转化生长因子β1联合骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞的分化

背景:国内外许多学者成功利用转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化报道较多,而对骨形态发生蛋白2作为诱导因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的报道较少.目的:观察验证转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞下向软骨细胞表型转化的可能性及相互作用.方法:取健康Wistar大鼠骨髓,采用贴壁法筛选获得骨髓间充质干细胞.按添加生长因子的不同分为4组:转化生长因子β1+骨形态发生蛋白2组,转化生长因子β1组,骨形态发生蛋白2组,对照组不添加任何生长因子.于诱导14 d后,分别进行阿利新蓝染色和二甲基亚甲蓝比色法定性定量检测糖胺聚糖的分泌表达,免疫组织化学法检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达.结果与结论:3个加入细胞因子的实验组在阿利新蓝染色和软骨特异性Ⅱ型胶原疫组化法检测中均有不同程度的阳性表达,糖胺聚糖的定量检测中,转化生长因子β1+骨形态发生蛋白2联合应用组的糖胺聚糖含量明显高于其他组(P<0.05).结果提示转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2联合作用更能促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化,分泌软骨特异性基质,有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源.     

淫羊藿苷促进羊骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化

背景:寻找一种简单有效、安全价廉且可替代生长因子的生物活性物质,是骨组织工程的客观要求,中药来源的植物黄酮淫羊藿苷可通过提高成骨细胞功能促进成骨,但是对骨髓间充质干细胞的作用尚未明确.目的:探讨淫羊藿苷对羊骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-09/2009-02在南方医院创伤骨科实验室完成.材料:清洁级成年雄性中国青山羊3只,由南方医院实验动物中心提供.淫羊藿苷标准品由中国药品生物制品检定所提供,批号110737-200312,纯度98.3%.方法:体外分离培养羊骨髓间充质干细胞,传至第3代后,按2×103/孔接种至96孔板,分别加入100,10,1,0.1μmol/L淫羊藿苷培养基150μL进行培养;设立对照组,仅加入等量普通DMSO培养基.主要观察指标:采用MTT法检测细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,通过碱性磷酸酶试剂盒测定细胞碱性磷酸酶活性,放免法检测细胞骨钙素表达,茜素红染色观察钙化结节形成能力.结果:0.1 μ mol/L淫羊藿苷可明显促进羊骨髓间充质干细胞增殖,增加S期和G2/M期细胞数量:随着淫羊藿苷浓度的增加,促细胞增殖活性降低,100 μmol/L淫羊藿苷表现为明显的抑制细胞增殖作用.淫羊藿苷呈剂量依赖性促进羊骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素表达.10,100 μ mol/L淫羊藿苷诱导钙化结节形成能力优于0.1和1μmol/L淫羊藿苷,对照组羊骨髓间充质干细胞未形成钙化结节.结论:淫羊藿苷对羊骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化具有促进作用,可被视为一种良好的骨诱导活性因子.     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达

背景：有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道。目的：观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。方法：取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1d后将细胞分为两组：对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原。RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;诱导7d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14时骨钙素免疫细胞化学染色、21d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义（P〈0.05）,第7天,两者表达最强。说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞。其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用。     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达☆

背景:有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道. 目的:观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达. 方法:取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1 d后将细胞分为两组:对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原.RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达. 结果与结论:兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异(P<0.05);诱导7 d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14时骨钙素免疫细胞化学染色、21 d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义(P<0.05),第7天,两者表达最强.说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞.其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用.     

碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用，能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨，并最终导致新骨生成；碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质于细胞的软骨与骨的分化。目的：观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响，以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计：随机对照实验。单位：解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料：培养的兔骨髓间充质干细胞。方法：实验于2004-06／12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子（100μg／L人重组骨形态发生蛋白2，100μg／L碱性成纤维生长因子，100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子）和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法，碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节Von Kossa染色观察。主要观察指标：通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果：①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化，特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖，与对照组相比，细胞增值率提高近100％；虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响，但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论：碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子，两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成，可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞成骨分化中转化生长因子受体的表达

背景:机体受创后尤其是骨折发生后,骨髓间充质干细胞将启动成骨分化,其表面多种生长因子如碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、骨形态发生蛋白的受体表达将发生变化.目的:观察骨折损伤后不同时相骨髓间充质干细胞表面转化生长因子受体的表达变化.设计、时间及地点:对照观察实验,于2002-02/2003-11在解放军第三军医大学预防医学院复合伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.材料:选用健康成年兔,建立成兔桡骨骨折模型.方法:在造模当日及造模后1,5,10,15,20d抽取实验兔骨髓液,取骨髓有核细胞,纯化间充质干细胞,成骨分化培养基诱导培养.主要观察指标:通过Western-blot法检测转化生长因子β1,β2受体在间充质干细胞上的表达.结果:造模后1 d转化生长因子β1受体表达与造模当日比较无明显差异(P>0.05):造模后5d,其表达显著高于造模当日(P<0.05);造模后10d与5d比较无明显差异(P>0.05),但显著高于造模当日(P<0.05);造模后15,20d的转化生长因子β1受体表达显著高丁造模当日及造模后5,10d(P<0.01).造模后1,5d转化生长因子β2受体表达与造模当日无明显差异(P>0.05):造模后10,15d,其表达显著高于造模当日(P<0.05);造模后20d转化生长因子β2受体的表达显著高于造模当日及造模1,5,10,15d(P<0.01).结论:创伤后体内骨髓间充质干细胞成骨分化过程中转化生长因子β1,β2受体的表达呈现逐渐增高的趋势.     

骨形态发生蛋白2和音猬因子体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景:研究表明,骨形态发生蛋白2和音猬因子联合诱导干细胞的定向分化存在理论上的可能性,但目前联合诱导间充质干细胞的方向纷繁复杂,且众说纷纭.目的:观察骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外联合和单独应用促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-12在江苏大学临床医学院实验室完成.材料:6周龄SPF级SD大鼠10只,体质量140～160 g,雌雄不拘,用于间充质干细胞的获得、培养和传代.重组人骨形态发生蛋白2、音猬因子为PeproTech公司产品.方法:将SD大鼠的间充质干细胞分离培养后分为4组:重组人骨形态发生蛋白2组:加入100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2:音猬因子组:加入20 μg/L音猬因子:联合组:100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2联合20 μg/L音猬因子作用于SD大鼠间充质干细胞:对照组:不加任何干预措施.主要观察指标:倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化;MTT法检测细胞培养第3,6,9,12天细胞增殖数和细胞碱性磷酸酶活性;以及成骨细胞表型的检测和Ⅰ型胶原蛋白免疫印迹分析,以比较各组诱导成骨能力的差异.结果:①间充质干细胞培养24 h后部分贴壁,贴壁细胞呈圆形或椭圆形,第7天左右细胞铺满瓶底,多为梭形.条件培养基培养3 d后,联合组细胞由长梭形转变为多角形.随后重组人骨形态发生蛋白2组细胞发生成骨样改变,音猬因子组细胞未见明显形态学改变.②相同时间点联合组、重组人骨形态发生蛋白2组、音猬因子组细胞吸光度均高于对照组(P<0.05).联合组和重组人骨形态发生蛋白2组在各时间点碱性磷酸酶表达量均高于音猬因子组和对照组(P<0.05).③间充质干细胞经诱导培养7 d后,碱性磷酸酶细胞化学染色联合组和重组人骨形态发生蛋白2组呈阳性,联合组可见胞质中棕黄色颗粒,音猬因子组和对照组阴性.诱导培养14 d后,Ⅰ型胶原免疫荧光染色音猬因子组和对照组均为阴性,联合组和重组入骨形态发生蛋白2组为阳性,但联合组细胞数量明显增多,细胞间融合较好,重组人骨形态发生蛋白2组细胞融合欠佳.矿化沉积茜素红染色音猬因子组和对照组仍为阴性,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性,联合组细胞间可见红色的钙结节.④蛋白免疫印迹分析显示,与对照组相比,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组Ⅰ型胶原蛋白表达增加,联合组尤其明显,音猬因子组与之接近.结论:骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外能明显促进间充质干细胞向成骨细胞分化并且具有明显的协同相关性.     

转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化

背景:转化生长因子β1是关节软骨组织工程研究的首选生长因子,适当浓度能刺激关节软骨细胞增殖、分裂和分化.目的:建立含有转化生长因子β1的特殊诱导体系培养条件下骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的能力,观察诱导后的细胞形态及表型变化.方法:于兔胫骨结节内侧抽取骨髓,采用贴壁培养法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞行流式细胞仪检测鉴定其表面抗原,以含有转化生长因子β1的特殊软骨诱导体系的培养条件下对第3代骨髓间充质干细胞诱导培养21 d,诱导后与人鼻中隔软骨细胞进行比较.采用免疫组织化学法对Ⅱ型胶原进行定性检测.结果与结论:贴壁培养法可分离并纯化兔骨髓间充质干细胞,所得第3代骨髓间充质干细胞表面抗原CD44 阳性,CD34、CD45 阴性.经诱导培养21 d后细胞形态变为不规则,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示可见阳性细胞.提示含有转化生长因子β1的特殊软骨诱导体系的培养条件下,骨髓间充质干细胞可以转化为软骨细胞,且与正常软骨细胞无明显差异.     

转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞*

背景：骨形态发生蛋白2及转化生长因子β是骨再生中重要的因子,提高其表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。目的：构建携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体,观察其在骨髓间充质干细胞中的表达情况。方法：应用重组慢病毒技术构建同时携带转化生长因子β3、骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒表达载体,并用其转染体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞,以转染携带转化生长因子β3或骨形态发生蛋白2单一基因的慢病毒或单独慢病毒的骨髓间充质干细胞作为对照。转染后1周分别提取各组细胞的总RNA 和蛋白进行检测。结果与结论：荧光显微镜下见转染转化生长因子β3和(或)骨形态发生蛋白2基因3 d 的骨髓间充质干细胞发绿色荧光,转染效率达90%以上。RT-PCR 和 Western blot 结果显示,转染转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2 mRNA 和蛋白的表达均高于单一基因转染组及空白对照组。可见应用慢病毒可成功将转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因转染至骨髓间充质干细胞并实现其高效表达,且两种基因具有协同促表达作用。     

骨形态发生蛋白2体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:目前研究者尝试使用各种细胞因子、中药单体和组织裂解液等诱导剂作用于其分化过程,用以修复梗死的心肌组织。目的:探索骨形态发生蛋白2在大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞过程中的作用。方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。应用含有骨形态发生蛋白2的培养基定向诱导培养(对照组为普通培养基培养)72h,其后换用普通培养基继续培养4周。结果与结论:初分离的细胞经纯化培养后,显示CD29阳性、CD34阴性,符合骨髓间充质干细胞的特征,生长曲线显示各代细胞生长规律相近。经骨形态发生蛋白2体外诱导培养后,细胞形态狭长,排列紧密、方向一致。分化后的细胞均阳性表达C-TnI、C-TnT、desmin、α-sarcomericactin和P38MAPK。空白对照组则基本不表达以上蛋白。提示骨形态发生蛋白2可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌样细胞,是骨髓间充质干细胞体外心肌分化的一种新的有效诱导剂。     

工频电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1 mRNA表达的刺激

背景:研究证实电磁场刺激能够促进多种骨生长因子的合成与分泌,而某些生长因子具有诱导骨髓间充质干细胞定向分化成骨的作用。目的:分析工频电磁场对体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1mRNA表达的影响。设计:单一样本、区组设计,观察对比动物实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科。材料:实验于2005-02/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科实验室完成。①选取清洁级昆明种小鼠20只,作为实验用骨髓间充质干细胞的来源。②电磁场发生器由武汉市海军工程大学研制,能生成场强为0～100mT的连续可调的50Hz正弦波电磁场。③引物均由北京赛百胜生物工程公司合成。方法:①小鼠以颈椎脱臼法处死,取双侧股骨和胫骨,体外分离培养骨髓间充质干细胞,取第2代细胞用于实验。②不同强度电磁场刺激实验:设立阴性对照组、阳性对照组、电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组、阳性对照组均不给予电磁场刺激,但阳性对照组于传代时加入含成骨性诱导剂(含10-8mol/L地塞米松,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,50mg/LVitaminC)的培养基;电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组在细胞贴壁后分别于0.4,0.8,1.6mT场强中进行电磁场刺激,每天均连续刺激1h,5d后进行指标检测。③相同场强不同作用时间电磁场刺激实验:设立阴性对照组、电磁场1.6mT刺激15,30,60min组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组不进行电磁场刺激;电磁场1.6mT刺激15,30,60min组在1.6mT场强条件下每天分别给予15,30,60min的连续电磁场刺激,5d后进行指标检测。④RT-PCR技术检测各组细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。主要观察指标:①不同强度电磁场刺激对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。②相同场强不同作用时间电磁场刺激小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。结果:①电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,阳性对照组及电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2mRNA的表达达到最大值(57.74±0.23)%,电磁场0.4mT刺激组转化生长因子β1mRNA的表达达到最大值(126.20±0.21)%。②电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,电磁场1.6mT刺激15,30,60min组骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激60min组两种因子mRNA的表达分别达到最大值(28.06±0.11)%和(75.20±0.16)%。结论:适当强度及作用时间的工频电磁场刺激,能够明显促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。     

腺病毒介导人转化生长因子β2基因转染诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

背景:前人的工作已证实转化生长因子β1能促进骨髓间充质细胞的增殖,诱导其向软骨细胞分化.目的:进一步验证人转化生长因子β2(human transforming growth factor-β2,hTGFβ2)基因转染诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化作用.方法:取清洁级3周龄雄性Lewis大鼠16只,用于分离培养骨髓间充质干细胞.通过腺病毒重组载体Ad-hTGFβ2将外源性hTGFβ2基因转染到体外培养的第2代大鼠骨髓间充质干细胞中,48 h后采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测转染细胞中目的基因与软骨特异性蛋白--Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况.结果与结论:从成体大鼠骨髓组织中培养出骨髓间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代.Ad-hTGFβ2转染骨髓间充质干细胞获得稳定表达,免疫组织化学染色和Western blotting检测到基因转染细胞中Ⅱ型胶原蛋白的合成表达,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和蛋白多糖aggrecan mRNA的表达.结果提示,从骨髓组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代;Ad-hTGFβ2成功转染骨髓间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化.     

转化生长因子β1对骨髓干细胞分化类髓核细胞的影响

背景：转化生长因子β1是骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的首选生长因子,适当浓度能诱导骨髓间充质干细胞的增殖和分化。目的：观察不同质量浓度转化生长因子β1对大鼠骨髓间充质干细胞体外向类髓核细胞分化的影响,优化骨髓间充质干细胞体外培养条件。方法：取成年大鼠股骨骨髓,体外培养、纯化。取第3代成年大鼠骨髓间充质干细胞,实验组用加入不同质量浓度转化生长因子β1（0,1,10,20μg/L）的HG-DMEM无血清培养液诱导3,7,14,21d;对照组普通状态下用含体积分数为10%胎牛血清的HG-DMEM培养液自然分化。结果与结论：10μg/L转化生长因子β1诱导液诱导的骨髓间充质干细胞蛋白聚糖与Ⅱ型胶原蛋白水平明显高于其他实验组和对照组（P〈0.01）。各实验组14d时蛋白聚糖的表达均较3,7,21d时高（P〈0.01）。对照组各时间点蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原表达均呈阴性。提示10μg/L的转化生长因子β1能提高大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化类髓核的数量,从而使骨髓间充质干细胞发挥更高的治疗效率。     

转化生长因子β1对骨髓干细胞分化类髓核细胞的影响

背景:转化生长因子β1是骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的首选生长因子,适当浓度能诱导骨髓间充质干细胞的增殖和分化。目的:观察不同质量浓度转化生长因子β1对大鼠骨髓间充质干细胞体外向类髓核细胞分化的影响,优化骨髓间充质干细胞体外培养条件。方法:取成年大鼠股骨骨髓,体外培养、纯化。取第3代成年大鼠骨髓间充质干细胞,实验组用加入不同质量浓度转化生长因子β1(0,1,10,20μg/L)的HG-DMEM无血清培养液诱导3,7,14,21d;对照组普通状态下用含体积分数为10%胎牛血清的HG-DMEM培养液自然分化。结果与结论:10μg/L转化生长因子β1诱导液诱导的骨髓间充质干细胞蛋白聚糖与Ⅱ型胶原蛋白水平明显高于其他实验组和对照组(P<0.01)。各实验组14d时蛋白聚糖的表达均较3,7,21d时高(P<0.01)。对照组各时间点蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原表达均呈阴性。提示10μg/L的转化生长因子β1能提高大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化类髓核的数量,从而使骨髓间充质干细胞发挥更高的治疗效率。     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景:目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化.方法:抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10<'-8> mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录一聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定.结果与结论:经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%.提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞己具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据.     

转化生长因子β1基因转染鼠脂肪间充质干细胞的可行性

背景:脂肪间充质干细胞在转化生长因子β_1等生长因子的调控下可被诱导分化为软骨细胞.然而,外源性转化生长因子β_1存在引起趋化性、激发炎症反应、造成局部损伤、有效成分容易被稀释或丢失、半衰期短、缺少理想的转运蛋白等缺陷.因此,利用基因重组技术,使种子细胞表达转化生长因子β_1,对软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义.目的:探讨真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒的构建方法,并观察其转染脂肪间充质干细胞的可行性.方法:利用基因重组技术,将大鼠转化生长因子β_1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接,并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒,采用XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定;将已经纯化的pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂LipofectamineTM2000转染脂肪间充质干细胞,经G418抗性筛选后扩大培养,同时用pcDNA3.1-绿色荧光蛋白观察转染效率.结果与结论:重组质粒经XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切后出现1.35 bp和5.4 kb 2条带,测序结果显示重组质粒所包含的转化生长因子β_1全长碱基序列完全正确,绿色荧光蛋白显示其转染脂肪干细胞的转染效率> 80%,且转染细胞后有转化生长因子β_1 mRNA和蛋白的表达上调.提示利用基因重组技术可成功构建能转染脂肪间充质干细胞的真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒.     

人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景：骨形态发生蛋白质是目前发现惟一的一类具有成骨能力的细胞因子，它能刺激基质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞方向分化。目的：应用基因工程方法，观察人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向分化。设计：单一样本观察。 单位：中山大学附属第一医院骨科。材料：pcDNA1．1／AMP-hBMP7质粒。 方法：实验于2004-05／2005-03在中山大学附属第一医院外科实验室完成。全骨髓培养法培养兔骨髓基质干细胞，在体外分别转染poD．NA1．1／AMP-hBMP7和pcDNA1．1／AMP并留置空白对照。检测转染基因的转录和表达，观察细胞形态和生长情况，通过对感染细胞的碱性磷酸酶染色、钙盐染色、电镜观察胞质中钙质成分以及检测骨钙素鉴定其成骨分化表型。 主要观察指标：①兔骨髓基质干细胞的形态及生长。②表达产物的鉴定。③碱性磷酸酶染色（钙钴法）结果。④茜素红染色结果。⑤透射电镜观察结果。⑥扫描电镜观察结果。⑦骨钙素的测定结果。 结果：人骨形态发生蛋白质7基因存在于转染后的骨髓基质干细胞中并表达相应的mRNA。目的基因表达后的细胞形态略有变化，但生长曲线与未转染组无明显变化。骨钙素表达较未转染组明显增强。转染组细胞的碱性磷酸酶染色和钙盐染色均为阳性。 结论：人骨形态发生蛋白质7基因转染可促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞表型分化。     

人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景骨形态发生蛋白质是目前发现惟一的一类具有成骨能力的细胞因子,它能刺激基质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞方向分化.目的应用基因工程方法,观察人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向分化.设计单一样本观察.单位中山大学附属第一医院骨科. 材料pcDNA1.1/AMP-hBMP7质粒.方法实验于2004-05/2005-03在中山大学附属第一医院外科实验室完成.全骨髓培养法培养兔骨髓基质干细胞,在体外分别转染pcD-NA1.1/AMP-hBMP7和pcDNA1.1/AMP并留置空白对照.检测转染基因的转录和表达,观察细胞形态和生长情况,通过对感染细胞的碱性磷酸酶染色、钙盐染色、电镜观察胞质中钙质成分以及检测骨钙素鉴定其成骨分化表型.主要观察指标①兔骨髓基质干细胞的形态及生长.②表达产物的鉴定.③碱性磷酸酶染色(钙钴法)结果.④茜素红染色结果.⑤透射电镜观察结果.⑥扫描电镜观察结果.⑦骨钙素的测定结果.结果人骨形态发生蛋白质7基因存在于转染后的骨髓基质干细胞中并表达相应的mRNA.目的基因表达后的细胞形态略有变化,但生长曲线与未转染组无明显变化.骨钙素表达较未转染组明显增强.转染组细胞的碱性磷酸酶染色和钙盐染色均为阳性.结论人骨形态发生蛋白质7基因转染可促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞表型分化.