏感菌株中114株KatG基因密码子463位有基因突变,突变率为85.71%,野生型密码子463 CGG(Arg)突变成CTG(Leu)114株。结论:①KatG基因315位密码子突变是菌株异烟肼表型耐药的重要分子基础,以Ser315Thr错义突变为主。②KatG基因463位密码子突变与异烟肼耐药表型没有相关性,不是结核杆菌异烟肼耐药的分子标志。该位点突变可能是基因多态性,与结核菌治疗带来的选择性压力无关。     

实时荧光PCR分子信标检测耐利福平结核分枝杆菌印rpoB基因

目的 应用实时荧光PCR分子信标技术,建立快速检测临床标本中结核分枝杆菌利福平rpoB相关耐药突变点方法,探讨其缩短耐药实验报告时间的临床应用价值.方法 以分枝杆菌药物敏感性实验绝对浓度法为标准,12株非结核分枝杆菌、4株非分枝杆菌作对照,对174例结核患者临床分离株应用实时荧光PCR分子信标方法,检测利福平rpoB核心区域的耐药突变点并将结果与直接测序进行比较.结果 (1)实时荧光PCR分子信标方法:82例结核分枝杆菌利福平敏感菌株中,3例发生rpoB基因突变,特异度为96.3%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,82例检出耐药突变,敏感度为89.1%;准确性为92.5%.(2)DNA直接测序分析:82例结核分枝杆菌利福平敏感株中,1例发生rpoB基因突变,特异度为98.8%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,83例发生:rpoB基因突变,敏感度为90.2%;准确性为94.2%.检测174株结核分枝杆菌临床分离菌株,与实时荧光PCR分子信标方法检测一致性为98.3%(171/174).结论 实时荧光PCR分子信标方法检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变点可作为结核患者快速耐药检测的初筛方法之一.     

耐药结核分枝杆菌链霉素耐药基因的分子流行病学研究及其快速检测

目的探讨结核分枝杆菌对链霉素的耐药分子机制，建立基于焦磷酸测序（pyrosequencing）技术的快速检测结核分枝杆菌链霉素耐药性的方法。方法用扩增后直接测序的方法检测了150株结核分枝杆菌链霉素耐药株的rpsL基因，并用pyrosequencing技术对其中20株的rpsL基因43位密码子进行了检测。结果150株链霉素耐药株中2株rpsL基因缺失，115株rpsL基因存在突变，突变率为77．7％，最主要的突变形式是43位密码子突变，pyrosequencing的检测结果与测序结果相符。结论rpsL基因突变是产生链霉素耐药的重要分子机制，pyrosequencing技术具有快速、准确等特点，适用于对耐链霉素结核分枝杆菌进行快速高通量的检测。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变检测的进展

利福平(rifampin,RFP)是最主要的抗结核药物之一,它在结核病治疗,特别是短程化疗中起着重要作用,抗结核药物也同其它抗生素一样,面临耐药性问题,2000年全国结核病流行病学抽样调查结果显示:结核分枝杆菌对RFP的耐药率为16.6%[1],耐药问题是结核病化疗中的难题,也是控制结核病面临的困难之一,了解结核病人耐药情况和机制,是建立合理有效的抗结核化疗方案的必要条件.近年来,国内外研究认为结核分枝杆菌对RFP耐药与它的rpoB基因突变有着密切相关.本文就结核分枝杆菌rpoB基因突变检测进展作一综述.