LKB1基因与乳腺癌细胞侵袭性相关因子的研究

目的观察LKB1基因对乳腺癌细胞的侵袭性影响及机制。方法筛选LKB1基因转染的MDA-MB-435乳腺癌细胞,随机取样一株高表达细胞株和一株低表达细胞株,同时与未转染细胞株和空质粒转染细胞株比较。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和明胶．酶谱法观察基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9和促进微血管生成的因子VEGF、bFGF的基因表达情况,并应用Western印迹对其蛋白定量分析。应用Tramswell试验对其进行膜穿透能力检测。结果LKB1基因转染的乳腺癌细胞的mRNA和蛋白水平上MMP-2、MMP-9和VEGF、bFGF基因表达的相对吸光度（A）值皆低于未转染细胞和空质粒细胞,且LKB1基因高表达细胞株较低表达细胞株更低。同时发现Tramswell试验中LKB1转染的细胞侵袭能力下降（18．1％±1．0％、22．4％±1．8％vs47．6％±1．3％、45．6％±1.2％,均P〈0．01）。结论LKB1基因作为一种抑癌基因对乳腺癌细胞的侵袭性可能起重要作用。     

HIWI基因沉默对膀胱癌细胞生物学行为的影响

目的：利用基因转染和RNA干扰（RNAi）技术,研究HIWI基因沉默对T24细胞生物学行为的影响,探讨HIWI基因作为抑制膀胱癌细胞增殖分子靶点的可能性。方法：实验分为转染pGenesil-2-HIWI1组、转染pGenesil-2-HIWI2263组、转染阴性对照质粒pGenesil-2-control组,只加转染试剂聚乙烯亚胺（PEI）的对照组和只加入PBS的阴性对照组,每组设4个平行样。利用PEI介导,将靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体瞬时转染T24细胞,通过MTT法及流式细胞仪检测各组细胞增殖和细胞周期的改变。结果：转染后24 h,转染组的细胞增殖抑制率分别为32.60%和26.09%,较对照组细胞增殖抑制率（3.54%）明显降低（P<0.01）。转染后48 h,转染组S期细胞百分数［（29.39± 3.27）%和（30.87±10.88）%］较对照组［（39.36±2.09）%］明显降低,G₂/M期细胞百分数［（9.39±0.80）%和（11.46±1.53）%］较对照组［（5.57±0.40）%］明显增加（P<0.05）。结论：HIWI基因沉默对T24细胞具有增殖抑制作用,HIWI基因可以作为抑制膀胱癌细胞增殖的分子靶点;HIWI基因沉默对膀胱癌具有潜在的治疗价值。     

特异性siRNA沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响

目的 探讨RNA干扰（RNA interference,RNAi）沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞侵袭的影响.方法 根据TDGF-1基因序列特点设计3个小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）后,转染人乳腺癌MDA-MB-468细胞,用荧光实时定量RT-PCR筛选出效果最好的siRNA.以该siRNA转染处理乳腺癌MDA-MB-468细胞后,分别采用实时定量RT-PCR和western blot检测TDGF-1基因mRNA和蛋白水平,以划痕试验方法评测癌细胞迁移能力;用Boyden模型观察癌细胞侵袭能力.结果 根据TDGF-1基因序列特点设计的3个siRNA均能抑制TDGF-1基因mRNA水平,以S1效果最好.S1 siRNA转染组TDGF-1 mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性（P＜0.001,P＜0.001）.体外试验发现,TDGF-1 siRNA转染可有效抑制乳腺癌细胞集落生长、侵袭和迁移能力,且与浓度相关（P＜0.005,P＜0.005,P＜0.005）.结论 TDGF-1在乳腺癌细胞迁移、侵袭中起着重要的作用;采用TDGF-1 siRNA转染可抑制乳腺癌细胞侵袭.     

沉默id1基因表达对食道癌细胞Eca-109生物学行为的影响

目的 探讨靶向沉默分化抑制因子1基因(id1)的短发夹RNA(shRNA)表达质粒载体对食道癌细胞生物学行为的影响.方法 设计针对id1基因的shRNA序列,合成序列并克隆入pGFU6/neo质粒中.重组质粒转染食道癌细胞,RT-PCR检测id1基因mRNA的表达,Western blot检测Id1、p16及增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达.台盼蓝染色、克隆形成实验检测细胞生长,流式细胞仪检测细胞增殖以及各周期分布.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功.转染重组质粒的食道癌细胞id1 mRNA和蛋白的表达明显下降 (P<0.05),食道癌细胞增殖受到抑制,G0/G1期细胞比例增加,而S期的细胞比例明显下降(P<0.05).结论 构建的id1 shRNA表达质粒能有效下调id1基因的表达和抑制食道癌细胞增殖.     

Calponin-1表达沉默对子宫平滑肌细胞生物学行为的影响

目的 研究抑制calponin-1表达对人子宫平滑肌细胞增殖、侵袭、凋亡和细胞骨架的影响,探讨妊娠时人子宫平滑肌细胞中calponin-1蛋白表达上调存分娩发动中的作用机制.方法 构建腺病毒siRNA-calponin-1质粒,转染原代培养的人子宫平滑肌细胞,分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)、Transwell侵袭实验和流式细胞术(AnnexinV/PI双染法)检测转染siRNA-calponin-1前后对子宫平滑肌细胞增殖、侵袭、凋亡的影响;同时用Rhodamine-Phailoidin标记子宫平滑肌细胞骨架蛋白(F-actin),荧光显微镜观察其变化并进行荧光定量检测.结果 实验组与空载体组、空白对照组比较,子官平滑肌细胞的运动能力明显下降(P<0.05),细胞增殖能力及凋亡率无明显差异(P>0.05);空载体组与空白对照组比较,差异无统计学意义P>0.05).实验组子宫平滑肌细胞中F-actin的含量减少,排列松散、不规则、微丝较细;空载体组、空白对照组子宫平滑肌细胞中F-actin微丝明显增多增粗、呈束状平行排列.结论 体外实验表明抑制calponin-1的表达可以抑制子宫平滑肌细胞的运动而不影响其增殖和凋亡,并可引起子宫平滑肌细胞F-actin的形态变化与重排.此结果提示:妊娠时子宫平滑肌细胞迁移能力的改变及F-actin的重排,可能是导致分娩发动的重要机制之一.     

沉默PLK1基因表达对肺腺癌H1792细胞肿瘤生物学行为影响的研究

［摘要］ 〖HTH〗目的〖HTSS〗〖KG*2〗探讨PLK1表达下调对肺腺癌H1792细胞肿瘤生物学行为的影响,并分析相关机制。 〖HTH〗方法〖HTSS〗〖KG*2〗将PLK1 siRNA和control siRNA转染肺腺癌H1792细胞48 h,采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）法检测肺腺癌H1792细胞PLK1 mRNA表达水平;采用Western blot法检测H1792细胞中PLK1、E-cadherin、Vimentin蛋白表达;再通过流式细胞术检测肺腺癌H1792细胞检测周期分布的变化情况;Transwell实验检测H1792细胞侵袭能力的改变。 〖HTH〗结果〖HTSS〗〖KG*2〗PLK1 siRNA组PLK1 mRNA表达水平显著低于control siRNA组（P＜0.05）。PLK1 siRNA组PLK1蛋白和 Vimentin蛋白表达显著低于control siRNA组,E-cadherin蛋白表达显著高于control siRNA组（P＜0.05）。PLK1 siRNA组G2/M期细胞比例显著高于control siRNA组,S期细胞比例显著低于control siRNA组（P＜0.05）。siRNA组穿膜细胞数显著少于control siRNA组（P＜0.05）。 〖HTH〗结论〖HTSS〗〖KG*2〗PLK1在肺腺癌的生长和侵袭转移中发挥重要作用。     

抑癌基因LKB1对肺癌细胞血管内皮生长因子的表达调控

目的：了解抑癌基因LKBl对肺癌细胞A549血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的调控作用。方法：应用巢式PCR方法扩增LKB1基因编码区，构建LKBl的真核表达载体并以脂质体法转染A549细胞，G418筛选稳定表达细胞株；RT-PCR及Western印迹法检测LKBl、SPl和VEGF在A549细胞中的表达变化；siRNA技术干扰转录因子SPl的表达，RT-PCR及Western印迹法检测SPl和VEGF的表达变化。结果：外源性LKBl在A549细胞中稳定表达；LKBl蛋白下调SPl和VEGF的表达；SPl可被特异性siRNA分子有效抑制，siRNA介导的SPl沉默伴随VEGF表达下调。结论：LKBl可能通过负调控转录因子SPl的表达从而调控VEGF的表达。     

siRNA沉默血管VEGFR-1基因对乳癌生长抑制作用

目的 探讨应用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)沉默人裸鼠乳癌移植瘤新生血管中的血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1) 基因对移植瘤生长的影响.方法 将组织瘤块接种于裸鼠右侧第二对乳腺的脂肪垫内,肿瘤长至一定大小时, 随机分为对照(A)组、转染试剂对照(B)组、siRNA治疗(C)组.于肿瘤局部分别注射PBS溶液、Lipofectamine 2000TM转染试剂和Lipofectamine 2000TM转染试剂包裹的VEGFR-1 siRNA.22 d后处死全部动物,取肿瘤,测其大小;用RT-PCR及蛋白印迹法检测乳癌组织VEGFR-1 基因的表达.结果 与A、B组比较,C组移植瘤增长趋势受到明显抑制(F=158.18、55.72,q=11.39、14.05,P<0.01);RT-PCR结果表明,与A、B组比较,C组明显下调了VEGFR-1 mRNA的表达(F=385.06,q=33.43,34.52,P<0.01);蛋白印迹法结果亦显示,C组明显下调了VEGFR-1 mRNA的表达(F=114.11,q=9.31,20.75,P<0.01).A组和B组各指标差异无显著性(P>0.05).结论 化学修饰的siRNA介导的RNAi可以降低人乳癌裸鼠移植瘤血管中VEGFR-1的表达, 抑制血管生成进而抑制肿瘤的生长,是潜在的肿瘤治疗的新方法.     

siRNA沉默Livin基因对乳腺癌MCF-7细胞化学治疗增敏作用的研究

目的：观察小干扰RNA（siRNA）沉默Livin基因对人乳腺癌细胞MCF‐7细胞生物学影响及siRNA沉默MCF‐7细胞Livin基因对4种化学治疗药物的增敏作用。方法 Lipofectamine 2000脂质体转染法转染MCF‐7。分组：空白组（无转染）、脂质体组、反义组、错义组、联合组。MTT法测定氟尿嘧啶（5‐FU）、表柔比星（EPI）、多西紫杉醇（DXT）、吉西他滨（GEM）单药（单药组）对乳腺癌细胞MCF‐7增殖的抑制作用。免疫组织化学检测Livin蛋白在MCF‐7细胞中的表达及转染联合化学治疗药物对Livin蛋白的表达变化。实时荧光定量PCR（RT‐PCR）检测转染Livin siRNA后乳腺癌MCF‐7细胞的Livin基因表达变化。同时利用Annexin‐V检测乳腺癌细胞的凋亡及siRNA Livin联合5‐FU、EPI、DXT、GEM 诱导乳腺癌细胞凋亡的影响。结果 Livin在MCF‐7细胞中高表达,4种化学治疗药物对 Livin表达无明显影响,转染Livin基因48、72 h后联合4种药物后能明显下调Livin蛋白表达,差异有统计学意义（P＜0．05）。5‐FU、EPI、DXT、GEM治疗乳腺癌MCF‐7细胞48、72 h均能明显的引起细胞的凋亡,且呈剂量依赖性。转染Livin基因48 h联合4种药物后乳腺癌MCF‐7细胞的凋亡率明显高于单药处理的细胞,差异有统计学意义（P＜0．01）。结论 siRNA沉默Livin基因能促进由化学治疗药物5‐FU、EPI、DXT、GEM引起的细胞凋亡,具有化学治疗增敏作用。     

RNAi沉默Polo-like kinase-1基因表达对大肠癌细胞端粒酶活性的影响

 目的 探讨polo-like kinase-1（PLK1）基因对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。 方法根据PLK1基因序列特点,设计并用化学方法合成小干扰核糖核酸分子（small interfering RNA,siRNA）,转染人大肠癌SW480细胞后,分别采用实时定量PCR和Western blot检测PLK1基因mRNA和蛋白表达水平。分别采用MTT法和TRAP-ELISA方法检测PLK1基因转染对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。 结果 所设计的5个siRNA均能明显抑制大肠癌SW480细胞PLK1 mRNA水平,以P4效果最好。以P4转染处理大肠癌细胞后,PLK1 mRNA水平和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性。MTT和TRAP-ELISA方法检测发现,P4siRNA转染组细胞增殖和端粒酶活性明显受到抑制,且呈浓度和时间依赖性（P＜0.05,P＜0.05）。 结论 PLK1基因对大肠癌细胞增殖具有重要的调控作用,以PLK1 siRNA转染处理大肠癌细胞,可明显抑制大肠癌细胞的恶性增殖,其机制可能与抑制端粒酶活性有关。     

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1基因沉默对肺癌细胞生物学行为的影响

目的 研究丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(LKB1)基因表达沉默对肺癌细胞生物学行为的影响.方法 以RNA干扰技术建立LKBI表达抑制的细胞模型,Westem blotting方法检测干扰LKB1蛋白表达的效果;通过绘制生长曲线和克隆形成试验检测LKB1基因沉默肺癌细胞的增殖变化;应用Annexin V/PI双染法和流式细胞技术分析LKB1基因沉默后肺癌细胞周期的变化及其凋亡和坏死情况.结果 成功建立了LKB1基因沉默肺癌细胞模型,稳定表达LKB1-siRNA细胞的LKB1蛋白表达被明显抑制,LKB1基因沉默后肺癌细胞增殖速度明显加快,但其早期与晚期凋亡率较对照组相比并无显著变化.结论 LKB1基因的下调表达对95D细胞部分恶性生物学行为的发生具有一定的促进作用.     

RNA干扰HO-1表达对肺腺癌A549细胞生物学行为的影响研究

目的应用RNA干扰技术特异性抑制血红蛋白加氧酶-1（HO-1）的表达,观察HO-1对肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法将体外构建的HO-1小分子RNA（siRNA）转染入肺腺癌A549细胞,分为空白对照组（blank组）、脂质体组（mock组）、阴性对照组（NC组）、HO-1siRNA组;应用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法检测HO-1mRNA和蛋白表达水平;分别以CCK-8法、流式细胞术检测细胞增殖能力和凋亡率,用Transwell试验检测细胞迁移能力。结果细胞培养48、72h后,与blank组、mock组、NC组比较,HO-1siRNA组细胞存活率均降低（均P＜0.05）,细胞凋亡率均增高（均P＜0.05）,G0期/G1期细胞比例均增高（均P＜0.05）,Transwell试验中穿膜细胞数均减少（均P＜0.05）。结论RNA干扰HO-1基因表达后能有效调控肺腺癌A549细胞的恶性生物学行为,抑制肺腺癌A549细胞的增殖,促进凋亡,降低细胞的侵袭能力。     

siRNA介导的E2F-1基因沉默对胃癌细胞MGC803中Rb蛋白表达水平的影响

目的 应用RNA干扰技术研究E2F-1基因沉默在人胃癌MGC803细胞中对Rb蛋白表达的影响.方法 将重组质粒E2F-1-siRNA转染MGC803细胞,筛选稳定株,利用RT-PCR检测转染前后细胞E2F-1 mRNA表达水平,并通过蛋白免疫印记法（Western blot）检测各组细胞E2F-1蛋白的表达水平来验证质粒转入胃癌细胞的情况.采用Western blot检测三组细胞中总Rb蛋白和磷酸化Rb蛋白的表达情况,计算出非磷酸化Rb蛋白表达情况,统计各组间的差异.结果 重组质粒E2F-1-siRNA成功转入胃癌细胞中;有效抑制了E2F-1 mRNA的表达,E2F-1蛋白水平显著下降,与阴性对照组及未转染组相比分别降低了83.2%和84.6%,去磷酸化Rb蛋白分别增加了61.22%（P〈0.05）和66.60%（P〈0.05）,差异有统计学意义.结论 沉默表达E2F-1基因后,可以有效降低Rb蛋白的水平,促进其活化形式去磷酸化Rb蛋白的产生.     

抑癌基因LKB1在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

目的 通过检测新发现的抑癌基因LKB1在乳腺癌中表达情况,探讨其与乳腺癌变的关系及其预后意义。方法 用Western印迹法比较不同乳腺癌细胞株LKB1基因的表达情况,构建LKB1基因表达质粒,转染至该基因低表达的细胞株,研究细胞生长数度及凋亡相关蛋白表达的改变;以Western印迹法检测LKB1基因在121例乳腺癌手术标本中的表达,结合临床病理资料分析该基因在乳腺癌中的临床意义。结果 MDA-MB-435细胞中未能检测到LKB1基因的表达,转染LKB1基因表达质粒后,MDA-MB-435细胞的生长受到明显抑制;细胞周期分析,G1期细胞的比例18．3％增至40．9％;细胞中细胞周期相关因子细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E的含量下降,而其抑制因子p21的含量升高;单因素分析表明LKB1低表达与高复发率(P=0．002)及总生存率差(P=0．008)显著相关。结论 在LKB1基因缺表达的乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞中,转入并表达该基因能明显抑制其乳腺癌细胞的生长;其作用与p21介导的G1期阻滞有关;LKB1基因低表达与乳腺癌预后差显著相关。     

靶向mTOR siRNA的合成及对MCF-7细胞mTOR基因表达的影响

目的:合成靶向哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)siRNA,观察其对人乳癌MCF-7细胞mTOR基因表达的影响。方法:以mTOR基因434～452序列为靶点,设计并体外合成mTORsiRNA,用100和150nmol/L的siRNA转染MCF-7细胞24、48、72h,同时设无关对照组(转染非特异性siRNA)和正常对照组(不转染),运用免疫组化SP法和原位杂交技术检测各组细胞mTOR蛋白及mRNA的表达水平。结果:转染24、48和72h后,与各对照组相比,siRNA转染组细胞mTOR蛋白及mRNA的表达均降低(P均<0.05),2个siRNA转染组之间差异无统计学意义(P均>0.05)。不同时间点mTOR蛋白及mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:设计合成的siRNA可有效抑制乳癌MCF-7细胞mTOR基因的表达。     

HDAC2 siRNA转染对人胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨RNA干扰沉默组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)基因表达对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法: 培养人胰腺癌PaTu8988细胞株,并将其随机分为5组:空白对照组,20 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,40 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,20 nmol／L HDAC2 siRNA组,40 nmol／L HDAC2 siRNA组。合成针对HDAC2基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),利用阳离子脂质体将HDAC2 siRNA瞬时转染人胰腺癌PaTu8988细胞,分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测HDAC2基因及蛋白的表达;MTT比色法检测细胞的增殖率;流式细胞术测定细胞凋亡率。结果: 与空白对照组和阴性siRNA 组对比,HDAC2 siRNA组的HDAC2基因和蛋白的表达水平均明显下降(P均<0.05),细胞增殖率减慢(P<0.01),凋亡率明显升高(P<0.01)。结论: 采用RNA干扰沉默人胰腺癌细胞HDAC2基因表达,可抑制癌细胞增殖和诱导其凋亡。     

siRNA沉默CEACAM1基因对人胶质瘤SHG44细胞生物学行为的作用

目的 探讨CEACAM1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对胶质瘤SHG44细胞增殖、体外迁移和侵袭能力的影响. 方法 设计并化学合成针对CEACAM1的3对siRNA,脂质体法瞬时转染SHG44细胞.Western blot检测转染后细胞中CEACAM1、β-catenin和Cyclin D1蛋白表达水平变化.CCK-8法检测转染后的细胞增殖情况,流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化.通过Transwell小室迁移和侵袭实验,观察下调CEACAM1对SHG44细胞体外迁移和侵袭能力的影响.结果 三组特异性siRNA转染48 h后,Western blot的结果显示,3个siRNA转染组CEACAM1蛋白水平均低于正常对照组和阴性对照组(P＜0.01),以CEACAM1-siRNA3干扰效果最为明显.后续实验表明,与两个对照组相比较,CEACAM1-siRNA组的细胞增殖减慢,β-catenin和Cyclin D1表达水平明显减少(P＜0.05).Transwell小室迁移和侵袭实验表明CEACAM1下调后的SHG44细胞迁移和侵袭能力较正常对照组及阴性对照组明显降低(P＜0.05). 结论 CEACAM 1-siRNA能有效抑制人胶质瘤SHG44细胞CEACAM1蛋白的表达,并抑制细胞增殖,降低细胞的体外迁移及侵袭能力.     

抑制NFBD1的表达对鼻咽癌化疗敏感性的影响

目的:研究抑制NFBD1表达后,对鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞化疗敏感性的影响。方法:将NFBD1 siRNA导入NPC细胞系,采用RT-PCR和蛋白质印记法检测siRNA对NPC细胞NFBD1表达的抑制效果;NFBD1 siRNA转染后,MTT法分析NPC细胞对化疗药物敏感性的影响。结果:NFBD1 siRNA转染NPC细胞后,能高效、特异地在mRNA水平及蛋白质水平抑制NFBD1的表达;MTT结果分析表明,NFBD1 siRNA转染后,能显著提高NPC细胞系对化疗药物的敏感性。结论:NFBD1 siRNA转染后抑制NPC NFBD1表达,可显著提高其对化疗药物顺铂的敏感性。