氟致小鼠小胶质细胞的活化及氧化损伤的研究

目的观察氟诱导小胶质细胞(MG)活化及其所致氧化损伤情况,探讨氟致中枢神经损伤的机制。方法培养小鼠小胶质细胞(BV-2),按0、0.5、1、2、10、50、100mg/L的氟化钠浓度染毒,采用细胞免疫化学方法测定小胶质细胞标记物OX-42的阳性表达情况,了解BV-2细胞活化状态:同时检测BV-2细胞或培养液中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、过氧化氢(H2O2)和活性氧(ROS)含量。结果 5mg/L以上浓度氟化钠处理细胞24h后能够引起小胶质细胞的活化,OX-42表达的阳性细胞增加。50mg/L以上NaF染毒组细胞活力在氟处理24、48h后,显著降低,20mg/L以上NaF染毒组细胞活力在氟处理72h后显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。细胞染毒24h后,50、100mg/LNaF处理组细胞SOD活力显著低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);50mg/LNaF处理组细胞内的MDA含量显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);1、10、100mg/LNaF染毒组细胞内NOS和10、50、100mg/LNaF染毒组细胞培养液中NOS含量也显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论一定剂量的氟可激活MG,释放活性氧自由基,可能在氟所致的中枢神经系统损伤中起一定的作用。     

氟对小胶质细胞ROS和NO含量的影响

观察氟诱导活化后的小胶质细胞ROS和NO的生成状况,为进一步研究氟致中枢神经系统损伤机制提供实验依据。在细胞培养液中加入不同浓度(0、1、5、10、25、50μg/ml)的NaF,培养一定时间后检测小胶质细胞增殖活力、细胞内ROS及培养液NO含量。氟化钠能够增加细胞内ROS含量,50μg/ml NaF处理组,细胞内ROS含量与暴露时间正相关,1、5μg/ml NaF处理组,细胞内ROS含量与暴露时间负相关;BV-2细胞短时间暴露于氟化钠,细胞培养液NO含量与染氟剂量正相关,而随着暴露时间延长,细胞培养液NO含量随染氟剂量升高而降低;随着时间增加,每个NaF处理组NO含量均增加。小胶质细胞活化后导致细胞内ROS、培养液NO含量增加,且与时间、剂量相关。     

鱼藤素对小鼠小胶质细胞 BV-2影响的实验研究

目的：研究放射增敏剂鱼藤素对小鼠小胶质细胞BV-2的影响。方法 BV-2细胞以5×104／mL密度接种到细胞培养板中,加入8个不同浓度鱼藤素干预48 h后测定细胞增殖活力。在加入1×10-6 mol／L鱼藤素后6个时间点上测定细胞增殖活力。1×10-8 mol／L鱼藤素干预48 h,测定上清液中NO水平。结果5×104／mL BV-2细胞以含10％胎牛血清DMEM培养基培养,第48 h达到细胞生长曲线的峰值。在0～1×10-5 mol／L剂量范围内,1×10-6、1×10-5 mol／L鱼藤素干预48 h后BV-2细胞的增殖活力显著降低;1×10-6 mol／L鱼藤素加入后第24、48、72 h等3个时间点上BV-2细胞增殖活力明显降低。1×10-8 mol／L鱼藤素干预48 h后BV-2细胞上清液NO水平提高。结论鱼藤素在一定的浓度时激活小胶质细胞,更高浓度时将导致小胶质细胞损伤甚至死亡。     

电磁脉冲对BV-2细胞形态和分泌功能的影响及其机制探讨

目的 研究电磁脉冲( electromagnetic pulse,EMP)对小鼠BV-2小胶质细胞形态及分泌功能的影响,并初步探讨其作用机制.方法 离体培养的BV-2细胞经200 kV/m EMP辐照200次,分别在辐照后1、6、12、24h收集细胞培养上清及细胞.倒置显微镜下观察细胞形态变化,ELISA法检测培养上清中肿瘤坏死因子-α(TN F-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-10等细胞因子水平的变化,硝酸还原酶法检测培养上清中一氧化氮(NO)水平,DCFH-DA探针检测活性氧,免疫印迹(Western-blot)法检测细胞外信号调节激酶(ERK)、c -Jun氨基末端激酶(JNK)、p38磷酸化水平和蛋白表达量的变化.应用p38抑制剂( SB203580)预处理细胞后再进行EMP辐照,然后检测培养上清中NO水平和活性氧的生成.结果 EMP辐照后1、6和12h,部分小胶质细胞出现胞体变大、突触变粗变短,且活化细胞比例与假辐照组相比明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05);EMP辐照后细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-10等细胞因子水平未发生明显改变,但活性氧检测结果显示,与假辐照组(小胶质细胞平均荧光强度10.34)相比,EMP辐照后1h小胶质细胞荧光强度(平均荧光强度21.56)明显增加,6h达峰值(平均值为32.46),12h开始恢复(平均荧光强度24.36),差异均有统计学意义(P＜0.05),24h恢复至假辐照水平;EMP辐照后NO水平的变化与活性氧一致,辐照后1h开始增加,6h达峰值,12h开始恢复,24h恢复至假辐照组水平;蛋白杂交结果显示,EMP辐照后1、6h,p38的磷酸化水平和蛋白水平较假辐照组明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05),ERK和JNK无明显变化.应用p38抑制剂SB203580预处理细胞,明显抑制了EMP诱导的小胶质细胞对活性氧和NO的产生,活性氧水平除6h组未恢复至假辐照水平外,其他各组均恢复至假辐照水平,NO水平各组均恢复至假辐照组水平.结论 EMP辐照可活化小胶质细胞并且促进其对NO和活性氧的生成,p38信号通路参与了此过程.     

三氯乙烯对人角质形成细胞NO合成及细胞活力的影响

目的 研究三氯乙烯(TCE)对人角质形成细胞(KC)一氧化氮(NO)合成以及细胞活力的影响,探讨三氯乙烯引起皮肤细胞毒性的机制.方法 体外培养的人角质形成细胞以0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L浓度的TCE染毒4 h,另以诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂氨基胍(AG)100 μmol/L预处理细胞30 min后再行TCE处理,分别于染毒后12 h、24 h、48 h、72 h时检测细胞上清中NO的含量,MTT法观察细胞活力.结果 低剂量的TCE不引起NO含量改变(与溶剂对照比较,P>0.05),0.5、1.0、2.0 mmol/L浓度的TCE染毒组NO含量分别在染毒后的24 h、48 h和72 h开始升高(P<0.05),对应的细胞活力则相应下降(P<0.05);AG预处理的0.5、1.0和2.0 mmol/L TCE染毒组在处理48 h后NO含量开始下降(与对应的TCE染毒组比较,P<0.05),且回复到正常溶剂对照水平(P>0.05),其所对应的细胞活力逐步回升(与对应的TCE染毒组比较,P<0.05).结论 TCE以剂量和时间依赖方式诱导人KC产生NO,而过量的NO可能介导了TCE的KC细胞毒性.     

微波诱导小胶质细胞的促炎症反应

目的 探讨微波与小胶质细胞促炎症反应之间的关系,揭示小胶质细胞在微波致中枢神经损伤中的作用.方法 离体培养的N9小胶质细胞接受90 mW/cm2微波辐照,在辐照后0、1、3、6、12、24 h采用细胞流式计数的方法观察CD11b的表达情况,用酶联免疫吸附(EUSA)方法检测N9细胞培养上清液中TNF-α的浓度,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测N9小胶质细胞一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达,采用硝酸还原酶法检测培养上清液中NO含量.结果 微波辐照后3 h阳性表达CD11b的小胶质细胞明显增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),一直持续到辐照后24 h,并在辐照后6 h达到高峰.TNF-α含量在辐射后1 h明显升高[(657.8±25.9)pg/ml],并一直持续到24 h,在辐照后3 h达到峰值[(762.1±61.5)pg/ml],与对照组[(258.9±81.7)pg/ml]比较,差异有统计学意义(P<0.01.NO的含量在辐照后1 h开始升高(4.48±0.59) μmol/L].与对照组[(2.65±0.14) μmol/L]的差异有统计学意义(P<0.05),并随时间的延长逐渐增加.iNOS mRNA表达在辐照后1 h开始明显升高,6 h升高约2倍,此后表达有所下降,但24 h内均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论 微波辐照可明显诱导小胶质细胞活化,活化的小胶质细胞可通过分泌大量TNF-α,释放NO等产生促炎症反应.     

X射线对小胶质细胞M1和M2型极化的影响

目的 探讨X射线对小鼠小胶质BV-2细胞极化的影响.方法 取对数生长期BV-2细胞随机分为假照射组(Sham)和10 Gy照射组,后者给予X射线单次照射,剂量为1.28 Gy/min,照射时间7 min 49 s.于照射后1、3、6、24h和48 h,光镜下观察并分析BV-2细胞活化率;HE染色及Iba-1免疫荧光染色...     

亚砷酸钠对HaCat细胞活力及磷酸化蛋白激酶B表达的影响

为探讨亚砷酸钠(NaAsO2)对人角质形成细胞(HaCat)活力及蛋白激酶B(PKB/Akt)磷酸化活化的影响,本研究以Alamar Blue还原法检测NaAsO2(0,5,10,25,50,100μmol/L)作用于HaCat细胞6 h后细胞的活力水平;并以Western blot法检测NaAsO2(0,25,50μmol/L)作用于HaCat细胞6 h后细胞中磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的蛋白表达情况。结果表明,NaAsO2作用6 h,Alamar Blue还原率随NaAsO2染毒剂量的升高而显著下降,具有显著的剂量-效应关系;NaAsO2染毒组细胞内p-Akt表达水平与对照组相比均显著提高,提示砷性肿瘤的发生可能与p-Akt蛋白表达水平增高有关。     

米诺环素下调环氧化酶-2抑制砷诱导小胶质细胞活化的实验研究

目的 探讨米诺环素对砷诱导的小胶质细胞活化和环氧化酶-2（COX-2）表达的影响及可能机制。方法 本实验设置4组:对照组、10μmol/L NaAsO2组、10μmol/L米诺环素组和10μmol/L NaAsO2+10μmol/L米诺环素组,各组BV-2小胶质细胞贴壁生长至对数期后,进行24h染毒处理,然后从形态学观察,ELISA法检测干扰素-γ（INF-γ）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌,Realtime-PCR分析COX-2 mRNA表达,Western blotting分析COX-2蛋白表达四个方面展开研究。结果 形态学观察发现,与对照组相比,各染毒处理组BV-2小胶质细胞均受到不同程度的激活,而与NaAsO2组相比,NaAsO2+米诺环素组细胞激活状态受到一定抑制。ELISA法检测结果显示:各组INF-γ（F=20.165）、IL-1β（F=10.688）、IL-6（F=11.488）和TNF-α（F=11.641）分泌差异均具有统计学意义（P均<0.001）;与NaAsO2组相比,NaAsO2+米诺环素组细胞培养液上清IL-1β、IL-6和TNF-α分泌减少,INF-γ分泌增高（P均<0.05）,米诺环素对砷染毒处理的炎性细胞因子分泌有逆向改变作用。Realtime-PCR检测结果显示:各组COX-2 mRNA表达差异具有统计学意义（F=266.427,P<0.001）;与NaAsO2组相比,米诺环素下调砷染毒处理的COX-2 mRNA表达（P<0.001）。Western blotting光带经分析后,各组COX-2蛋白表达差异具有统计学意义（F=74.785,P<0.001）;与NaAsO2组相比,米诺环素减弱砷染毒处理的COX-2蛋白表达（P<0.001）。结论 下调COX-2表达可能是米诺环素抑制砷诱导小胶质细胞活化机制的重要环节。     

细胞内谷胱甘肽对砷细胞毒性的保护作用

目的研究细胞内谷胱甘肽(GSH)对砷致人永生化角质形成细胞系(HaCaT)毒性的保护作用.方法HaCaT细胞用N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)和丁硫氨酸亚矾胺(L-buthionine-[S'R]-sulfoximine,BSO)预处理后,加入亚砷酸钠(sodium arsenite,NaAsO2)继续作用,用Alamarblue摄入法检测细胞活力,每组4个复孔.结果单独用NaAsO2作用细胞24h后,0.001～10.000 μmol/L组Alamarblue还原率增高(P＜0.05),大于10.000μmol/L时Alamar blue还原率下降(P＜0.01);用NAC预处理24h后再加入NaAsO2,15 μmol/L组Alamarblue还原率比NaAsO2单独作用增加(P＜0.05);用BSO预处理24 h后再加入NaAsO2,15 μmol/L组的Alamarblue还原率均下降(P＜0.05).结论低浓度NaAsO2刺激细胞增殖,高浓度具有细胞毒性;NAC可减轻砷的细胞毒性,而BSO则加重其细胞毒性.