莱菔硫烷应用于肿瘤治疗的机制研究

莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)是1种异硫氰酸盐.SFN是已知的异硫氰酸盐类物质中抗癌活性最强的1种.SFN相对分子质量为177.3,化学式简写作1-异硫氰基-4-(甲基亚硫酰基)丁烷[1-isothiocyanato-4-(methylsulfinyl)butane],分子式为C6H11S2NO.莱菔硫烷...     

莱菔硫烷促进神经胶质瘤细胞凋亡的机制探讨

目的探讨莱菔硫烷(SFN)促进神经胶质瘤细胞凋亡的作用机制。方法采用噻唑蓝(MTT)法与流式细胞法检测不同浓度的SFN对神经胶质瘤U251细胞系生长的抑制作用,测定半数抑制浓度,空白对照设为对照组;采用Western blot研究SFN对U251细胞内Cyt-c的表达情况。结果不同浓度SFN组A值均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。不同浓度SFN均对U251细胞生长有一定抑制作用,12.5μmol/l、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l浓度的SFN对U251细胞生长抑制率逐渐增强,各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。但100μmol/l与200μmol/l浓度的SFN对U251细胞生长抑制率比较无统计学意义(P>0.05)。不同浓度SFN诱导细胞凋亡率及Cyt-c蛋白表达均显著高于对照组,且随着SFN浓度递增,U251细胞凋亡率、Cyt-c蛋白表达逐渐增加,各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论SFN可能参与神经胶质瘤细胞的凋亡过程,表现为诱导凋亡U251细胞,可能与Cyt-c表达增高存在关系。     

莱菔硫烷诱导线粒体裂变抑制血管生成

目的 探讨莱菔硫烷对血管生成的影响及其可能机制。方法 体外实验以原代人脐静脉血管内皮细胞为研究模型,以1‰ 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）干预作为对照。应用WST-1试剂盒检测不同浓度莱菔硫烷（5～100μmol/L）对原代人脐静脉血管内皮细胞增殖活性的影响,采用小管形成实验和Transwell迁移实验分析莱菔硫烷干预（10μmol/L）对原代人脐静脉血管内皮细胞管腔生成、迁移能力的影响,采用Mito-Tracker Green FM染料标记线粒体结合共聚焦显微镜成像技术观察莱菔硫烷（10μmol/L）干预后线粒体形态学改变,以及蛋白免疫印迹法检测线粒体动态相关蛋白包括线粒体融合蛋白1/2、动力相关蛋白1表达水平,以及血管内皮生长因子的蛋白表达。结果 5μmol/L莱菔硫烷干预24h对人脐静脉血管内皮细胞增殖活性无显著影响,而 ≥ 10μmol/L 莱菔硫烷干预则抑制了人脐静脉血管内皮细胞活性,10、20、40、80、100μmol/L干预组抑制率分别为（17.82±5.80）%（P=0.009）、（35.33±6.26）%（P<0.001）、（65.29±4.26）%（P<0.001）、（66.82±3.94）%（P<0.001）及（68.05±2.54）%（P<0.001）,IC50为38.15μmol/L。为避免过高干预剂量所致严重毒性效应,我们将选取10μmol/L作为主要干预剂量。与对照组相比,10μmol/L 莱菔硫烷干预显著抑制人脐静脉血管内皮细胞血管生成能力,其中迁移能力降低了（42.98±9.21）%（P=0.018）,而管腔样结构形成能力,包括管腔数量、节点数和管腔总长度则分别降低了（83.94±18.36）%（P=0.011）、（59.22±25.60）%（P=0.021）及（50.49±23.44）%（P=0.025）。人脐静脉血管内皮细胞血管生成能力被莱菔硫烷抑制同时,伴有线粒体动态紊乱、线粒体裂变的发生。相对于对照组而言,10μmol/L 莱菔硫烷干预组线粒体网络数、纵横比显著减少（27.39±22.46）%（P=0.006）、（11.37±8.26）%（P<0.001）,而圆度显著增加（11.97±12.07）%（P<0.001）。与此相对应的是,10μmol/L莱菔硫烷干预显著上调促裂变蛋白而抑制促融合蛋白表达,动力相关蛋白1表达相当于对照组的（1.71±0.039）倍（P<0.001）,而线粒体融合蛋白1/2表达则分别相当于对照组的（59.30+1.50）%（P=0.006）和（74.75±11.84）%（P=0.031）。同时,血管内皮生长因子蛋白表达则相当于对照组的（65.66±9.49）%（P=0.003）。结论 莱菔硫烷具有抑制血管生成活性,其机制可能与其促进血管内皮细胞线粒体裂变有关。     

莱菔硫烷对A549细胞株CYR61基因表达的影响

 目的 探讨莱菔硫烷(sulforaphane, SFN)对A549细胞株CYR61基因表达的影响。 方法 用MTT法检测SFN对A549细胞的抑制效应。用real-time PCR检测SFN干预的A549肺癌细胞株CYR61表达水平。 结果 MTT结果显示：SFN从40 μM的浓度起开始出现细胞抑制效应,随着浓度的升高呈现剂量依赖效应,浓度越高抑制率越大;且40 μM、80 μM、100 μM和160 μM SFN等较大剂量在不同作用时间点具有时间效应关系,干预时间越长,抑制率越大。光镜下细胞形态： 细胞在培养32 h后, 25 μM的SFN处理组部分A549细胞皱缩、变圆,折光性上升;50 μM的SFN处理组皱缩细胞数目增多;75μM的SFN处理组细胞皱缩数目进一步增多,部分细胞漂浮,并可见细胞碎片。25 μM和50 μM浓度SFN干预组的CYR61基因表达量较高,25 μM SFN组与50 μM SFN组之间差异没有统计学意义,25 μM SFN组和50 μM SFN组与其他各组相比,差异有统计学意义。 结论 SFN在一定浓度下对A549细胞株起抑制作用,并对A549肺癌细胞株CYR61基因的表达有促进作用,可为食用十字花科类蔬菜预防肺癌提供依据。     

莱菔硫烷抑制肺癌干细胞增殖的体外实验

目的 研究莱菔硫烷（sulforaphane, SFN）对肺癌干细胞增殖的影响及其机制。方法 采用MTT法分析SFN对H460细胞增殖的影响;应用流式细胞术（FACS）检测SFN对细胞凋亡和侧群细胞比例的影响;肿瘤球培养法分析SFN对肿瘤球生长的影响;使用shRNA慢病毒载体构建β-catenin低表达细胞株,并应用蛋白电泳法检测在β-catenin正常或低表达情况下莱菔硫烷对β-catenin、Oct4、Sox2、c-Myc、Nanog等基因表达的影响。结果 SFN有效抑制H460细胞增殖,IC50为11.2 μmol/L。SFN处理72 h后,细胞凋亡呈剂量依赖性增高。SFN有效抑制原代肿瘤球和2代肿瘤球的生长,在较低浓度（1.0 μmol/L）下即有明显的抑制作用。FACS检测提示侧群细胞比例随SFN浓度增高而减少。SFN浓度依赖性地抑制β-catenin、Oct4、Sox2、c-Myc和Nanog等蛋白表达。在低表达β-catenin情况下,Oct4、Sox2、c-Myc、Nanog等基因表达水平与SFN浓度相关。结论 SFN通过β-catenin和干性相关基因（Sox2、c-Myc、Nanog和Oct4）特异地抑制肺癌干细胞的增殖。     

莱菔硫烷下调miR-200c启动子甲基化水平抑制肺腺癌干细胞的干性特征

目的 探讨莱菔硫烷（SFN）对肺癌干细胞增殖与自我更新的影响及其调控机制。方法 MTT法检测SFN对肺腺癌细胞株H460和A549细胞增殖的影响;肿瘤球形成实验、蛋白印迹法等检测SFN处理前后肺腺癌细胞肿瘤球形成能力、干性相关基因（如β-catenin、Klf4、c-myc）表达水平等;NGS测序法分析SFN对肿瘤细胞miRNAs表达谱的影响;qRT-PCR验证SFN对重点miRNAs转录水平的改变;蛋白印迹法检测SFN对肿瘤细胞DNA甲基化转移酶（DNMTs）表达的影响;构建miR-200c启动子-GFP质粒,细胞免疫荧光、甲基化PCR法和DNA测序法检测SFN对肿瘤球和miRNA启动子甲基化水平的影响。结果 SFN（5.0 μmol/L）处理肺腺癌细胞肿瘤球后miRNAs表达谱发生显著变化,其中miRNA-200c增高最为明显。与对照组比较,SFN-S组H460和A549细胞β-catenin、Klf4、c-myc和Vimentin等蛋白表达下降,DNMT1和DNMT3a蛋白表达水平也明显降低。与对照组比较,SFN-S组稳定表达pEGFP-R200c质粒的H460和A549细胞肿瘤球直径显著减少,而肿瘤球荧光强度增加,GFP蛋白表达上调。上述表达pEGFPR200c质粒细胞株中miR-200c启动子区域存在9个CpG丰富区域位点,其甲基化水平在对照组、SFN-S组和5-Aza-dC组分别为88.9%、44.4%、38.8%。结论 SFN可能经由表观遗传学水平下调miR-200c启动子甲基化水平,促进miR-200c的转录,从而调控肺癌干细胞的干性相关基因表达。     

二烯丙基二硫阻滞人胃癌细胞周期的作用及机制

 目的观察二烯丙基二硫(DADS)对人胃癌MGC803细胞周期的影响及其机制。方法应用流式细胞术分析人胃癌MGC803细胞在DADS处理前后细胞周期分布的变化。采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白过氧化酶方法(SP)检测DADS处理前后p21WAF1、Rb、p53、p21ras、Cmyc基因的表达。结果20、25、30、35μ·ml-1DADS的不同浓度处理的MGC803细胞G1期细胞所占比例无影响,S期细胞数减少,而G2期细胞则明显增加,与未处理组比较有显著性差异(P<0.05)。DADS作用后的MGC803细胞,p21WAF1表达明显增加,而Rb表达呈弱阳性,p53、p21ras、Cmyc表达阴性。DMSO处理的MGC803细胞亦呈现同样改变。结论DADS可以阻滞MGC803细胞于G2/M期。其作用机制可能与上调p21WAF1、Rb基因表达,下调p53、ras、Cmyc基因表达有关。     

白藜芦醇对胃癌细胞HGC27细胞周期的影响

目的:研究白藜芦醇对胃癌细胞株HGC27细胞细胞周期的影响.方法:不同浓度的白藜芦醇作用于HGC27细胞,用流式细胞术分析细胞周期.结果:白藜芦醇作用后,HGC27细胞的增殖速度减缓,DNA合成减少.白藜芦醇在较低浓度时即可诱导G0/G1阻滞.结论:白藜芦醇可诱导胃癌细胞发生G0/G1阻滞,S期减少.     

白藜芦醇对胃癌细胞HGC27细胞周期的影响

目的：研究白藜芦醇对胃癌细胞株HGC27细胞细胞周期的影响。方法：不同浓度的白藜芦醇作用于HGC27细胞,用流式细胞术分析细胞周期。结果：白藜芦醇作用后,HGC27细胞的增殖速度减缓,DNA合成减少。白藜芦醇在较低浓度时即可诱导G0／G1阻滞。结论：白藜芦醇可诱导胃癌细胞发生G0／G1阻滞,S期减少。     

二烯丙基二硫对人结肠癌HT-29细胞周期的阻滞作用

[目的]探讨二烯丙基二硫(DADS)对人结肠癌HT-29细胞周期的阻滞作用及其分子机制.[方法]应用MTF法及细胞计数法测量HT-29细胞生长抑制,流式细胞术检测细胞时相分布,免疫细胞法测定p21、C-myc、Cyclin E表达.[结果]MTT法显示,不同浓度DADS作用HT-29细胞12、24、48h后,细胞生长抑制率及细胞群体倍增时间呈浓度、时间依赖性增加.流式细胞仪分析,30、60pmol/LL DADS阻滞HT29细胞在G1期,与对照组相比,可使G1期细胞增加约2倍,而90、120μmol/L DADS显著地将细胞阻滞在G2/M期.免疫细胞化学分析表明在细胞周期阻滞的同时有p21wafl蛋白表达上调,Cyclin E、C-myc蛋白表达下降.[结论]DADS对HT-29细胞的抑制增殖作用可能与细胞周期阻滞有关,DADS对HT-29细胞周期阻滞的分子机制可能与调节p21wafl、Cyclin E、C-myc表达相关.     

Expressions of Cell Cycle Regulators in Human Colorectal Cancer Cell Lines

To study the altered mechanisms of cell cycle regulation in colorectal cancer, the expressions of cyclins, cyclin-dependent kinases (CDKs), CDK inhibitors, p53 and retinoblastoma (Rb) protein were analyzed by western blotting in a series of human colorectal cancer cell lines. The colorectal cancer cell lines exhibited various expression patterns of cell cycle regulators, which may reflect differences in the biological characteristics of cancer cells and in the genetic backgrounds of carcinogenesis. A correlation was found between p53 gene alteration and p21 expression, suggesting that p53 gene mutation usually suppresses p21 expression, though p21 expression could be induced via both ap53 -dependent and a p53 -independent pathway in colorectal cancer. None of the cell lines studied expressed p16 protein, suggesting that inactivation of p16 may be a common alteration in colorectal cancer. Moreover, all the D-type cyclins, especially D2 and D3, were expressed at a high level in most of the cell lines. Loss of p16 expression and increased expression of D-type cyclins promote CDK-mediated Rb phosphorylation. All of the colorectal cancer cell lines studied herein expressed Rb protein, but the growth-suppressive properties of Rb may be inactivated by the loss of p16 expression and increased expressions of D-type cyclins. In view of the pivotal role of Rb in cell cycle regulation, loss of p16 expression and overexpression of D-type cyclins may be critical alterations in colorectal cancer.     

芒柄花素对不同亚型乳腺癌细胞增殖及细胞周期的影响

目的研究芒柄花素对人乳腺癌细胞MDA-MB-468、MCF-7、SK-BR-3的增殖及细胞周期影响。方法以三种乳腺癌细胞为研究对象,经MTT法观察不同浓度芒柄花素对乳腺癌细胞的增殖抑制情况;Western blot法检测增殖细胞核抗原（PCNA）表达情况;TUNEL法检测细胞凋亡情况;流式细胞仪观察细胞周期的改变情况。结果芒柄花素用药浓度大于20 μM时,抑制3种乳腺癌细胞的增殖, 降低PCNA蛋白的表达,G1期细胞比例均明显增多。结论芒柄花素可将细胞周期阻滞于G1期、减少PCNA蛋白的表达,从而抑制乳腺癌细胞增殖。     

DON 对胃癌细胞HGC-27 细胞周期和凋亡的影响

 目的 探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）对体外培养胃癌细胞HGC-27细胞周期和凋亡的影响。方法 体外培养的胃癌细胞HGC-27经50、100、1000、2000μg／L DON处理12h、24h、48h，应用流式细胞术（FCM）进行细胞周期分析，检测凋亡情况及其量效关系，Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达情况。结果 FCM检测结果表明，较高浓度（1000和2000μg／L）DON处理对细胞周期分布的影响随处理时间不同有明显差异。DON处理12h，可明显降低G0／G1细胞百分率、增加S期细胞百分率。处理时间延长至24h和48h，则表现为G0／G1细胞百分率增加，S期细胞百分率降低（P〈0．05）。DON处理24h和48h，各DON实验组HGC-27细胞凋亡率均高于对照组，在50～2000ug／L浓度范围内，凋亡率随着DON处理浓度的升高而升高。Western blot检测凋亡相关蛋白结果显示，DoN处理12、24和48h，Bax和Caspase-3蛋白表达均明显升高，而Bcl-2蛋白表达降低。结论 DON处理可影响体外培养的胃癌细胞象HGC-27细胞的细胞周期分布，其作用依DON浓度和作用时间的不同而有差异。同时DON可诱导HGC-27细胞凋亡，上调Bax和Caspase-3蛋白表达和下调Bcl-2蛋白表达可能是其诱导细胞凋亡的机制之一。     

替尼泊甙对胃癌细胞凋亡及细胞周期的影响

 目的 探讨替尼泊甙体外对胃癌细胞BGC-823的作用机制。方法 体外培养胃癌细胞株BGC-823,通过MTT法,流式细胞仪,观察替尼泊甙对胃癌细胞的生长抑制作用以及对细胞凋亡,细胞周期的影响。结果 在一定浓度范围内,细胞的生长抑制率随着浓度的增加而增加,细胞的凋亡率随着时间的增加而增加,细胞周期被阻滞在G2/M期,在48小时达到高峰。结论 替尼泊甙可抑制胃癌细胞的生长,诱导细胞的凋亡,其诱导凋亡的能力可能是通过把细胞阻滞在G2/M期实现的。     

Bracken-fern Extracts Induce Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Certain Cancer Cell Lines

Bracken fern [Pteridium aquilinem (L.) kuhn (Dennstaedtiaceae)] is one of the most common species on the planet. It has been consumed by humans and animals for centuries. Use by some human groups is because theybelieve bracken fern is good for health as plant medicine. However, it is also one of the few known plants that can cause tumors in farm animals. Many interested groups have focused their attention on bracken fern because of these interesting features. In order to evaluate the biological effects of exposure to this plant in cellular level, human cancer cell lines were treated with the fern dichloromethane extracts and the genotoxic and cytotoxic effects were studied. Anti-proliferative/cytotoxic effects were evaluated by cell count, MTT assay and flow cytometry methods with three different cancer cell lines, TCC, NTERA2, and MCF-7, and two normal cells, HDF1 and HFF3. Pro-apoptotic effects of the extracts were determined by DAPI staining and comet assay, on TCC cancercells compared to the normal control cell lines. Cellular morphology was examined by light microscopy. Our present study showed that the extract caused DNA damage and apoptosis at high concentrations (200 μg/mL)and also it may induce cell cycle arrest (G2/M phase) at mild concentrations (50 and 30 μg/mL) depending on the cell type and tumor origin. These results indicate that bracken fern extract is a potent source of anticancercompounds that could be utilized pharmaceutically.     

雪灵芝水提物对人胃癌MGC-803细胞增殖及细胞周期的影响

目的探讨雪灵芝水溶性提取物(arenaria kansuensis aqueous extract,AKAE)对人胃癌细胞株MGC-803细胞增殖及细胞周期的影响。方法体外培养的MGC-803细胞经不同浓度AKAE处理,采用MTT法检测受试细胞增殖水平;应用流式细胞术检测AKAE处理12 h后各组细胞的细胞周期;Western blot检测不同浓度、不同时间AKAE处理组MGC-803细胞中cyclin D1蛋白表达水平;实时定量 PCR检测各组MGC-803细胞中cyclin D1、p16和p21基因的mRNA相对表达量。结果AKAE对体外培养的MGC-803细胞增殖具有浓度依赖性抑制作用（P<0.05）,IC₅₀为(0.134±0.005)mg/ml;经AKAE处理12 h,0.8 mg/ml组MGC-803细胞的 G₁期细胞比例高于对照组、S期细胞比例低于对照组（P<0.05）;(0.2～0.8) mg/ml浓度的AKAE处理,对MGC-803细胞中cyclin D1的蛋白及mRNA表达具有明显抑制作用（P<0.05）;AKAE促进MGC-803细胞中p16、p21基因mRNA 表达,0.2 mg/ml处理组p16、p21 mRNA相对表达量分别为对照组的3.3倍和18.5倍。结论雪灵芝水提物(AKAE)对MGC-803细胞增殖具有抑制作用,其机制与G₁期阻滞和对G₁期相关因子表达的影响有关。     

内皮抑素对人肺腺癌A549细胞周期及HIF-1表达的影响

目的研究内皮抑素在体外对人肺腺癌细胞A549的影响及机制。方法流式细胞术（FCM）检测内皮抑素治疗后,肺腺癌细胞A549的细胞周期分布;酶联免疫吸附法（ELISA）检测处理前后细胞中HIF-1的表达情况。结果内皮抑素处理肺腺癌A549细胞,可以使该细胞S期和G₂/M期细胞比例增多,抑制HIF-1的表达,且随处理时间的延长,HIF-1的抑制率不断提高。结论内皮抑素可以使A549细胞阻滞在G2/M期及S期的比例明显增加,从而为其他手段抑制A549细胞的增殖或直接杀伤A549细胞提供了基础;内皮抑素可以抑制肿瘤细胞的HIF-1表达,HIF-1是肿瘤细胞耐受放化疗的因素之一,因此联合内皮抑素治疗有可能提高放、化疗疗效。     

Effect of 5-Fluorouracil on Cell Cycle Regulatory Proteins in Human Colon Cancer Cell Line

We investigated the effects of 5-fluorouracil (5-FU) on cell cycle-regulating proteins in RPMI 4788 cells. 5-FU inhibited cell growth dose-dependently and this growth inhibition was accompanied with cell cycle accumulation in early S phase and increased expression of cyclin A. When cells were released from short-term treatment (3 or 24 h) with 5-FU, the cell cycle started to progress again and cyclin A protein levels decreased. Cyclin A-associated kinase activity assay showed that cyclin A-cyclin-dependent kinase (Cdk) 2 kinase activity was altered by 5-FU treatment concomitantly with the changes in cell cycle state seen in flow cytometric analysis. Furthermore, the elevation of cyclin A protein level by 5-FU treatment was observed in three other human cancer cell lines, DLD-1, H226Br and T.Tn. These results suggest that cyclin A protein levels in cancer cells are increased by 5-FU, and the cyclin A function and degradation mechanism remain normal.     

沉默p65基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞周期的影响

目的研究miRNA(microRNA)沉默p65基因后对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞周期分布的影响。方法用pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体构建p65 miRNA表达质粒,转染MDA-MB-231细胞,用RT-PCR检测转染前后各组细胞中p65 mRNA表达变化;凝胶电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)实验研究转染前后细胞中NF-κB结合活性的变化;流式细胞术(Flow cytometry, FCM)观察转染前后细胞周期分布的变化;Westernblot法检测转染前后细胞周期相关因子cyclinD1、CDK4、p21蛋白表达的变化。结果p65 miRNA质粒明显下调MDA-MB-231细胞中p65 mRNA的表达水平,并显著抑制细胞中NF-κB的结合活性(P<0.05)。FCM结果显示,转染组细胞G₀/G₁期细胞比例显著增加,S、G₂/M期细胞比例明显下降(P<0.05);Western blot分析结果显示,沉默p65基因后细胞中cyclinD1蛋白表达下调,p21蛋白表达增加。结论p65 miRNA可以显著降低p65 mRNA的表达,诱导乳腺癌细胞发生G₀/G₁期阻滞,可能是通过降低cyclinD1蛋白,上调p21蛋白表达而实现的。     

Up-regulation of p27Kip1 Correlates Inversely with Anchorage-independent Growth of Human Cancer Cell Lines

We examined the correlation between anchorage-independent growth and cell cycle-related molecules using 39 human cancer cell lines. They consisted of lung-, colon-, stomach-, breast-, ovarian-, brain-, renal- and melanoma-derived cell lines. Their anchorage-independent growth ability varied, but was not clearly related to the tissue of origin. There was a tendency for the levels of cyclin D1, cyclin E, cyclin A, p27, and p21 to show a tissue-dependent expression pattern. Statistical analysis revealed an inverse correlation of the p27 level with anchorage-independent growth ( r =−0.456, P <0.01). Thus, the regulation of p27 is suggested to be linked to the anchorage independence of human cancer cells.