重组apo（a）KringleⅥ—10的纯化及生物活性

目的：通过研究重组apo(a)KringleⅣ-10（KⅣ-10）的赖氨酸结合能力对纤溶酶原与内皮细胞结合的影响。探讨apo(a)在抑制纤溶过程中的作用，为La(a)致动脉粥样硬化机制研究提供依据。方法：将含apo(a)野生型KⅣ-10（wt-KⅣ-10/Trp^72)和突变型KⅣ-10(mut-KⅣ-10/Arg^72)基因片段的重组质粒，分别转化至E.coliDH5α菌株中并表达含这2个重组片段的融合蛋白，通过Glutathione-garose beads亲和层析进行分离和提纯，经L-Lys-Sepharose4B亲和层析检测其赖氨权结合能力。再以异硫氰酸荧光素标记的纤溶酶原为配基，观察这2种基因表达片段对纤溶酶原与人脐静脉内皮细胞结合的影响。结果：实验结果显示；在E.coliDH5α菌株中表达的GST-wt-KⅣ-10/Trp^72能有效抑制纤溶酶原与人脐静脉内皮细胞的结合；而GST-mut-KⅣ-10/Arg^72在任一浓度范围内均无这种抑制作用。结论：apo(a)KⅣ-10对纤溶的抑制作用与其赖氨酸结合能力密切相关；而KⅣ-10的赖氨酸的结合能力与其赖氨酸结合位点中的Trp^72有关。     

重组人apo(a)kringle Ⅳ-10的融合表达及性质鉴定

目的 :探讨人血浆脂蛋白 (a)的赖氨酸结合功能的结构基础。方法 :利用基因重组质粒在Ecoli菌株中表达野生型和变异型apo(a)KringleⅣ_10的GST融合蛋白 ,经Glutathione_Agrose亲和层析纯化 ,通过Lys_Sepharose亲和柱检测它们的赖氨酸结合能力。结果 :野生型kringleⅣ_10的融合蛋白具有较强的赖氨酸结合能力 ,而变异型kringleⅣ_10的融合蛋白则无此功能。结论 :apo(a)kringleⅣ_10的Trp 72对其赖氨酸结合能力有关键作用。     

人纤溶酶原K5突变体Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

[目的]构建人纤溶酶原Kringle 5(K5)的突变体Cys461-Cys540(K5 mut1),在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,为探讨K5抗血管增生活性与Kringle结构域的关系提供基础.[方法]以K5全长cDNA为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原K5mutl基因,将其克隆进表达载体pET-22b( )中,并用限制性核酸内切酶酶切和DNA测序鉴定其连接正确;pET-22b( )/K5 mut1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物用固化Ni2 -His Bind Resin亲和层析方法纯化,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot方法分析鉴定.[结果]PCR扩增获得258 bp的人纤溶酶原K5 mutl基因片段,正确插入pET-22 b( )载体,在大肠杆菌中该基因编码蛋白的表达量占菌体总蛋白13%左右;SDS-PAGE显示其相对分子质量M1≈14.1×103,Western blot证实该表达蛋白为K5 mut1重组蛋白,经亲和层析后K5 mut1重组蛋白纯度大于90%,获得率约为10 mg/L.[结论]成功构建人纤溶酶原K5 mut1,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得较高纯度K5 mut1重组蛋白.     

人纤溶酶原Kringle 5区的基因克隆的表达及纯化

目的克隆人纤溶酶原Kringle5(K5)区基因,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定.方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因,构建K5的原核表达载体pET-22b(+)-K5-6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+-树脂亲和层析进行纯化,通过血管内皮细胞增殖抑制试验检测蛋白活性.结果经PCR成功扩增出了243 bp的K5区基因,测序正确后克隆进大肠杆菌分泌型表达载体pET-22b(+),重组质粒在BL21中成功表达出分子量为14 000的蛋白质,纯化后的蛋白纯度达95%,具有抑制血管内皮细胞增殖活性的功能,K5蛋白浓度为4 μg/mL时抑制率达50%.结论纤溶酶原K5的成功克隆、表达及纯化可能在肿瘤和动脉粥样硬化的抗血管生成治疗中具有一定作用.     

人纤溶酶原Kringle 5区的基因克隆的表达及纯化

目的克隆人纤溶酶原Kringle5(K5)区基因,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定.方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因,构建K5的原核表达载体pET-22b(+)-K5-6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+-树脂亲和层析进行纯化,通过血管内皮细胞增殖抑制试验检测蛋白活性.结果经PCR成功扩增出了243 bp的K5区基因,测序正确后克隆进大肠杆菌分泌型表达载体pET-22b(+),重组质粒在BL21中成功表达出分子量为14 000的蛋白质,纯化后的蛋白纯度达95%,具有抑制血管内皮细胞增殖活性的功能,K5蛋白浓度为4 μg/mL时抑制率达50%.结论纤溶酶原K5的成功克隆、表达及纯化可能在肿瘤和动脉粥样硬化的抗血管生成治疗中具有一定作用.     

Effects of wild-type (Trp72) and mutant (Arg72) apolipoprotein(a) kringle IV-10 on the proliferation of human arterial smooth muscle cells

Objective To assess the atherogenicity of lipoprotein(a), the effect of the heterogeneity of lysine binding of apolipoprotein(a) ［apo(a)］, a plasminogen-like glycoprotein component on the proliferation of human arterial smooth muscle cells (SMCs).Methods Both wild type (wt) Trp72 and mutant (mut) Trp72Arg forms of apo(a) kringle IV-10 were expressed by employing a GST-gene fusion system into E. coli. The proliferation of SMCs was determined by flow cytometry and MTT colorimetry. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) assay was used to detect the active form of transforming growth factor β1　(TGF-β1).Results Apo(a) wt-kringle IV-10 that has lysine binding properties possessed a growth-stimulating activity to SMCs on a dose-dependence manner by stimulating cells in the G1/G0 phase of cell cycle to S and G2/M phase, and reduced significantly the amounts of endogenous active TGF-β1 in culture when compared with the control medium and the GST group (2.4±0.5 vs 8.6±1.6 and 9.1±1.7 ng/ml, P<0.0?). The growth-stimulating effect of apo(a) mut-kringle IV-10 deficient in lysine binding was negligible. Conclusions Apo(a) induces SMCs growth by inhibiting the activation of latent TGF-β1, an activity that may involve the ability of apo(a) kringle IV-10 to bind lysine. The mitogenic effect of apo(a) wt-kringle IV-10 on SMCs might play an active role in the atherogenic function of lipoprotein(a).     

重组人纤溶酶原k1-3基因转染对血管内皮细胞的作用研究

目的 观察脂质体介导人纤溶酶原k1-3基因转染人脐静脉内皮细胞导致细胞凋亡和移动抑制的效应,初步探讨k1-3基因的抗血管生成机制.方法 以阳离子脂质体介导人纤溶酶原k1-3基因真核表达载体pcDNA-k13转染体外培养人脐静脉内皮细胞,经细胞凋亡检测和移动抑制试验,比较对照组和实验组的凋亡率和抑制率.结果 转染pcDNA-k13组有明显的细胞凋亡效应和移动抑制.结论 人纤溶酶原k1-3基因在人血管内皮细胞表达,并可能通过诱导细胞凋亡及抑制细胞迁移而抑制肿瘤新生血管的生成.     

血管抑素的制备

0 引言血管抑素(angiostatin,AS)是肿瘤源性血管生成抑制因子,相对分子质量(Mr) 38 000[1]. AS包括纤溶酶原(plasminogen, Pgn)的前四个Kringle结构,每个Kringle上均有特异的赖氨酸结合位点,因此可利用亲和层析的方法从血浆中提取AS.……     

登革病毒诱导血管内皮细胞凝血和纤溶系统相关分子变化

目的为研究登革病毒感染血管内皮细胞所引起的凝血和纤溶分子表达变化.方法应用D2V感染生长良好的第2、3代脐静脉内皮细胞以观察内皮细胞在表达组织纤溶酶原激活物(tPA)、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)、凝血酶调节蛋白(TM)等分子变化.结果D2V可以显著上调内皮细胞的t-PA的表达并显著提高血浆可溶性凝血酶调节蛋白(sTM)和IL-6水平,而不影响PAI-1.抗IL-6抗体抑制D2V感染对内皮细胞表达t-PA和sTM的增强效应.结论血管内皮细胞是D2V的靶细胞之一,D2V可以诱导内皮细胞表达t-PA和IL-6并提高血浆中sTM水平,IL-6能有效地增强D2V诱导的纤溶和抗凝分子表达,高水平的t-PA和sTM可诱导纤溶亢进和抗凝效应增强,在IL-6诱导血管内皮细胞渗透性升高的前提下,有助于DHF/DSS患者出现血浆渗漏、血容量丢失甚至出血.     

人胎盘纤溶酶原的分离纯化

目的 建立从人胎盘组织中分离纯化天然型纤溶酶原的方法.方法 采用Lys-sepharose 4B亲和层析和 Sephadex G-25层析法分离纯化纤溶酶原.采用发色底物法测定纤溶酶原活性,SDS-PAGE鉴定纤溶酶原纯度.结果 获得电泳纯天然型纤溶酶原(Glu-plg),比活441.520%/mg.结论 该法原料来源丰富、成本低廉、操作简单,为获取纤溶酶原提供了新方法.     

不同培养条件对人脐静脉内皮细胞分泌t-PA及PAI-1抗原的影响

目的观察不同培养条件对内皮细胞(EC)纤溶活性的影响.方法用ELISA法测定人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养上清液中的纤溶酶原激活物(t-PA)及I型纤溶酶原灭活剂(PAI-1)总抗原,观察不同代EC分泌t-PA,PAI-1抗原的变化,以及不同血清浓度对两种抗原含量的影响.结果传代和血清均可刺激PAI-1抗原的合成分泌;HUVEC 在第3～4代分泌PAI-1抗原量相当;10%血清浓度时PAI-1抗原含量最高.结论传代和不同浓度血清可影响HUVEC分泌PAI-1抗原,但不影响t-PA抗原的分泌.     

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者血管内皮细胞、纤溶系统及抗凝血功能变化

目的　探讨阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征 (OSAHS)患者血管内皮细胞、纤溶系统及抗凝血功能变化。方法　选择年龄、性别、体重指数 (BMI)无明显差异的OSAHS患者 63例和健康查体者 56例 ,用多导睡眠呼吸监测仪进行监测 ,以Clauss法测定纤维蛋白原 (Fg) ,以发色底物法测组织纤溶酶原激活物活性 (t-PA :A)、纤溶酶原激活物抑制物 - 1活性 (PAI- 1 :A) ,抗凝血酶 -Ⅲ活性(AT -ⅢA) ,以酶联免疫法测vonWillebrand因子 (vWF)、组织纤溶酶原激活物抗原 (t-PA :Ag)、纤溶酶原含量 (PLg:Ag)和纤溶酶原激活物抑制物 - 1含量 (PAI- 1 :Ag)。以免疫火箭电泳法测抗凝血酶 -Ⅲ抗原 (AT -ⅢAg)。 结果　OSAHS组与对照组比较vWF、Fg、PAI - 1 :A、PAI- 1 :Ag明显升高 (P分别 <0 .0 0 1 ,0 .0 5 ,0 .0 1 ,0 .0 5) ,AT -ⅢAg、AT -ⅢA、PLg :Ag、t -PA :Ag明显降低 (P分别<0 .0 1 ,0 .0 5 ,0 .0 5 ,0 .0 5)。结论　OSAHS患者血管内皮细胞受损 ,纤溶及抗凝血功能减弱。     

人纤溶酶原饼环区5基因的化学合成与原核载体的构建

0　引言　抑制肿瘤新生血管生长可以抑制肿瘤生长 ,这是目前肿瘤治疗中新发展的治疗途径 .血管生长抑制因子是由纤溶酶原中的前四个饼环区构成的 ,具有抑制肿瘤新生血管进而达到抑制肿瘤的作用 [1 ] .研究表明 ,纤溶酶原饼环区 5 (简称 K5 ,下同 ) ,具有比血管生长抑制因子更佳的抑制肿瘤新生血管生长的作用 [2 ] .我们将人工合成的人纤溶酶原 K5 基因的 8段核酸片段组成为一个完整的 K5 基因 ,并连入原核载体中获得成功 .1　材料和方法1 .1　材料　 p GEM3zf(- )质粒 ,JM1 0 9菌种由本室保存 ,T4多核苷酸激酶为 MBI公司产品 ,Bam HI,…     

脂蛋白(a)是动脉粥样硬化的遗传标志吗?

在脂质成分中,脂蛋白(a)[LP(a)]与低密度脂蛋白(LDL)相类似,但LP(a)的密度及分子量较大。它独特的免疫学特征是由脱辅基脂蛋白(a)[Apo(a)]所决定。apo(a)至少有7种同分异构体,分子量的差别大约为50000。该多形性似乎是由于类似apo(a)基因中血纤维蛋白溶酶原的 Kringle Ⅳ单位的各种不同重复单位的可变数目所决定。每个人似乎均有apo(a)基因。     

通过调控载脂蛋白（a）基因表达降低脂蛋白（a）血浆水平

脂蛋白（a）是1963年由Berg等[1]从血浆中分离出来的一种与低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）相似的蛋白质.与LDL相比,脂蛋白（a）具有更强的氧化活性及致炎作用,因此其致动脉粥样硬化（As）的能力更强[2-3].这与其分子组成密切相关.脂蛋白（a）是由载脂蛋白B100[apolipoprotein B100,apo B100]和富含神经氨酸的糖蛋白apo（a）[apolipoprotein（a）,apo（a）]通过二硫键共价结合而成[1,4].脂蛋白（a）的致病作用主要源于其脂质成分和apo（a）,前者可以增加胆固醇在动脉壁沉积和LDL胆固醇的氧化易感性,后者由于其结构和纤溶酶原高度同源,可以竞争性抑制纤溶酶原的激活从而干预纤维蛋白溶解,加速血栓形成[5-6].研究显示血浆中脂蛋白（a）的水平主要由遗传所决定,在不同的人种中变化较大,但不受年龄、性别及饮食的影响[7],高脂蛋白（a）被认为是引起心血管疾病独立的危险因素.因此,降低高脂蛋白（a）血症患者中的血浆中脂蛋白（a）浓度成为防治心血管疾病发生发展的重要策略.但目前还缺乏专一有效的方法.…… 基金项目：国家自然科学基金（81070221）.     

人纤溶酶原K5区基因真核表达载体的构建和活性鉴定

目的 构建含人纤溶酶原K5区基因的真核表达载体，转染人乳腺癌细胞株MDA—MB—231，观察阳性克隆表达的K5蛋白对人脐静脉内皮细胞株ECV304和MDA—MB—231细胞增殖的影响。方法 应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5cDNA，所得的目的片段与真核表达载体pcDNA3重组，构建重组质粒poDNA3K5，脂质体法将其转染MDA—MB—231，G418筛选阳性克隆，PCR鉴定，RT-PCR和Western blot检测K5的表达。将鉴定正确的阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞，MTT、法检测其增殖情况，并用MTT法检测转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖的影响。结果 构建的重组质粒pcDNA3K5经酶切鉴定、测序正确，将其转染MDA-MB-231后挑取的阳性克隆有3个经PCR鉴定正确，并经RT-PCR和Western blot检测证实K5的表达。阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞后，其存活率降低；转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖无明显影响。结论 应用脂质体法将带有人纤溶酶原信号肽序列的K5cDNA转染MDA-MB-231细胞后，其分泌产生的有生物学活性的K5，呈现对ECV304细胞增殖的抑制作用，而对MDA-MB-231细胞的生长则无影响。     

氨氯地平对溶血磷脂酰胆碱致培养人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

①目的　探讨氨氯地平对溶血磷脂酰胆碱致培养人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用。②方法　采用培养的人脐静脉血管内皮细胞 ,观察氨氯地平对溶血磷脂酰胆碱所致培养人脐静脉内皮细胞产生和分泌一氧化氮 (NO)及其合酶 (eNOS)、组织型纤溶酶原激活物 (t PA)、纤溶酶原激活物抑制物 (PAI 1)及乳酸脱氢酶活性变化的影响。③结果　溶血磷脂酰胆碱明显增加上清液中乳酸脱氢酶活性 ,提高细胞死亡率 ,增强PAI 1的活性 ,抑制eNOS及t PA的活性 ,与对照组比较差异有显著意义 (F =17.93～ 88.6 8,q =4 .0 1～ 2 0 .88,P <0 .0 5 )。而氨氯地平对溶血磷脂酰胆碱致培养人脐静脉内皮细胞损伤具有保护作用 (F =6 .34～ 11.2 2 ,q =5 .33～ 13.2 2 ,P <0 .0 5 )。④结论　氨氯地平对溶血磷脂酰胆碱致培养人脐静脉内皮细胞损伤具有保护作用     

X线交错互补修复基因1多态与内蒙古人群肾癌易感性关系的研究

目的:探讨人类DNA修复基因XRCC1 Arg194Trp单核苷酸多态性与内蒙古人群患肾癌易感性的关系.方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性的方法检测76例肾癌患者及82例正常人群基因XRCC1194的多态性.分析各基因型与肾癌发生的关系.结果:研究结果显示XRCC1194肾癌组基因型分布频率为Arg/Arg50%、Arg/Trp 38%、Trp/Trp12%,健康对照组为Arg/Arg 56%、Arg/Trp34%、Trp/Trp10%、两组之间无差异(P>0.05).结论:本研究尚未发现内蒙古地区人群中XRCC1的基因Arg194Trp多态性与肾癌的发病有相关性.     

纤溶酶原Kringle 5缺失突变体抑制血管内皮细胞增生的研究

目的纤溶酶原蛋白水解片段Kringle 5(K5)具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值,但是K5已获得美国专利。本研究应用基因突变和基因重组技术获得缺失突变型(K5Mut1)并检测其体外活性。方法除去K5外环两端的N端和C端15个氨基酸残基以降低其相对分子质量,但同时保留K5分子中的所有3个二硫键以保留完整的外环结构域,并在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,获得突变型K5 Mut1 (Cys1-80);MTT法分析突变型K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞和周皮细胞的抑制作用。结果K5 Mut1以浓度依赖的方式抑制原代培养的视网膜内皮细胞,EC50(抑制50%细胞增生的药物浓度)约为35 nmol/L,是完整K5活性的2倍。在同样浓度范围内,K5 Mut1并不抑制同源的周皮细胞,表明K5 Mut1特异性抑制血管内皮细胞增生。结论K5 Mut1是一种比K5作用更强的血管增生抑制因子,在糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性和实体肿瘤等血管增生性疾病的治疗中具有潜在的应用价值。     

纤溶酶原Kringle5缺失突变体抑制血管内皮细胞增生的研究

目的 纤溶酶原蛋白水解片段Kringle5(K5)具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值，但是K5已获得美国专利。本研究应用基因突变和基因重组技术获得缺失突变型(K5Mutl)并检测其体外活性。方法 除去K5外环两端的N端和C端15个氨基酸残基以降低其相对分子质量，但同时保留K5分子中的所有3个二硫键以保留完整的外环结构域，并在大肠杆菌中表达，亲和层析纯化，获得突变型K5Mutl(Cysl-80)；MTT法分析突变型K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞和周皮细胞的抑制作用。结果 K5Mutl以浓度依赖的方式抑制原代培养的视网膜内皮细胞，EC50(抑制50％细胞增生的药物浓度)约为35nmol／L，是完整K5活性的2倍。在同样浓度范围内，K5Mutl并不抑制同源的周皮细胞，表明K5Mutl特异性抑制血管内皮细胞增生。结论 K5Mutl是一种比K5作用更强的血管增生抑制因子，在糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性和实体肿瘤等血管增生性疾病的治疗中具有潜在的应用价值。