雌二醇对人成骨肉瘤MG63细胞株护骨素、护骨素配体及其相关因子的调节

目的观察17β-雌二醇(17β-E2)和ICI 182780对人成骨肉瘤MG63细胞株表达护骨素(OPG)、OPG配体(OPGL)及其相关因子[TRAIL、巨噬细胞集落刺激因子(M—CSF)、转化生长因子β(TGFβ)]的影响。方法用逆转录PCR(RT—PCR)法检测基因表达情况,用Western blot分析法检测蛋白表达情况。结果(1)17β—E2能上调MG63细胞中OPG及TGFβ的表达,下调OPGL、M—CSF及TRAIL的表达。(2)ICI 182780对被检测基因有不同的调节活性。结论雌激素缺乏可能导致成骨细胞中OPG、TGFβ的表达减少,而解除了对OPGL、M—CSF和TRAIL等细胞因子的抑制作用,使破骨细胞的数量和活性增加,骨吸收增强和骨量丢失,这可能是绝经后骨质疏松症的一个重要的发病机制;ICI 182780并非纯雌激素受体拮抗剂,而属于选择性雌激素受体调节剂。     

RNA干扰抑制雌激素受体α亚基对雌激素诱导人成骨样细胞护骨素表达的影响

目的 探讨RNA干扰抑制人成骨样细胞株MG63中雌激素受体α亚基(estrogen receptor α subunit ERα)后，对17β-雌二醇(E2)诱导护骨素(OPG)表达的影响。方法 利用计算机辅助设计ERα特异性siRNA，体外合成siRNA基因，并将其定向克隆入真核表达载体pSilencer4．1-CMV。以脂质体法转染ERα siRNA载体至人的成骨样细胞株MG63中，鉴定后分别用不同浓度的雌激素或G蛋白抑制剂苏拉明干预经ERα siRNA转染的MG63细胞或未经ERα siRNA转染的MG63细胞，RT-PCR法检测OPG mRNA的表达水平。结果 双酶切法鉴定重组质粒后，RT-PCR法鉴定ERα siRNA载体可特异地抑制MG63细胞中ERα的表达。不同浓度的17β-E2上调MG63细胞OPG mRNA的表达，其中以10^-7mol／L的作用最强。但经ERα siRNA载体抑制MG63细胞ERα亚基后，17β-E2上调MG63细胞OPG mRNA表达的作用消失。结论 17β-E2主要经ERα亚基上调MG63细胞OPG的表达。     

17β-雌二醇对新生大鼠成骨细胞护骨素和破骨细胞分化因子表达的调节

体外培养成骨细胞，用不同浓度（10^-11～10^-6mol／L）17β-雌二醇干预，RT—PCR测定护骨素、破骨细胞分化因子（ODF）mRNA的表达水平。雌二醇作用后，成骨细胞护骨素表达上调（P〈0．05），以10^-8mol／L最显著；ODF表达无明显变化。雌激素治疗骨质疏松症的作用可能与其在生理浓度时促进成骨细胞护骨素表达有关。     

雌二醇对成骨细胞OPG和RANKL的影响

目的探讨不同浓度17β-雌二醇(E2)作用下体外培养大鼠成骨细胞护骨素(OPG)、细胞核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)的表达及雌激素治疗骨质疏松的机制。方法采用不同浓度(10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)17β-E2刺激培养的大鼠成骨细胞(OB),RT-PCR方法检测OPG、RANKL mRNA的表达。结果原代OB呈多角形、梭形,传代OB胞核较大,细胞质内见黑色颗粒,细胞形态为多角形或梭形,见突起,三代细胞碱性磷酸酶染色阳性,胞质见大量灰黑色颗粒,细胞鉴定符合成骨细胞特征。不同浓度(10-9、10-8、10-7mol/L)17β-E2对OB OPG mRNA表达具有显著的增强作用(P<0.05),其中10-8mol/L 17β-E2对OB OPG mRNA表达最高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),而10-10mol/L 17β-E2对成骨细胞OPG mRNA表达几乎无影响,与对照组比较无显著差异(P>0.05),10-10、10-9、10-7mol/L 17β-E2对成OB RANKL mRNA表达几乎无影响,与对照组比较无明显差异(P>0.05),其中10-8mol/L17β-E2对OB RANKL mRNA的表达具有明显的抑制作用,其与对照组比较差异明显(P<0.05)。结论雌激素治疗骨质疏松的作用可能与其促进成骨细胞OPG表达、抑制RANKL表达相关。     

雌二醇对成骨细胞护骨素基因表达的影响

目的 研究在MG－63细胞和成人成骨细胞培养的不同阶段,雌激素对护骨素（OPG）基因mRNA表达的影响,探讨雌激素对成骨细胞的作用机制。方法 在细胞培养的不同时间,测定细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素（OC）含量和进行Van Gieson胶原染色,以确定细胞培养的增殖、成熟、矿化,于成熟阶段用17β－雌二醇（E2）对培养细胞进行处理,用半定量RT－PCR技术测定雌二醇对成骨细胞OPG基因mRNA表达的影响。结果 ALP活性、骨钙素含量及胶原染色均表明,细胞培养汇片后12天达到成熟。正常成人髂骨分离的成骨细胞（HOB）及成骨肉瘤细胞株MG－63均能表达OPG,且表达量与培养的时程有关。培养12天时,两各OPG基因mRNA表达均达最高峰（P＜0．01）。10^-8mol/L的E2能使MG－63细胞OPG基因mRNA的表达至基础值的10倍（P＜0．001）,HOB的OPG基因mRNA表达增加至基础值的7－8倍（P＜0．01）。结论 OPG在成骨细胞表达。雌激素使成骨细胞OPG基因mRNA表达的增加是雌激素缺乏导致骨质疏松的重要机制之一。     

护骨素及其配体与骨质疏松

护骨素及其配体是近2年来发现的两种重要蛋白质，可能是揭开骨质疏松症的发病机理的突破口。研究表明，护骨素为一种诱饵受体，本身无传导信号的作用。但在与其受体护骨素配体结合后，可阻止核因子KB受体激活物与护骨素配体结合，使核因子KB爱体激活物活化受阻，不能发挥其破骨作用。因此护骨素，核因子KB受体激活物与护骨素配体共同组成了一个完整的体系，在维系骨的健康方面发挥着重要作用。保持该系统的平衡是维持骨健康的先决条件。     

脂联素对人成骨细胞护骨素和核因子κB受体活化素配体表达的调节

目的 探讨脂联素对人成骨细胞护骨素(OPG)和核因子κB受体活化素配体(RANKL)表达的作用.方法 RT-PCR及Western印迹检测体外培养的人成骨细胞的脂联素受体(Adipo R)mRNA及Adipo R蛋白表达.分别用0、3、10 μg/ml和30 μg/ml脂联素干预人成骨细胞48 h以观察剂量效应和分别用0、30μg/ml脂联素干预人成骨细胞0、12、24 h和48 h以观察时间效应,干预前后OPG、RANKL的mRNA及蛋白表达分别用实时聚合酶链反应(real-time PCR)和ELISA检测.结果 (1)人成骨细胞可表达Adiop R1 mRNA、Adiop R1蛋白和Adiop R2 mRNA.(2)30μg/ml脂联素干预人成骨细胞12、24 h或48 h后,OPG的mRNA表达分别为0 h的(69±6)%、(51±7)%和(26±8)%(P＜0.05),OPG蛋白表达分别为0 h的(66±5)%、(32±8)%和(14±6)%(P＜0.05);RANKL的mRNA表达分别为0 h的(1 80±12)%、(220±19)%和(316±14)%(P＜0.05),可溶性RANKL(sRANKL)蛋白的表达分别为0 h的(236±12)%、(272±9)%和(308±14)%(P＜0.05).(3)3、10 μg/ml或30μg/ml脂联素干预人成骨细胞48 h时,OPG的mRNA表达分别为对照组的(66±9)%、(44±10)%和(29±7)%(P＜0.05),OPG蛋白的表达分别为对照组的(52土9)%、(38±4)%和(17±4)%(P＜0.05);RANKL的mRNA表达分别为对照组的(168±6)%、(214±7)%和(314±11)%(P＜0.05),sRANKL蛋白的表达分别为对照组的(156±6)%、(196±8)%和(212±7)%(P＜0.05).结论 脂联素呈时间和剂量依赖性调节人成骨细胞OPG和RANKL的表达,可能是新的骨代谢调节因子.     

OPG、OPGL及其相关因子的骨代谢调节作用

近年来发现了肿瘤坏死因子 (TNF)家族的几个新成员———护骨素 (OPG)、护骨素配体 (OPGL)和核因子κB受体活化子 (RANK) ,它们在调节破骨细胞的形成和活化方面起关键作用 ,综述了这几种因子的基因和蛋白质结构的特征、表达调节因素及其对骨代谢平衡和骨代谢疾病的影响。     

淫羊藿甙对大鼠成骨细胞护骨素、RANKL表达的影响

目的观察淫羊藿甙对体外培养大鼠成骨细胞护骨素(OPG)、核因子-kB受体活化因子配体(RANKL)mRNA表达的影响。方法用酶消化法分离24h内新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养。在培养液中加入不同浓度的淫羊藿甙(10~(10)～10~(14)mol/L),培养48h后,抽提总RNA,采用半定量RT-PCR法检测成骨细胞中OPG和RANKL mRNA表达的变化。结果淫羊藿甙可明显促进成骨细胞OPG mRNA的表达,抑制RANKL mRNA的表达,且呈浓度依赖性,均以10~(-7)mol/L时作用最显著(P＜0.05)。预先用淫羊藿甙干预成骨细胞,可逆转地塞米松的降低OPG mRNA(0.570±0.093vs 1.083±0.081)、升高RANKL mRNA(1.079±0.050vs 0.718±0.082)的作用(均P＜0.05)。结论淫羊藿甙可以上调OPG基因表达,下调RANKL基因表达,从而调节骨吸收,这可能是淫羊藿甙防治骨质疏松症的重要机制之一。     

RNA干扰基因敲低雌激素受体β对雌激素诱导人成骨样细胞护骨素表达的影响

RNA干扰敲低人成骨样细胞株MG63中雌激素受体β后，RT-PCR法发现不同浓度的17β-雌二醇均能上调MG63细胞中的护骨素mRNA表达水平，其中以10^-7mol／L的作用最强。而这种作用不能被G蛋白抑制剂suramin所抑制。提示雌激素受体β可能不涉及雌激素上调MG63细胞护骨素表达的调控作用。     

脂联素调控人成骨细胞OPG/RANKL表达的信号转导机制

目的 研究脂联素调控人成骨细胞护骨素(OPG)和NF-кB受体活化凶子配体(RANKL)表达的作用机制.方法 人成骨细胞OPG和RANKL mRNA的表达以实时PCR检测,p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、c-Jun氨基端激酶(JNK)的磷酸化水平用Western印迹法检测.廊用小分子RNA干扰技术(siRNA)阻断脂联素受体(AdR)表达,并以p38 MAPK抑制剂(SB203580)和JNK抑制剂(SP600125)干预,以观察脂联素对人成骨细胞OPG/RANKL作用的调节机制.结果 用siRNA沉默AdRl的表达可消除脂联素促进人成骨细胞RANKL表达和抑制OPG表达的作用;脂联素干预前予SB203580阻断p38 MAPK后,也可消除脂联素对成骨细胞RANKL和OPG的作用,而SP600125并无作用.结论 在人成骨细胞中,脂联素通过AdR1/p38 MARK途径促进RANKL表达和抑制OPG的表达.     

尼尔雌醇对人成骨样MG63细胞护骨素和骨钙素基因表达的影响

目的　研究尼尔雌醇对人成骨样MG63细胞护骨素 (OPG)、骨钙素 (BGP)基因表达的影响。方法　MG63细胞以不同浓度的尼尔雌醇及雌激素受体纯拮抗剂ICI 182 780分别干预 2 4h、48h及 72h ,用半定量RT PCR法检测OPG、BGPmRNA的表达量。结果　尼尔雌醇可上调MG63细胞OPGmRNA的表达 ,并存在剂量依赖和饱和效应 ,其中以 10 -8mol/L的作用最强。而且OPGmRNA表达有时间依赖性 ,以 48h表达量为最高。尼尔雌醇未显示对MG63细胞BGPmRNA表达的影响。结论　尼尔雌醇上调MG63细胞OPGmRNA表达是其作为抗骨质疏松药物的重要机制。     

蛇床子素骨靶向药物对体外培养大鼠成骨细胞护骨素、核因子-κB受体活化因子配基表达的影响

目的观察蛇床子素骨靶向药物(NSC-OST)对体外培养的大鼠成骨细胞(OB)护骨素(OPG)及核因子κB受体活化因子配基(RANKL)表达的影响。方法不同浓度的NSC-OST作用于成骨细胞7 d,采用ELISA法检测成骨细胞OPG、RANKL的表达。结果终浓度为10-6mmol/L和10-5mmol/L组促进成骨细胞OPG的表达作用高于空白对照组(P<0.01);10-7、10-6mmol/L和10-5mmol/L组具有抑制大鼠成骨细胞表达RANKL的作用(P<0.01);终浓度为10-6、10-5mmol/L的NSC-OST可显著上调OPG/RANKL的比值(P<0.01)。结论适当浓度的NSC-OST可促进成骨细胞OPG的表达,抑制RANKL分泌,上调OPG/RANKL的比值。     

护骨素与骨质疏松症

护骨素是近年发现的肿瘤坏死因子家族的新成员,具有抑制破骨细胞分化及骨吸收活性的一种分泌型糖蛋白。护骨素与NF-κB受体活化因子配体和NF-κB受体活化因子之间竞争性结合机制是调控破骨细胞分化、增殖、凋亡及发挥作用过程中最重要的信号通路。护骨素是偶联成骨细胞、基质细胞和破骨细胞分化、活化与生物活性的主要细胞因子,对骨形成和骨吸收起重要调节作用,对骨质疏松的发病机制和治疗有着重要影响。     

护骨素与血管钙化

护骨素(osteoprotegerin,OPG,骨保护素,骨保护蛋白)于1997年由Simonet WS等在对大鼠小肠cDNA测序分析时首次发现,因其具有抑制骨吸收作用而得名。它属于肿瘤坏死因子受体家族成员,人类OPG mRNA分布广泛,肝、心、肺、肾、小肠、皮肤、脑、骨髓和骨骼、血管细胞(动脉中层平滑肌细     

雌激素受体-β基因多态性对广西壮族绝经后妇女血清护骨素的影响

目的了解广西壮族绝经后妇女雌激素受体-β基因多态性对其血清护骨素及骨密度(BMD)的影响。方法对667例广西壮族绝经妇女采用定量超声骨质密度仪检测其右跟骨BMD,早晨空腹采肘静脉血5 ml,PCR-RFLP检测雌激素受体-β基因多态性,用酶联免疫吸附试验测定各基因型对应的血清护骨素。结果而60岁后绝经晚期雌激素受体-βRsa I酶切的r等位基因与同年龄组其他4个基因组比较,护骨素和BMD明显降低(P<0. 05); 65岁后绝经晚期雌激素受体-βAlu I酶切的aa等位基因与同年龄组其他4个基因组比较,护骨素和BMD明显提高(P<0. 05)。结论绝经后骨质疏松防治方面,应该根据雌激素受体不同基因型,采取个体化防治,提高防治效果。     

破骨样细胞中骨保护素和NF-κB配体受体的表达及其意义

目的探讨破骨样细胞中骨保护素(OPG)和NF-κB配体受体(RANKL)表达情况。方法单独培养骨髓单核细胞前体,用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和维生素D诱导其转化为破骨样细胞,在0、5、10、15 d用光镜观察和TRAP染色(抗酒石酸染色)评估破骨样细胞的转化程度,用RT-PCR检测OPG和RANKL的表达情况;然后构建主动脉中膜平滑肌细胞(SMC)与骨髓单核细胞前体共培养的模型,用维生素C和β-磷酸甘油诱导SMC转化为成骨样细胞,并在0、5、10、15 d用同样方法再次检测共培养中破骨样细胞转化的情况,以及两种细胞中OPG和RANKL的表达情况。结果不管是单独培养、还是共培养,破骨样细胞中始终没有OPG和RANKL的表达。结论破骨样细胞的转化可能主要受成骨样细胞分泌的OPG和RANKL调控,本身并没有分泌OPG和RANKL进行自身调节的机制存在。     

雌激素膜快速效应对人成骨样细胞MG63 OPG mRNA快速表达水平的影响

目的 探讨17β-雌二醇(E2)膜快速效应对人成骨样细胞MG63的OPG mRNA快速表达水平影响.方法 采用RT-PCR法分析经E2快速作用后的MG63细胞中OPG mRNA的表达水平.结果 E2膜快速效应能诱导人成骨细胞MG63 OPG mRNA表达水平出现一个快速增高现象,其表达高峰时间为E2作用后的10 min左右,而且这一现象能被G蛋白藕联抑制苏拉明所抑制.结论 而E2诱导的人成骨样细胞MG63中OPG mRNA表达水平的快速增高,可能与雌激素启动了雌激素膜受体介导的G蛋白藕联受体调节的磷脂酶C/腺苷酸环化酶通路有关.     

BMP-4与17β-雌二醇对MBA-1细胞护骨素表达的影响

目的 探讨骨形态生成蛋白-4（BMP-4）与17β-雌二醇对小鼠骨髓基质细胞株MBA-1细胞护骨素表达的影响.方法 用BMP-4及17β-雌二醇干预MBA-1细胞后,用R T-PCR和Western印迹检测护骨素表达的变化.结果 在无BMP-4或17 β-雌二醇干预的情况下,MBA-1细胞在自身分化成熟过程中伴有护骨素的表达增加;经BM P-4与17β-雌二醇干预后可上调MBA-1细胞护骨素表达增加.结论 B MP-4 与17β-雌二醇可上调MBA-1细胞护骨素表达,从而诱导MBA-1细胞向成骨细胞方向分化.     

淫羊藿次甙Ⅱ对小鼠成骨细胞护骨素表达的影响

以17β-雌二醇为阳性对照组,观察不同浓度淫羊藿次甙Ⅱ对成骨细胞护骨素(OPG)表达的影响,结果发现20.ng/dl淫羊藿次甙Ⅱ上调成骨细胞OPGmRNA的表达,且优于阳性对照组(P<0.05),淫羊藿次甙Ⅱ也显著增加成骨细胞OPG分泌水平,20 ng/dl淫羊藿次甙Ⅱ组的促分泌活性显著优于阳性对照组,提示淫羊藿次甙Ⅱ作为淫羊藿甙在体内的主要代谢产物,在体外较低剂量即可显著促进成骨细胞OPG的表达,具有良好的抗骨质疏松作用.

Abstract：

To explore the effect of icariside ? on osteoprotegerin(OPG) expression in osteoblasts, primary osteoblasts were cultured with different concentration of icariside ? and 17?estradiol. As a major metabolite of icarrin in vivo, icariside ? exerted a better effect on OPG expression which plays a key role in osteoporosis. 20 ng/dl icariside ? also exerted better effect on OPG secretion than that of positive control group. Consequently, icariside ?could be a candidate for osteoporosis treatment.