链霉素耐药结核分枝杆菌rpsL、rrs基因突变分析

目的：探讨链霉素耐药相关基因rpsL、的突变与链霉素耐药性的关系。方法：采用PCR和PCR～DS技术对66株临床分离株进行rpsL、rrs基因检测和序列分析。结果：常规药敏实验显示20株为链霉素敏感株，46株为链霉素耐药株。20例敏感株中未发现2个基因突变，46株耐多药临床分离株中rpsL 67％，rrs基因突变率为37％，两种基因同时突变率为2％。结论：PCR—DS对耐链霉素结核分枝杆菌的检出率较高，与传统药敏试验互补，对临床耐药性检测和用药有指导意义。     

临床分离结核分枝杆菌耐药性质与rpoB、rpsL基因变异的研究

目的:对从疑似结核病患者痰液中分离的结核分枝杆菌的rpoB和rpsL基因突变情况进行研究,分别探讨其与耐利福平(RFP)和耐链霉素(SM)之间的关系.方法:采用PCR和DNA测序法对结核分枝杆菌临床分离株和1株卡介苗株(BCG)的rpoB和rpsL基因进行序列分析.结果:分离得到耐利福平27株,耐链霉素25株,经测序分析,所有利福平、链霉素敏感株rpoB、rpsL基因均未发生氨基酸突变;RFP和SM耐药株rpoB和rpsL基因的突变率各为81.5％(22/27)和76％(19/25);耐利福平以Ser531Leu突变最为常见,突变频率为55.6％(15/27),耐链霉素以Lys43Arg位突变最为常见,突变频率为72.0％(18/25).结论:rpoB和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌RFP和SM耐药性产生的主要分子机制,PCR-DNA测序法可快速检测结核分枝杆菌RFP和SM耐药性.     

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌L型rpsL耐药基因

目的 探索尘肺结核患者感染的结核分枝杆菌（MT）L型的耐药基因rpsL突变与耐受链霉素（SM）的关系。方法 用PCR—SSCP方法检测rpsL基因,与采用常规SM药敏试验（AST法）的结果进行对比分析。结果 采用AST法检测,52株结核分枝杆菌L型临床分离株中共有26株（50．0％）耐SM;PCR-SSCP法检出rpsL基因突变率为40．4％（21／52）,2种方法检测耐药株的符合率为80．8％。结论 结核杆菌L型对SM的耐药与rpsL基因突变有关。     

痰耐药结核分支杆菌rpsL基因的快速检测及链霉素耐药机制研究

[目的]快速检测痰耐药结核分支杆菌rpsL基因及了解链霉素（SM）耐药的分子机制。[ 方法]用PCR方法直接从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpsL基因片段,对扩增获得的rpsL基因片段进行序列测定,比较分析全耐、对SM耐药的耐多药、对SM敏感的耐多药、全敏感或标准结核分支杆菌株之间的基因序列差异。[结果]于6h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpsL基因。从所有临床分离菌珠均扩增获得267bp片段,序列测定比较发现,全耐菌和对SM耐药的MDR—TB菌株均检测有rpsL基因点突变,突变密码子为CCT突变为CTT,而全敏感株和标准菌株均未检测到基因突变。其中从一株对SM敏感的MDR-TB中也检测到突变。[结果]PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分支杆菌rpsL基因及其突变,结核分支杆菌对EMB的耐药性与rpsL基因点突变有关。     

结核分枝杆菌耐药基因突变的研究

结核病在许多国家出现回升的一个主要原因是细菌耐药性问题 ,随着联合药物治疗的使用 ,又出现了耐多药结核分枝杆菌 (结核菌 ) ,使许多结核病 ,难以治疗 ,增加了死亡率[1] 。目前对于结核菌的耐药机制的研究已有了较大的进展 ,细菌内一些酶的基因突变或缺失是导致耐药的重要原因。随着分子生物学技术的发展 ,通过聚合酶链反应 (PCR)等方法对耐药基因进行快速检测 ,大大缩短了检测时间 (2～3d) ,为耐药结核菌的治疗提供参考。本研究通过PCR -SSCP ,PCR -测序技术检测结核菌临床分离株的katG、rpoB和rpsL基因序列 ,分析济南军区结核菌…     

耐药结核分枝杆菌链霉素耐药基因的分子流行病学研究及其快速检测

目的探讨结核分枝杆菌对链霉素的耐药分子机制，建立基于焦磷酸测序（pyrosequencing）技术的快速检测结核分枝杆菌链霉素耐药性的方法。方法用扩增后直接测序的方法检测了150株结核分枝杆菌链霉素耐药株的rpsL基因，并用pyrosequencing技术对其中20株的rpsL基因43位密码子进行了检测。结果150株链霉素耐药株中2株rpsL基因缺失，115株rpsL基因存在突变，突变率为77．7％，最主要的突变形式是43位密码子突变，pyrosequencing的检测结果与测序结果相符。结论rpsL基因突变是产生链霉素耐药的重要分子机制，pyrosequencing技术具有快速、准确等特点，适用于对耐链霉素结核分枝杆菌进行快速高通量的检测。     

结核分支杆菌利福平和链霉素耐药基因的快速检测

目的 :评估采用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分支杆菌耐链霉素 (SM )和利福平 (RFP)耐药性测定中的应用价值。方法 :采用PCR SSCP技术对 86株结核分支杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rp sL基因 ,然后进行SSCP分析。结果 :以结核分支杆菌H3 7RV为对照 ,41株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为 10 0 %。 45株同时耐链霉素和利福平的耐药株中 ,3 4株 (75 6% )有rpsL基因图谱异常 ;41株 (90 1% )有rpoB基因图谱异常。结论 :rpoB基因突变和rpsL基因突变与结核分支杆菌耐利福平和链霉素密切相关 ,应用PCR SSCP技术可同时快速检测结核分支杆菌对链霉素和利福平耐药性。     

耐药结核分枝杆菌基因突变分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药表型与基因突变位点之间的相互关系.方法 采用序列特异性引物分别扩增92株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB,异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC,链霉素耐药基因rrs、rpsL,乙胺丁醇耐药基因embB及喹诺酮耐药基因gyrA,SSCP筛选出突变序列,DNA测序分析突变性质.结果 59株利福平耐药株rpoB基因突变检出率94.9%(56/59),以Ser450Trp突变最多;90株异烟肼耐药株中,katG基因突变检出率38.9%(35/90),以Ser315Thr最多,3株检出inhA基因突变,ahpC基因无突变检出;34株喹诺酮耐药株中gyrA基因突变检出率82.4%(28/34),主要为Asp94Gly,其次为Ala90Val;31株链霉素耐药株中,15株检出rrs突变,最常见为A514C和A1041G,10株发生rpsL Lys88Arg突变,总的链霉素基因突变检出率为77.4%(24/31);31株乙胺丁醇耐药株中embB 基因突变检出率19.4%(6/31),主要为Met306Val.结论 耐药结核分枝杆菌耐药情况较为严重,以DNA测序为基础的基因突变分析能快速有效地检测结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA、rrs、rpsL、embB 等耐药分子标识,显示了西安地区耐药性结核分枝杆菌的突变特点,为结核病的临床诊断和合理用药提供了实验依据.     

结核分枝杆菌364株耐药结果分析

目的：分析肺结核患者的耐药情况。方法：对沈阳市胸科医院2007-01/2008-05培养阳性的肺结核患者364例进行4种抗结核药物（异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇）的耐药性测定。结果：364株结核分枝杆菌的总耐药率为54.4%,其中初始耐药率为40.2%,获得性耐药率为69.7%;初始耐药率与获得性耐药率比较,差异有统计学意义（2χ=5.43,P〈0.05）。结论：沈阳地区结核病耐药严重,应采取有效的防控措施。     

耐药结核分枝杆菌基因变异研究

目的 研究多药结核分枝杆菌ｋａｉＧ、ｉｎｈＡ基因的变异机理。方法 用ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ基因片引物,聚合酶链反应扩增产物,克隆后制质粒、直接测定ＤＮＡ序列。结果 １５株耐异烟肼菌株均有ｋａｔＧ基因突变,主要为点突变,其中１４株有４６３位和３１５位ＡＡＰ２密码改变,在１８个耐异烟肼菌株中,全部出现基因ｉｎｈＡ 基因变异,主要为点突和人,以单个点变异主,各菌株变异不同,ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ基因同时出现变异     

检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的：建立聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，并评价共临床应用的价值。方法：依据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物，用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpoB基因片段；对扩得的rpoB基因片段做DNA SSCP分析，并随机测定rpoB片段的序列。结果：PCR从所有212株结核分枝杆菌中均扩得230bp片段135份抗酸染色阳性的痰标本中，有113份扩得阳性片段（83．7％），在SSCP分析中，140份经L－J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌，有130份有rpoB基因突变（符合率为92．9％），72份经L－J药敏试验检测为利福平敏感的菌，有67份的rpoB基因无突变（符合率为93．1％），测序分析发现57份经SSCP检测为突变的rpoB片段均有序列改变，10份经SSCP分析为无突变的有8份无序列改变，SSCP与测序结果的符合率为94．0％，在本研究的菌株中，耐多药结核病（MDR－TB）占76．4％（107／140），有92．5％（99／107）耐多药菌株经SSCP检测有rpoB突变。结论：建立的PCR－SSCP分析方法，是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性，并可作为MDR－TB判断的一个重要指标。     

银染单链构象多态性技术检测结核杆菌rpoB基因突变

目的探讨分子生物学方法在临床标本结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性评估中的应用价值。方法设计针对ｒｐｏＢ基因１８３ｂｐ扩增引物,运用聚合酶链反应单链构象多态性分析（ＰＣＲＳＳＣＰ）银染色方法,检测了４５株结核杆菌临床分离株,并对其中部分菌株进一步做了ＤＮＡ序列分析。结果以药敏试验结果为对照,有１６株ＲＦＰ敏感株及２６株ＲＦＰ耐药株经ＳＣＰ方法得到检测,阳性占９３．３％,特异性１００％。对部分菌株１８３ｂｐ片断测序结果显示,ＲＦＰ敏感株无ｒｐｏＢ基因突变,耐药株均发生碱基突变,分别导致编码５３１及５２６位点的氨基酸改变。结论银染ＰＣＲＳＣＰ方法具有简便,快速,准确的特点,提高敏感性,可以对临床标本结核杆菌利福平耐药突变进行鉴定。序列分析证明结核分枝杆菌利福平耐药菌株有ｒｐｏＢ基因突变。     

结核分枝杆菌耐多药的基因研究

目的 探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系。方法 用聚合酶链反应和聚合酶链反应单链构象多态性分析对128株结分村以杆菌临床分离析耐利福平（rpoB)、链霉素（rpsL)和异烟肼（KatG）基因检测。结果 38株 敏感株中,各有1株（206%)测出rpoB、rpsL和KatG突变;90株耐多药析中,分别有81株（90.0%)、71株（78.9%)和63株（70.0%)测出rpoB、rpsL和KatG突变;有77株（85.6%)同时测出2种以上耐药基因突变;10株耐其他药物株中,仅有1株测出KatG基因突变。结论 85.6%的耐多药结核分枝杆菌存在2种以上耐药基因突变,且耐药基因突变率与耐药浓度有关。     

聚合酶链反应单链构象多态性和银染技术筛查胰岛素受体基因突变

目的建立聚合酶链反应单链构象多态性（ＲＣＲＳＳＣＰ）和银染技术筛查胰岛素受体基因突变方法。方法选择８９例非胰岛素依赖型糖尿病患者,ＰＣＲ扩增编码胰岛素受体酪氨酸激酶域的外显子（外显子１７～２１）,进行ＳＳＣＰ电泳,银染色后,对突变样品进行序列分析。结果发现１１例外显子１７和１例外显子２０的异常电泳条带,外显子１７的突变经顺序分析,为ＣＡＣ１０５８→ＣＡＴ１０５８的杂合和纯合多态性突变。结论ＰＣＲＳＳＣＰ结合银染技术是一种操作简便、经济、灵敏度高、适合于临床大样本基因突变筛查的方法。     

结核分支杆菌耐喹诺酮等四种耐药基因检测的临床应用和评价

目的：采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR—SSCP)检测结核分支杆菌耐药基因(rPOB、katG、rPSL和gyrA)，评估它的临床应用价值。方法：通过Bactec-960快速培养，利用PCR-SSCP和药物敏感试验了解96例肺结核病人结核分支杆菌耐药情况，分析临床治疗效果。结果：利福平、异烟肼、链霉素和喹诺酮类耐药率分别为59．4％、52．1％、62．5％和51．0％。分离株rPOB、katG、rPSL和gyrA基因突变率分别为57．3％、45，8％、58，3％和47．9％，药敏试验联合耐药基因检测指导治疗效果满意。结论：结核分支杆菌耐药与基因突变有关，耐药基因检测指导治疗是一种新探索，与药敏试验联合应用可互相弥补，可成为临床指导用药的好方法。     

应用多重PCR-单链构象多态性分析同时检测耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌

目的 探讨应用多重PCR-单链构象多态性分析(multiplexpulymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,multi-PCR-SSCP)方法快速、特异地同时快速检测结核分枝杆菌对异烟肼和利福平耐药性的效能.方法 根据结核分枝杆菌的inhA序列、katG序列、rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物.采用multi-PCR-SSCP技术,一次性检出耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌.新方法的有效性通过116株临床分离株(70株耐异烟肼,66株耐利福平)的验证.结果 名 Multi-PCR-SSCP方法检测临床分离株基因突变的有效性,以细菌培养和药敏试验结果为金标准.116株临床分离株和H37Rv标准株中除了4株katG缺失突变,其余菌株3个基因katG、inhA和rpoB在单基因PCR中都扩增成功.与H37Rv标准株相比,46株katG基因突变,14株inhA基因突变,58株rpoB基因突变.38株katG和rpoB,4株inhA和rpoB,4株inhA和katG同时突变,还有2株3个基因都有突变.multi-PCR-SSCP对于耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌检出的敏感度分别为80%、82%,特异度分别为100%和92%.结论 multi-PCR-SSCP方法敏感、特异,能同时快速有效地检测耐多药结核分枝杆菌,有望成为临床指导用药的好方法,为深入研究耐药基凶检测奠定了良好的基础.     

耐多药结核分枝杆菌双组份系统反应调节子表达的研究

目的 检测MTB耐多药菌株和敏感菌株的TCS反应调节子的表达水平,以筛选出与MTB耐药相关的TCS。方法将7H9肉汤培养至对数生长期的MTB进行总RNA的提取和纯度鉴定;然后进行反转录,利用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测MTB的TCS反应调节子表达水平,以筛查出在耐多药菌株和敏感株中差异表达的TCS反应调节子。检测1NH、SM和LFA压力下这些差异表达的TCS反应调节子的表达水平。结果 与敏感菌株相比,在耐多药菌株中Rv0491、Rv3133c、Rv3143和Rv3246c分别上调表达1.03、7.11、3.48和1.37倍,差异有统计学意义（t或t'=5.623、-4.196、-3.559、-3.016,P＜0.01）。而其余反应调节子的表达在耐多药菌株和敏感菌株之间差异均无统计学意义。在抗生素压力下,Rv1027c、Rv3246c和Rv3143的表达明显升高,Rv0491和Rv3133c则变化不明显。结论Rv3246c和Rv3143的差异表达可能是MTB耐药的重要机制之一,可为新型抗结核药物的研制提供理论依据。     

探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变

目的 评价探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的应用价值,为临床检测提供指导依据.方法 613份痰标本于2009年9月至2010年4月收集自厦门市疾病预防控制中心、厦门市第一医院和漳州市疾病预防控制中心.结核分枝杆菌H37Rv标准株来源于国家结核病参比实验室.37株包含结核与非结核分枝杆菌的标准盘由中国药品生物制品检定所提供.首先采用梯度稀释的野生型标准株H37Rv DNA考察探针熔解曲线分析法的分析灵敏度,然后用标准盘验证其检测特异性,最后以测序法为对照方法,采用613份结核分枝杆菌的标本评价该方法的临床应用价值.结果 探针熔解分析法可检测到3拷贝/反应,且能特异检测结核分枝杆菌.613份结核分枝杆菌的检测结果显示,符合要求的583份标本的试剂盒检测结果与测序结果完全一致,其中embB306突变菌株数为34株,embB 378-380突变菌株数为23株,embB 406突变菌株数为3株,embB 497突变菌株数为3株.结论 探针熔解分析法检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变特异性好,灵敏度高,能有效地检测临床标本常见乙胺丁醇耐药突变位点,是值得推广的快速检测方法.

Abstract：

Objective To evaluate the potential use of a probe melting analysis (PMA) assay in detecting the embB mutations which confer resistance against ethambutol in Mycobacterium tuberculosis. Methods The analysis sensitivity and specificity of PMA were investigated by detecting a serially diluted H37 Rv DNA and a reference panel from National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Product. Six hundred and thirteen sputum samples were collected from the Xiamen Center for Disease Control and Prevention, Xiamen First Hospital and Center for Zhangzhou Disease Control and Prevention from September 2009 to April 2010. The PMA assay was then evaluated by detecting 613 clinical isolates and the results were compared with the sequencing results. Results The PMA assay could specifically detect Mycobacterium tuberculosis and had a limit of detection of 3 copies per reaction. The assay results with 613 clinical isolates showed that PMA gave a 100% concordance with sequencing in the 583 qualified samples, among which 34 were mutations at embB 306,23 at embB 378-380, 3 at embB 406 and 3 at embB 497. Conclusions PMA assay is a sensitive and specific method enabling efficient detection of common embB mutations causing ethambutol-resistance. The rapidness of this method together with its reliability would facilitate its use in routine testing.     

载脂蛋白E基因多态性检测技术的对比性研究

目的建立并比较载脂蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）基因多态性检测技术,为ＡｐｏＥ基因分型提供良好的方法。方法应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）和ＰＣＲ单链构象多态性（ＳＳＣＰ）检测技术对１１０例患者及相同人数的正常人进行ＡｐｏＥ基因型检测和分析。结果应用ＲＦＬＰ、ＳＳＣＰ技术测得正常对照组：ε２／２（０,０．０２０）,ε３／３（０．７００,０．７６０）,ε４／４（０,０．０４０）,ε２／３（０．１００,０．０６０）,ε２／４（０,０．０２０）,ε３／４（０．２００,０．１００）,ε２（０．０５０,０．０６０）,ε３（０．８５０,０．８４０）,ε４（０．１００,０．１００）。经χ２检验,ＡｐｏＥ基因型频率和等位基因频率的差异无显著意义（Ｐ＞０．０５）。上两种检测技术与既往两种检测技术（ＩＥＦ,ＷｅｓｔｅｒｐＢｌｏｔｉｎｇ）的结果经χ２检验,其ＡｐｏＥ等位基因频率的差异也无显著意义（Ｐ＞０．０５）,均符合中国汉族人ＡｐｏＥ基因频率分布。结论ＰＣＲＲＦＬＰ方法是一种稳定可靠的ＡｐｏＥ基因多态性分析方法,多重ＰＣＲＳＳＣＰ技术更加简便有效,使ＡｐｏＥ基因多态性的研究更加完善。