猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠神经前体细胞株的构建

目的建立猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)永生化大鼠神经前体细胞株,为细胞移植治疗和转基因治疗提供稳定的细胞来源。方法利用脂质体介导的基因转染技术将含有SV40Tag的质粒pCMVSV40T/PUR转染原代培养的新生大鼠神经前体细胞,经嘌呤霉素筛选,阳性克隆扩大培养并连续传代。应用巢蛋白抗体进行细胞鉴定,5%胎牛血清诱导细胞分化后,应用免疫细胞化学法检测其分化能力,观察细胞的形态及其生长状况,绘制细胞生长曲线。用RT-PCR、Southern印迹杂交和免疫细胞化学法检测SV40Tag在转染细胞中的表达。结果转染细胞经筛选培养后获得1 个阳性细胞克隆,免疫细胞化学结果显示细胞的巢蛋白和微管相关蛋白2染色为阳性,增殖能力较强。5%胎牛血清可诱导转染细胞分化为微管相关蛋白2阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。Southern印迹杂交结果显示转染细胞基因组中存在SV40Tag cDNA,并可检测到SV40Tag mRNA及其蛋白的表达。转染细胞经扩大培养,命名为永生化神经前体细胞。贴壁培养的神经前体细胞,群体倍增时间为(22.9±2.7)h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论成功地构建了SV40Tag永生化的大鼠神经前体细胞株。     

免疫分选软骨前体细胞并诱导永生化的研究

目的建立永生化大鼠软骨前体细胞株,为细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源。方法利用免疫磁珠技术分离纯化具有特异性表面标志成纤维生长因子受体-3(FGFR-3)的软骨前体细胞,用基因转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)的重组质粒pEGFP- IRES2-SV40Tag转染原代培养的新生大鼠软骨前体细胞,经G418筛选,抗性克隆扩大培养。应用FGFR-3、Ⅱ型胶原和X型胶原抗体进行细胞鉴定,检测其分化能力,观察细胞的形态及其生长状况,绘制生长曲线。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Southern blot和免疫细胞化学法鉴定SV40Tag在转染细胞中的表达。结果获得1个阳性细胞克隆,免疫细胞化学证实为FGFR-3阳性的具有较强增值能力和多分化潜能的软骨前体细胞。经Southern印迹杂交证实,SV40Tag已稳定转染入软骨前体细胞,表达mRNA及其蛋白。贴壁培养的永生化软骨前体细胞株(IPSC),群体倍增时间为23.62 h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论SV40Tag导入可诱导软骨前体细胞永生化,为软骨前体细胞的实验研究及其介导的细胞移植治疗提供了稳定的细胞来源。     

大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建

[目的]分离、鉴定大鼠骨骺干细胞并建立永生化的大鼠骨骺干细胞株,为细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源.[方法]采用Percoll不连续密度梯度离心法分离骨骺干细胞,利用电穿孔转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因（SV40Tag）的质粒pCMVSV40T/PUR转染骨骺干细胞,经嘌呤霉素筛选,抗性克隆扩大培养.应用FGFR-3抗体和PCNA抗体进行免疫细胞化学染色,观察细胞的形态及其生长状况并绘制细胞生长曲线.用免疫细胞化学法和RT-PCR检测SV40Tag在转染细胞中的表达.[结果]转染后获得一个阳性细胞克隆,免疫细胞化学结果显示FGFR-3抗体染色阳性.SV40Tag抗体染色和RT-PCR结果显示SV40Tag已稳定转染入骨骺干细胞.转染细胞经扩大培养,命名为永生化骨骺干细胞.[结论]成功纯化大鼠骨骺干细胞并构建了SV40Tag永生化的骨骺干细胞株.     

猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠星形胶质细胞株的构建

目的 构建永生化大鼠星形胶质细胞，为转基因细胞移植镇痛提供细胞载体。方法 采用差速粘附法体外分离和培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞。利用脂质体将含有猿肾病毒40大T抗原(SV40Tag)基因的质粒pCMVSV40T／PUR转染培养的大鼠星形胶质细胞。经嘌呤霉素1．5μg／ml筛选后，挑选阳性细胞克隆扩大培养并连续传代。PCR、RT-PCR及免疫组化检测阳性细胞克隆中SV40Tag基因的整合情况及其表达，并对传代细胞的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)进行检测。结果 成功获得体外培养的大鼠星形胶质细胞，GFAP阳性表达；筛选获得阳性细胞克隆，连续传代培养近50代；PCR、RT-PCR产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳分析显示558bp处有一特异性扩增条带，与阳性对照条带相同，而未转染pCMVSV40T／PUR的细胞无扩增条带，回收片段经测序、比对与SV40Tag的基因序列一致(100％)；同时转染的阳性细胞克隆SV40Tag和GFAP免疫染色阳性。结论 成功地构建了SV40Tag基因永生化的大鼠星形胶质细胞株。     

转导人端粒酶逆转录酶基因致人骨髓间充质干细胞永生化并向软骨细胞诱导分化的研究

目的 建立永生化人骨髓间充质干细胞系并向软骨细胞诱导分化,以供软骨组织工程基础研究及临床应用.方法 原代培养人骨髓间充质干细胞(hMSC),用含有人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的逆转录病毒转染hMSC,G418筛选得到阳性克隆,体外连续培养,检测端粒酶的表达及活性.TGF-β1和地塞米松对转化后的hMSC-hTERT细胞诱导,使其向软骨细胞分化,并用原位杂交和免疫组化检测II型胶原.结果 外源性hTERT在转染细胞中稳定表达并传至第50代,永生化的hMSC细胞经TGF-β1和地塞米松诱导在体外分化为软骨细胞.结论 外源性hTERT基因可以有效地在体外使hMSC永生化,永生化的hMSC细胞经诱导可在体外分化为软骨细胞,从而作为软骨组织工程研究的细胞来源.     

破骨细胞转基因永生化问题的初步探讨

目的：通过转基因技术建立破骨细胞永生化细胞系，方法：经1，25（OH）2D3诱导，获得小鼠骨髓来源的破骨前体细胞，脂质体法（Fugene6）将猿猴病毒40（SV40）和绿色荧光蛋白（GFP）质粒分别转染入破抽前体细胞，G418筛选抗性克隆；同时将GFP转染入逆转录病毒包装细胞（P167）中，作为方法对照，继而，用含有GFP的逆转录病毒感染破骨前体细胞，G418筛选抗性克隆。结果：获得小鼠骨髓来源的破骨前体细胞，Fugene6转染SV40和GFP到破骨前体细胞后，G418筛选未获得阳性克隆，但GFP转染PT67细胞获得阳性克隆和含有GFP的逆转录病毒。将含有GFP的逆转录病毒感染破骨前体细胞，G418筛选未获得阳性克隆，结论：通过破骨细胞转基因永生化，建立破骨或破骨前体系细胞系的方法是一个非常有意义的研究课题，但是难度较大。可以初步认为：脂质体和逆转录病毒载体的方法不是破骨细胞转基因的最佳方法。     

基因转染脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞的研究

目的 观察人转化生长因子(hTGF)β2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞的定向分化能力,探讨脂肪间充质干细胞作为种子细胞和在基因增强的软骨组织工程中应用的可行性.方法 取3周龄Lewis大鼠的脂肪组织,消化法获得脂肪间充质干细胞,pcDNA 3.1(+)/hTGFD2通过脂质体介导转染脂肪间充质干细胞,用免疫化学染色、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测筛选的阳性克隆细胞中hTGFB2基因与软骨特异性蛋白-Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况;然后将基因转染的脂肪间充质干细胞与PLGA支架体外构建细胞-载体复合物,再将其植入裸鼠体内,12周后观察基因增强的组织工程软骨的形成情况.结果 从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪问充质干细胞,能大量稳定增殖传代.hTGFB2基因在脂肪间充质干细胞内能瞬时及稳定表达,并促使Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成;细胞.载体复合物在裸鼠体内经12周的培养,可以形成形态、结构接近正常软骨的组织工程软骨.结论 PODNA 3.1(+)/hTGFl32成功转染脂肪间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化,脂肪间充质干细胞可作为基因增强的软骨组织工程较理想的种子细胞.     

基于永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞的工程化软骨形成的实验研究

目的 :探讨hTERT转染的永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞 (MSCs)裸鼠体内形成软骨的能力。方法 :通过真核表达载体 ,把人端粒酶逆转录酶基因转入兔髁状突软骨细胞 ,筛选并挑选阳性克隆进行扩增培养 ;取兔骨髓 ,密度梯度离心和培养 ,经诱导、扩增后与支架材料 β 磷酸三钙 (β TCP)复合 ,构建细胞 β TCP复合体 ,体外培育 1～ 2d后 ,植入裸鼠体内。通过粘多糖 (GAG)含量和Ⅱ型胶原的表达来检测 3和 6个月复合体软骨形成情况。结果 :两种细胞和 β TCP复合体在裸鼠体内均能形成软骨样组织 ;6个月 ,工程化软骨GAG含量和Ⅱ型胶原的表达均低于正常软骨组织 ,但无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :hTERT转染的永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞均具有良好的软骨形成能力 ,在软骨组织工程修复软骨缺损方面具有重要的应用前景。     

SV40LT抗原基因逆转录病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的　构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并转染鼠肝细胞 ,检测SV 40LT抗原基因在肝细胞中的表达情况 ,为肝细胞移植研究打下基础。方法　利用体外基因重组技术构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并酶切、测序鉴定 ,脂质体介导转染PA3 17细胞 ,G 418抗性筛选阳性克隆 ,通过NIH 3T3细胞测定病毒滴度 ;分离、纯化大鼠肝细胞后 ,将含SV 40LT抗原基因的假病毒颗粒感染肝细胞 ,用PCR及免疫组化法检测转染肝细胞中SV40LT抗原基因的表达情况。结果　( 1)酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV 40LT抗原基因 ;( 2 )病毒滴度为 1.3× 10 6 cfu/ml ;( 3 )转染后的肝细胞含有SV40LT抗原基因 ,其表达在转染后 2 4h明显高于 96h(P <0 .0 5 )。结论　成功构建含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,转染后的肝细胞表达有目的基因 ,有望作为肝细胞体外培养的可用技术     

Immunological purification of rat precartilaginous stem cells and construction of the immortalized cell strain

Precartilaginous stem cells (PCSC) are adult stem cells that control limb growth of animals and can differentiate directionally. In a previous study, PCSC was reported to begin differentiating at the fifth passage; therefore, sufficient uni-phenotype PCSC cannot be harvested from primary cell culture. The purpose of this study was to examine whether simian virus 40 large T antigen gene (SV40Tag) could induce rat PCSC to immortalize. Immunomagnetic separation was used to isolate PCSC labeled with fibroblast growth factor receptor-3 (FGFR-3). Plasmid pCMVSV40T/PUR containing SV40Tag was transfected into PCSC by liposome transfection method. One anti-puromycin cell clone was obtained, which was confirmed as FGFR-3 positive, and expanded to immortalized cell strain. Results from RT-PCR and immunocytochemistry demonstrated that SV40Tag was highly expressed at both mRNA and protein levels after stable transfection. The cells transfected with SV40Tag were expanded to immortalized cell strain, which could maintain its characteristics for 30 passages, named immortalized precartilaginous stem cells (IPCSC). IPCSC were short fusiform or triangular cells with two or three short axons. Immunocytochemistry results of FGFR-3 and Collagen II demonstrated that IPCSC retained the characteristics of PCSC and the high proliferation capability of IPCSC was confirmed by methyl thiazolyl tetrazolium assay. Therefore, we concluded that rat precartilaginous stem cells were purified and immortalized precartilaginous stem cell strain was established. It may provide a stable cell resource for basic research and cell transplantation therapies.     

转化生长因子β1诱导永生化人前软骨干细胞向髓核样细胞分化的实验研究

  目的 研究转化生长因子β1 (TGF-β1) 诱导永生化人前软骨干细胞 (IPSCs) 向髓核样细胞分化的可行性。方法 将体外培养的IPSCs 接种于温敏型壳聚糖水凝胶 (C/GP) 三维支架上,加入含TGF-β1的诱导培养基,低氧条件下进行诱导培养,观察三维支架上IPSCs的生长及分化情况。7 d后行Alcian Blue染色,分析细胞外基质糖胺聚糖（GAG）合成情况,并收集细胞,提取RNA。RT-PCR检测诱导前后髓核样细胞标志基因Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）和蛋白聚糖（Aggrecan）的表达情况,Western Blot 检测诱导前后细胞内β-catenin蛋白表达水平的变化。结果 IPSCs在三维支架上生长状态良好,诱导7 d 后,Alcian Blue染色表明,细胞外基质GAG的合成明显增多,实验组（诱导培养基）明显多于对照组（普通培养基）。RT-PCR证实Ⅱ型胶原和Aggrecan的基因表达水平明显增高,实验组明显高于对照组;Western Blot证实细胞内β-catenin蛋白表达水平明显上调,实验组明显高于对照组。结论 IPSCs经TGF-β1诱导可在体外定向分化为髓核样细胞,诱导分化后的细胞具有良好的分泌功能,能够有效地分泌细胞外基质成分。TGF-β1可能通过上调细胞内β-catenin的表达诱导IPSCs向髓核样细胞分化。     

Cre/loxP-based reversible immortalization of human hepatocytes

An ideal alternative to the primary human hepatocytes for hepatocyte transplantation would be to use a clonal cell line that grows economically in culture and exhibits the characteristics of differentiated, nontransformed hepatocytes following transplantation. The purpose of the present studies was to establish a reversibly immortalized human hepatocyte cell line. Human hepatocytes were immortalized with a retroviral vector SSR#69 expressing simian virus 40 large T antigen (SV40Tag) gene flanked by a pair of loxP recombination targets. One of the resulting clones, NKNT-3, showed morphological characteristics of liver parenchymal cells and expressed the genes of differentiated liver functions. NKNT-3 cells offered unlimited availability. After an adenoviral delivery of Cre recombinase and subsequent differential selection, efficient removal of SV40Tag from NKNT-3 cells was performed. Here we represent that elimination of the retrovirally transferred SV40Tag gene can be excised by adenovirus-mediated site-specific recombination.     

Insertion of a suicide gene into an immortalized human hepatocyte cell line

For developing a bioartificial liver (BAL) device, an attractive alternative to the primary human hepatocytes would be the use of highly differentiated immortalized human hepatocytes with a safeguard. To test the feasibility, the primary human hepatocytes were immortalized by a plasmid SV3neo encoding simian virus 40 large T antigen (SV40Tag) gene. A highly differentiated hepatocyte line OUMS-29 was established. A suicide gene of herpes simplex virus-thymidine kinase (HSV-TK) was retrovirally introduced into OUMS-29 cells as a safeguard for clinical application. One of the resulting HSV-TK-positive cell lines, OUMS-29/tk, grew in chemically defined serum-free medium with the gene expression of differentiated liver functions. OUMS-29/tk cells were 100 times more sensitive to ganciclovir compared with unmodified OUMS-29 cells in in vitro experiments. We have established a tightly regulated immortalized human hepatocyte cell line. Essentially unlimited availability of OUMS-29/tk cells may be clinically useful for BAL therapy.     

新生大鼠骨骺前软骨干细胞培养及细胞库建立

目的　建立新生大鼠骨骺前软骨干细胞 (precartilagious stem cells,PSCs)库 ,为 PSCs作为组织工程种子细胞修复骨骺损伤的研究奠定基础。　方法　利用磁性细胞分选系统分离纯化有成纤维细胞生长因子受体 3(fibroblast growth factor receptor3,FGFR- 3)表面标志的骨骺 PSCs。将纯化后的 PSCs体外扩增至第 3代 ,采用液氮深低温保存细胞 ,应用 RT- PCR、免疫组织化学及免疫荧光等技术定期 (2、4周 )对复苏 PSCs行生物学特性鉴定。　结果　复苏后 PSCs存活率高 (>95 % ) ,细胞生长周期稍滞后。RT- PCR、免疫组织化学及免疫荧光检测均有较强的 FGFR- 3表达。经液氮冻存的 PSCs在细胞增殖、表型特征方面无显著变化 ,基本保持了原代 PSCs的生物学特性。　结论　成功建立了新生大鼠 PSCs细胞库 ,为应用组织工程技术修复骨骺损伤的研究提供良好的种子细胞。     

周期性单轴牵张力对前软骨干细胞增殖影响的实验研究

目的观察周期性单轴牵张力对前软骨干细胞增殖能力的影响。方法免疫磁珠分选新生大鼠前软骨干细胞(precartilaginous stem cells,PSCs),取生长良好的第三代PSCs,通过四点弯曲细胞加压装置对细胞加载不同的机械牵张力(2 000、4 000μstrain),并在不同时间点(1、2、4和8 h)收集细胞,采用流式细胞仪检测应力刺激后PSCs的细胞周期及增殖指数的变化,揭示不同的牵张力在不同的时间点对PSCs增殖活性的影响。结果周期性单轴牵张力能影响大鼠PSCs的增殖活性。2 000μstrain机械牵张力组与对照组相比,增殖指数升高(P<0.05),促进细胞增殖,并且S期DNA合成率增多(P<0.05);而4 000μstrain机械牵张力组与对照组比较,增殖指数降低,抑制细胞增殖(P<0.05),同时S期细胞DNA合成率减少(P<0.05)。结论适宜的机械牵张力能促进PSCs增殖,过大的机械牵张力反而抑制细胞增殖。     

人永生化胰腺星形细胞系的构建及其功能的验证

目的 构建人永生化胰腺星形细胞(PSCs)系并探讨其生物学功能.方法 采用outgrowth方法提取人原代胰腺星形细胞(hPSCs),慢病毒感染方法导入SV40LT基因和hTERT基因,嘌呤霉素筛选稳定高表达两个基因的细胞(im PSCs),qRT-PCR和Western bolt方法检测表达水平;CCK8法、核型分析...