限制片段差异显示PCR分析金属基质蛋白酶家族在乳腺癌表达的差异

目的：建立乳腺癌差异表达谱,以筛选乳腺癌相关候选基因;比较金属基质蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)在乳腺癌中的表达差异。方法：采集乳腺癌组织、转移淋巴结及正常乳腺组织,用限制片段差异显示PCR技术(Restriction fragments differential display PCR,RFDD-PCR)建立表达谱。以电泳和荧光扫描成像对表达谱片段进行分离、显示。筛选分析MMPs及其相关基因的表达差异。结果：共获得5407个基因片段,差异片段占30％以上;共显示13个MMPs基因及其相关基因金属蛋白酶组织抑制因子和转化生长因子β。其中除MMP20外,其余均有量或质的差异。结论：有多个MMPs基因参与了乳腺癌的发生、发展过程,其中MMP2、MMP10、MMP11、MMP14、MMP15、MMP28基因的开启可能为肿瘤进程的早期事件。     

差异显示逆转录PCR技术及其应用和进展

差异显示逆转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）技术是一种筛选和克隆差异表达基因的新方法。该方法利用ｃＤＮＡ逆转录技术、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）的高效扩增和凝胶电泳分离技术，能同时显示多种来自相关细胞的ｍＲＮＡ样品。可用于多种研究目的，如鉴别和观察基因表达的改变；差异表达基因的迅速测序并与基因库比较；单个的差异表达基因片段能迅速克隆并制成探针从ｃＤＮＡ文库或基因组文库中分离基因等。ＤＤＲＴ－ＰＣＲ技术具有迅速、简便、灵敏和高效等优点，已被广泛地应用于癌症、心脏疾病、细胞分化、衰老及其它领域的研究中，并且在应用中被不断地改进和发展而更趋合理和完善。     

变异链球菌临床株乳酸脱氢酶mRNA水平的表达研究

目的 分析来自不同龋敏感人群变异链球菌不同基因型乳酸脱氢酶（LDH）的基因表达差异,探讨mRNA水平上基因表达与蛋白生物学功能及细菌致龋性的关系.方法 应用半定量RT-PCR两步法和凝胶成像系统定量软件分析,分别对20株来自不同基因型的LDH进行基因表达水平差异的评价和比较.结果 两种不同基因型LDH的mRNA表达水平不同（P＜0.05）,表现为低酶活性的B基因型1dh表达高;高龋和无龋菌株1dh表达的差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 变异链球菌乳酸脱氢酶基因表达水平具有遗传异质性,产酸因子1dh基因表达高低与龋病活跃性不呈正相关关系.     

限制片段差异显示聚合酶链反应建立人类疾病表达谱的研究

目的 用限制片段差异显示聚合酶链反应(restriclion fragment differential display-polymerase chain reaction，RFDD-PCR)技术建立基因表达谱，分析比较人类疾病表达谱差异的可行性。方法 采集乳腺癌根治术患者的乳腺癌组织、乳腺癌转移淋巴结及正常乳腺组织，用RFDD-PCR技术平行操作，获得3种组织全部转录物组片段。然后以7％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表达差异基因片段的分离、显示，结合http：//www．Qbiogene．com／display／数据库资料，进行生物信息学分析，初步筛选各组织问有表达差异的基因。结果 建立了乳腺癌组织、乳腺癌转移淋巴结及正常乳腺组织的基因表达谱，获得基因片段5407个，其中在癌组织和正常组织问有表达差异的片段为1491个，癌组织与转移淋巴结问的差异片段有1176个，而转移淋巴结与正常组织问的差异片段为1462个，分别占表达数的40．9％，33．9％，39．6％。这些差异片段涉及细胞增殖分化，信号转导，炎性反应，肿瘤转移等多方面功能。结论RFDD-PCR技术可以检测出大量表达基因，并同时比较3种或3种以上样本的表达差异，适用于人类疾病差异表达谱分析，筛选出疾病的候选基因。同时，还有可能找到新基因或新表达序列标签。     

涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞系基因表达谱及基质金属蛋白酶表达差异

目的筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的候选基因，并对其中的候选基因进行初步的验证。方法用限制片段差异显示PCR技术（restriction fragments differential display PCR, RFDD-PCR）建立涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞株（ACC-M、ACC-2）的表达谱。对两个表达谱的片段进行比较，通过生物信息学的分析，初步筛选出候选基因。用半定量逆转录PCR技术对筛选出的基因进行初步验证。结果RFDD-PCR方法共获得5420个基因片段，其中包含12个基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）基因。半定量逆转录PCR方法发现MMP2、MMP7、MMP9、MMP14、MMP15、MMP24在ACC-M和ACC-2中的表达存在明显差异。结论构建了ACC-M和ACC-2细胞株的表达谱，为寻找目的基因奠定了基础。发现MMP2、MMP7、MMP9和MMP15与涎腺腺样囊性癌的发生、发展、转移有关，不同肿瘤细胞的转移能力可能与不同的MMPs家族基因相关。     

限制性酶切片段差异显示技术搜寻和克隆肝癌相关基因

目的:筛选新的肝癌相关基因并对其作用进行研究，探讨肝癌的发生机制，从而对肝癌的早期诊断和治疗提供新的思路。 方法:应用限制性酶切片段差异显示技术对比研究手术切除的新鲜的原发性肝细胞癌组织及其周围相对正常的肝组织，通过放射自显影显示结果并筛选差异条带。对差异表达基因序列进行克隆、测序和GenBank同源性比对，进一步分析差异表达的基因片段。 结果:筛选出18条表达有差异的条带，其中肝癌组织表达上调的基因有16条，肝癌组织低表达或缺失，正常组织高表达的基因有2条。二次PCR扩增出3条差异条带，进行克隆、鉴定和测序，并进行同源性比较。其中1条基因与已知基因无明显同源性，可能为新的基因；1条基因序列与编码人类核糖体蛋白基因的cDNA同源性较高（86%）；另有1条基因序列与编码P选择蛋白的基因高度同源（98%）。 结论:共克隆鉴定了3条肝癌相关基因，并初步探讨其功能，为进一步探讨肝癌的发生机理提供了理论依据。     

mRNA差异显示技术对环境诱发系统性红斑狼疮基因表达谱改变的研究

目的 比较环境因素诱发系统性红斑狼疮患者(SLE)与健康人外周血单个核细胞基因表达水平的差异.方法 选择5例无家族发病案例的SLE患者与5例健康人外周血单个核细胞,提取总RNA进行扩增、Cy3染色后,与Agilcnt 4X44K人全基因组芯片杂交,筛选差异表达基因进行基因实体(GO)分析和信息通路(pathway)分析.以qRT-PCR验证芯片结果.结果 5例SLE患者共同有2435个相对于健康人的差异基因表达(判断值=2.0).GO分析结果表明,生物过程中差异表达基因占32.08%(512/1596),其他比例较高的有细胞过程、生物调控、细胞代谢等;分子功能中差异表达基因占34.09%(544/1596),其较高比例依次为结合、催化活性、传感活性和转录调节活性;细胞组分方面差异表达基因33.83%(540/1596),主要涉及细胞与细胞部分两方面,其次为细胞器.Pathway分析显示免疫系统信号及B细胞受体通道中各有12个基因的表达发生了差异性改变,而T细胞受体、表皮生长因子受体1、IL-12介导的信号等通道均有10个基因表达明显差异.分析发现SLE患者在炎性反应与自身免疫相关基因方面有45个基因发生明显改变,其中11个上调,34个下调;细胞外基质和黏附分子方面有5个相关基因改变其中5个上调,1个下凋.qRT-PCR结果与芯片结果比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 5例无家族发病案例的SLE患者与健康人外周血单个核细胞基因表达水平存在明显的差异.     

药物诱导的小鼠红白血病细胞沿红系分化过程中基因表达的差异显示分析

应用mRNA差异显示技术分析了药物诱导MEL细胞沿红系分化过程中基因表达的改变。以六个锚定引物和六个随机引物共36种组合进行差异显示分析，得到67个差异片段。对部分片段进行克隆测序，获20个片段的序列，其中12个新的表达序列标签。以反向斑点杂交检测部分差异显示带的差异性，阳性率为27／39（69％）。     

建立cDNA微矩阵基因芯片技术并分析食管癌细胞系Eca109基因表达谱

为筛选食管癌相关基因,建立并应用cDNA微矩阵技术分析了食管癌细胞系ECa109基因表达谱.结果显示,在886条基因中,ECa109细胞系与正常食管上皮细胞间存在显著差异表达的基因有107条(12.08%),其中表达上调的51条(5.76%),表达下调的56条(6.32%).定量RT-PCR验证其中2个基因的表达水平,结果一致.建立T7 RNA聚合酶扩增技术,并对比分析了无扩增样品的基因表达谱,两者表现了较好的吻合性,这为cDNA微阵技术分析原发性食管癌微量肿瘤细胞的基因差异表达谱提供了方法学.食管癌细胞株ECa109基因表达谱的分析也使我们对食管癌病变机制有了一个初步的了解.     

地方株HPV16L1基因免疫小鼠诱发的抗体反应

为了检测pcDNA-L1的表达，评价地方株HPV16L1基因诱导的体液免疫反应。我们采用PCR技术从宫颈癌组织中获得HPV16L1基因，以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1，进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析，再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1(-)中，构建重组pcDNA-L1，转染Cos-7细胞，通过IFA试验验证L1蛋白的表达。     

变形链球菌gcp基因敲除菌株表达谱基因芯片

背景：前期研究中经证实变形链球菌内部存在单磷酸鸟苷环二聚体信号通路,构建了变形链球菌gcp基因敲除菌株。 目的：比较变形链球菌野生菌种和gcp基因突变菌株基因表达的差异情况,筛选与生物膜相关的基因,进入后续研究。 方法：提取两种细菌的总RNA,反转录后分别用cy3和cy5染色。与基因芯片杂交后,扫描结果,进行数据分析,获取差异基因信息,对筛选的基因进行Real-Time PCR验证。 结果与结论：差异基因主要与糖代谢、生物膜形成有关,选择了2个基因进行验证,PCR结果与芯片结果相符合。变形链球菌gcp基因敲除后,突变菌株ahpC基因表达上调,磷酸转移酶系统基因表达下调,说明这2个基因与c-di-GMP信号通路的下游途径相关。     

蔗糖浓度对口腔变形链球菌gbpC基因表达的影响

目的 观察不同浓度蔗糖环境对变形链球菌葡聚糖结合蛋白C编码基因gbpC表达的影响.方法 变形链球菌分别在0.5%、1.0%、5.0%蔗糖条件下培养,提取总RNA,逆转录成cDNA,利用TaqMan实时荧光定量PCR技术检测不同环境条件下变形链球菌gbpC基因的表达.结果 当蔗糖浓度从0.5%升高至1.0%时变形链球菌gbpC基因表达明显上调(P<0.05),而5.0%蔗糖较1.0%蔗糖条件下gbpC表达无明显改变(P>0.05);黏附较强菌株其gbpC基因表达高于黏附较弱菌株,特别是在0.5%和1.0%蔗糖环境中差异具统计学意义(P<0.05).结论 蔗糖量从0.5%增至1.0%可促进变形链球菌gbpC基因表达,这可能是蔗糖促进变形链球菌黏附的机制之一;gbpC基因的表达量可能与变形链球菌黏附力相关.     

Effect of xylitol and other carbon sources on Streptococcus pneumoniae biofilm formation and gene expression in vitro

Xylitol inhibits the growth of Streptococcus pneumoniae. In clinical trials, xylitol decreased the occurrence of acute otitis media in day-care children, but did not decrease nasopharyngeal carriage of pneumococci. We hypothesized that xylitol inhibits biofilm formation of pneumococci, and measured biofilm formation and gene expression levels of the capsule gene cpsB and two other genes: autolysin encoding gene lytA and competence gene comA in different growth media in vitro. Twenty pneumococcal isolates were grown on polystyrene plates for 18 h in test media containing 0.5% xylitol, 0.5% glucose, 0.5% xylitol and 0.5% glucose, 0.5% fructose, 0.5% xylitol and 0.5% fructose or brain heart infusion (BHI) medium supplemented with 10% horse serum. Gene expression levels were measured after 5 h of growth using a relative quantification method with calibrator normalization. Exposure to xylitol lowered OD values, which were used as an indication of biofilm, compared with BHI medium, but when the medium was supplemented with glucose or fructose, biofilm formation was enhanced and the inhibitory effect of xylitol on biofilm formation was not observed. Xylitol also lowered lytA expression levels. Changes in biofilm formation in response to different sugar compounds may partly explain the efficacy of xylitol to prevent acute otitis media in previous clinical trials.     

Detection of Streptococcus pneumoniae colonisation in respiratory tract secretions of military personnel

Respiratory tract infections with Streptococcus pneumoniae are an important cause of morbidity and mortality among military personnel. A sensitive method is needed to determine the prevalence of S. pneumoniae colonisation in respiratory secretions, as well as its role in pneumonia without an established aetiology. This study investigated the efficacy of two PCR assays in screening military personnel for S. pneumoniae colonisation. Nasopharyngeal swabs were obtained from 200 military personnel and tested for S. pneumoniae by culture and PCR. S. pneumoniae was cultured from three (1.5%) of the 200 samples. PCR for the lytA gene detected S. pneumoniae in 11% of the samples, while PCR for the pneumolysin gene detected S. pneumoniae in 3% of the samples. The sensitivity and negative predictive values were 100% for both PCR assays when compared to culture; the specificity and positive predictive values for the lytA PCR were 90.4% and 13.6%, respectively, compared with 98.5% and 50%, respectively, for the pneumolysin gene PCR. It was concluded that respiratory tract colonisation of military personnel with S. pneumoniae can be identified rapidly and reliably by PCR assays. The use of this technique may greatly enhance the ability to identify a microbial aetiology for pneumonia when compared with conventional culture methods.     

基因表达系列分析及其应用前景

基因表达系列分析(Serial analysis of gene expression，SAGE)是一种研究真核细胞表达基因信息的高通量检测技术，它能对细胞内所有表达基因进行定性与定量分析。近年来此技术广泛应用于获得表达基因谱的研究，并且可以发现新基因信息，还可发现基因的靶向定位以及对其它基因的影响，明确表达基因的功能。本文就SAGE的原理、实验方案、技术发展与演变及其应用前景进行详细介绍。     

Studies of differential gene expression in clinically derived eosinophil populations

BACKGROUND: Influx of eosinophils into the post-capillary bronchial epithelium and the subsequent release of inflammatory mediators is characteristic of the late phase of asthmatic attacks. The genes that serve to predispose the peripheral blood eosinophils of asthmatics to undergo this process are poorly defined. The aim of this report is to describe the differential gene expression of both the known pro-inflammatory genes 5-lipoxygenase and 5-lipoxygenase-activating protein (FLAP) and novel cDNA sequences in eosinophils derived from clinical samples. METHODS: Novel cDNA sequences representing genes upregulated in peripheral blood eosinophils of asthmatic as compared with nonasthmatic patients were identified by differential display polymerase chain reaction (DDPCR). The differential expression of these sequences, in addition to known pro-inflammatory genes, were then studied by reverse dot blotting of amplified RNA generated from the eosinophils of nonasthmatic donors, asthmatic donors, asthmatic donors taking steroids, interleukin (IL) -3, IL-5, granulocyte-macrophage colony stimulating factor- (GM-CSF) treated eosinophils from asthmatic donors and the eosinophilic cell line AML14. RESULTS: Four unique DDPCR-generated 3'UTR DNA fragments were identified that showed differing patterns of expression between the eosinophil populations of interest. Expression of each of the novel clones was increased in the peripheral blood eosinophils of asthmatics and downregulated in those donors taking steroids. Expression of 5-lipoxygenase was not found to vary between the different eosinophil populations, whereas FLAP was induced by treatment with the cytokine cocktail in both primary eosinophils and the eosinophilic cell line AML14. CONCLUSION: The differential regulation of the novel cDNA sequences and FLAP in the range of eosinophil populations studied suggest that they may provide clinically relevant therapeutic targets. Moreover, the procedures used in these studies may provide a general approach to the study of differential gene expression in small numbers of cells such as those obtained from clinical samples.