人肝癌多药耐药细胞中ERK5的表达

目的 检测人肝癌多药耐药细胞(hepG2/ADM和BEL-7402/5-FU)及亲本细胞(hepG和BEL-7402)中ERK5的表达,探讨其对肝癌细胞多药耐药的影响.方法 MTT法测定人肝癌多药耐药细胞株多种化疗药物的交叉耐药性,实时荧光定量PCR检测ERK5在人肝癌多药耐药细胞及亲本细胞中mRNA水平的表达,western-blotting检测ERK5蛋白水平的表达.结果 hepG2/ADM对ADM、5-FU 、CDDP的耐药指数分别为12.34、5.74、3.81;BEL-7402/ 5-FU对5-FU、VCR、OHP、MTX和ADM的耐药指数分别为15.32、10.08、5.85、6.74和3.26.与亲本细胞相比较,在hepG2/ADM细胞中ERK5 mRNA和蛋白表达均升高,而在BEL-7402/5-FU细胞中ERK5 mRNA表达降低,ERK5蛋白表达升高.结论 ERK5的表达与人肝癌多药耐药的发生密切相关,为逆转治疗肝癌细胞多药耐药研究提供了新思路.     

人肝癌5-脱氧-5-氟尿苷耐药细胞模型的建立及耐药机制探讨

目的 建立耐药肝癌细胞模型BEL-7402/5-脱氧-5-氟尿苷(5'-DFUR)并研究其耐药特性.方法 采用体外低浓度递增联合大剂量间断冲击的诱导方法建立耐药人肝癌细胞模型BEL-7402/5-DFUR细胞株.用MTT法检测该耐药细胞模型的多药耐药性,以流式细胞术检测该耐药模型细胞周期中的分布、细胞表面多药耐药基因(mdrl)的表达产物P-糖蛋白(P-gP)、bcl-2及谷胱甘肽S-转移酶-π(GST-TT)的表达等.结果 (1)经MTT法检测BEL-7402/5'-DFUR细胞较亲本细胞的5'-DFUR半数抑制浓度(IC50)增大12.9倍,并对多种抗癌药物产生耐药性.(2)耐药细胞S期细胞减少,G1、G2期细胞增多.(3)该耐药模型细胞表面mdrl的表达产物P-gP、Bcl-2非常显著升高,而GST-π表达无明显变化.结论 BEL-7402/5'-DFUR细胞是一个明确的多药耐药模型.具有耐药细胞的基本生物学特性,同亲本细胞相比,其IC50提高12.9倍.细胞内药物蓄积明显降低,细胞周期分布发生变化,其多药耐药性与P-gP-bcl-2的高表达有密切关系.     

人肝癌多药耐药细胞系BEL-7402/ADM的建立及耐药相关基因表达检测

目的：建立人肝癌多药耐药细胞系,研究其耐药特性及机制。 方法：应用人肝癌细胞株BEL-7402,采用阿霉素（ADM）大剂量间歇诱导法,建立多药耐药细胞系BEL-7402/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多药耐药基因(MDR)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH／GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平。 结果：BEL-7402/ADM对多种抗癌药物产生耐药,对ADM的耐药性(半数抑制浓度,IC₅₀)提高了17.31倍。流式细胞仪分析发现（65.5±5.8）%的BEL-7402/ADM细胞表面P-gp 表达阳性,而对照细胞BEL-7402表达仅为（31.3±4.3）%;（32.4±3.5）%的BEL-7402/ADM细胞表面MRP表达阳性,而对照细胞BEL-7402表达仅为（23.4±3.1）%,二者差异有显著性(P<0.01);BEL-7402/ADM和BEL-7402细胞的GSH／GST表达无明显变化（P>0.05）。RT-PCR检测发现BEL-7402/ADM中MDR及MRP mRNA高表达。 结论：BEL-7402/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因MDR及MRP mRNA表达升高。     

黄芩苷体外抑制氟尿嘧啶耐药肝癌细胞的生长及作用机制

目的:观察黄芩苷体外对氟尿嘧啶(Fu)耐药肝癌细胞株生长的影响,并探讨其可能的作用机制.方法:体外培养人肝癌细胞BEL-7402及其耐药细胞BEL-7402/5-Fu,MTT法观察黄芩苷作用后细胞增殖情况;流式细胞术测定细胞内罗丹明123荧光强度;RT-PCR检测细胞多重耐药MDR1基因表达;Western印迹法检测细胞P-gP蛋白表达;应用Matrigel模型测定细胞黏附率;荧光免疫技术测定细胞β1-整合素(β1-integrin)和上皮钙黏附素(E-CD)蛋白表达.结果:黄芩苷明显抑制肝癌细胞BEL-7402及其耐药细胞BEL-7402/5-Fu的增殖,IC50分别为34.2、36.6 mg/L.5、10 mg/L黄芩苷能部分逆转耐药细胞对Fu的耐药,逆转倍数分别为28.6、46.7;5、10 mg/L黄芩苷增强BEL-7402对Fu敏感性,增敏倍数分别为1.4、2.1.5、10 mg/L黄芩苷增加耐药细胞内药物积聚,降低MDR1基因及P-gP蛋白表达,抑制耐药细胞黏附率,降低耐药细胞β1-整合素表达,促进E-CD蛋白表达;且10 mg/L黄芩苷效果优于5 mg/L(P均＜0.05).结论:黄芩苷体外能抑制肝癌细胞生长及降低细胞黏附性,并能部分恢复肝癌耐药细胞对Fu的敏感性,这可能与其增加细胞内药物浓度、抑制MDR1基因表达有关.     

川芎嗪对人肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM中P-gp表达的影响

目的观察川芎嗪（TMP）对人肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM中P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）表达的影响,研究TMP对人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM的逆转机制。方法将人肝癌细胞耐药株BEL-7402/ADM及其亲本细胞BEL-7402分为：亲本组、耐药组、逆转组（耐药＋TMP）、阳性对照组（耐药＋维拉帕米）、二抗阴性对照组,用免疫组化SABC法和流式细胞术对照观察TMP对BEL-7402/ADM中P-gp表达的影响。结果流式细胞术结果显示耐药组显著高于亲本组（P〈0.01）;耐药＋TMP组和耐药＋维拉帕米组均显著低于耐药组和亲本组（P〈0.01）。免疫组化SABC法显示耐药组P-gp阳性表达率显著高于亲本组（P〈0.01）;TMP组、维拉帕米组的P-gp阳性表达率显著低于耐药组（P〈0.01）。结论 TMP能显著降低人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM细胞表面P-gp的表达,增加阿霉素等化疗药物对BEL-7402/ADM的细胞毒性作用,从而增加对肿瘤细胞的抑制率,提高化疗疗效。     

人肝癌裸鼠移植模型阿霉素诱导法建立肝癌多药耐药细胞系

目的:建立人肝癌多药耐药细胞系研究其耐药特性及机制.方法:给予移植人肝癌细胞的裸小鼠腹腔注射阿霉素(ADM)长期诱导,获得多药耐药细胞系BEL-7402/ADM.相差显微镜和HE染色观察细胞,MTT法检测耐药细胞的多药耐药性,流式细胞术检测耐药细胞表面多药耐药基因(mdr)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH/GST)的表达.结果:BEL-7402/ADM对多种抗癌药物产生耐药,对阿霉素的耐药性提高了20.33倍.BEL-7402/ADM细胞表面P-gp和MRP表达阳性,与对照细胞BEL-7402表达比较,差异十分显著(P<0.01).GSH/GST表达无明显变化.结论:BEL-7402/ADM具有明确的多药耐药性,该模型的建立对研究肝癌多药耐药的产生及逆转具有重要价值.     

肝力注射液逆转人肝癌细胞获得性多药耐药的体外研究

目的研究肝力注射液体外逆转人肝癌细胞5-Fu获得性多药耐药的作用。方法MTT法检测肝力注射液对人肝癌BEL-7402/5-Fu耐药细胞株的增殖抑制率及对5-Fu获得性多药耐药的逆转指数,倒置显微镜及Wright-Giemsa染色观察细胞形态学改变,流式细胞术检测细胞内阿霉素荧光强度。结果人肝癌BEL-7402/5-Fu细胞株对临床常用化疗药物显示出不同程度的交叉抗药性,肝力注射液(以苦参碱计)在0.230、0.115、0.058mg/mL3个质量浓度对人肝癌BEL-7402耐药细胞株72h的增殖抑制率分别为(9.25±2.38)%、(8.46±1.90)%、(4.23±2.05)%,对5-Fu的逆转指数分别为5.50、3.83、2.25,肝力注射液在0.230mg/mL质量浓度预处理细胞2h能提高细胞内阿霉素的量约38.61%。结论肝力注射液在体外具有逆转人肝癌细胞5-Fu获得性多药耐药的作用。     

膀胱癌多药耐药细胞株Pumc-91/ADM的建立及其生物学特性评价

目的 多药耐药(multidrug-resistance,MDR)是肿瘤治疗的主要障碍.为探讨体外肿瘤MDR的方法,本研究建立膀胱移行上皮癌多药耐药细胞株Pumc-91/ADM,并研究其生物学特性.方法 以人膀胱移行上皮癌细胞株Pumc-91为研究对象,应用阿霉素(ADM)浓度梯度递增法体外诱导建立人膀胱移行上皮细胞癌Pumc-91细胞的多药耐药细胞株Pumc-91/ADM.观察细胞的生长规律,用MTT法检测多药耐药性,流式细胞仪检测其生长周期及细胞内药物ADM荧光强度,反转录RT-PCR半定量检测耐药相关基因的mRNA表达量.结果 Pumc-91/ADM与亲本细胞Pumc-91相比其生长速度减慢,倍增期延长,细胞异型性明显,巨细胞增多.MTT法检测显示Pumc-91/ADM较Pumc-91细胞对ADM的耐受度提高了10倍,且对氨甲蝶呤、顺铂、表阿霉素、长春新碱均有不同程度的交叉耐药性.流式细胞术检测细胞内荧光强度Pumc-91/ADM较Pumc-91细胞明显降低,细胞周期中S期细胞减少,G1、G2期细胞增多.RT/PCR检测耐药相关基因结果显示耐药细胞株谷胱甘肽-S-转移酶基因表达明显高于亲本细胞.结论 耐药株Pumc-91/ADM具有典型的多药耐药特点,可以为膀胱癌的多药耐药研究提供一个较好的体外研究模型.     

健脾化瘀方对肝癌bel-7402／5-FU细胞表面耐药蛋白影响的研究

目的初步明确健脾化瘀方对肝癌细胞表面多药耐药蛋白表达的影响,并探讨可能机制。方法选择肝癌细胞bel-7402、肝癌耐药细胞bel-7402／5-FU做为实验细胞,以流式细胞仪（FCM）检测细胞表面P～糖蛋白（P-gP）、MDR相关蛋白（MRPl）的表达率及细胞内罗丹明123（Rho123）的蓄积浓度。以MTT比色法测定不同浓度健脾化瘀方对bel-7402／5-FU细胞增殖的抑制。FCM检测复方作用后bel-7402／5-FU细胞表面P-gP的表达率及Rho123的蓄积浓度。结果bel-7402／5-FU细胞表面P-gP的表达高于亲本bel-7402细胞,细胞内Rho123蓄积浓度低于亲本细胞。健脾化瘀方可显著抑制细胞生长,并呈量效关系。浓度0．5mg·mL。的健脾化瘀方作用bel-7402／5-Fu细胞48h后,细胞表面P-gP的表达率明显下降,细胞内Rho123蓄积浓度升高。结论健脾化瘀方可能具有逆转肝癌耐药细胞多药耐药的作用,途径可能是通过降低P-gP的表达而实现的。     

结直肠癌多药耐药细胞株的建立及其特性的初步探讨

目的 建立人结直肠癌LOVO细胞多药耐药细胞株LOVO/5-FU,并探讨其生物学特性及耐药机制.方法 人结直肠癌细胞系LOVO在体外与2.5 μg/ml 5-氟尿嘧啶（5-FU）作用,诱导成功LOVO/5-FU耐药细胞株,体外细胞毒性实验观察它们对5-FU,MMC,ADM,DDP,MTX,Arac等6种药物敏感性.用噻唑蓝（MTT）法、光镜及电镜观察两种细胞的形态及结构差异,绘制两种细胞的体外生长曲线.电镜对耐药细胞株LOVO/5-FU及敏感细胞株LOVO进行5-FU诱导细胞凋亡的实验研究.结果 成功的建立耐药细胞系LOVO/5-FU,该细胞系对5-FU的耐药指数为16.48,对MMC,DDP和ADM有交叉耐药性,但对MTX,Arac仍保持与LOVO细胞几乎相同的敏感性.在脱离5-FU体外冻存10个月,其耐药性可保持60%.结论 本研究成功的建立LOVO/5-FU多药耐药细胞株,其耐药性稳定,是研究大肠癌MDR的理想模型.     

MiR-195对BEL-7402/5-FU细胞5-氟尿嘧啶耐药性的影响

目的 探讨miR-195对BEL-7402/5-FU细胞5-氟尿嘧啶药物敏感性的影响。方法采用qRT-PCR检测BEL-7402细胞与BEL-7402/5-FU细胞中miR-195的表达水平。将miR-195质粒载体瞬时转染至BEL-7402/5-FU细胞;MTT检测细胞药物敏感性的改变。结果相比于BEL-7402细胞,miR-195在BEL-7402/5-FU细胞中表达水平下调;miR-195转染组的细胞增殖抑制率较miRNA阴性对照组及未转染组明显增高。结论MiR-195能够增加BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶的药物敏感性,抑制细胞增殖。     

shRNA沉默DNA-PKcs表达对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的影响

目的观察shDNA-PKcs沉默DNA-PKcs基因对肝癌耐药细胞Bel7402/5-FU耐药性的影响。方法采用双酶切、测序分析鉴定shDNA-PKcs干扰质粒;用阳离子脂质体法将shDNA-PKcs质粒转染BEL7402/5-FU细胞,根据荧光细胞数计算转染率,Real-time PCR及Western blot检测沉默效率;MTT法检测细胞药物敏感性;Real-time PCR和Western blot检测P-gp mRNA和蛋白表达。结果双酶切鉴定结果显示质粒约为6300bp,测序结果显示插入序列为shDNA-PKcs序列。荧光细胞计数显示质粒的转染率为62.2%。Real time PCR及Western blot检测结果显示DNA-PKcs mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为82.6%、71.8%;MTT检测结果显示shDNA-PKcs实验组的ADM和5-FU的IC50值比对照组ADM、5-FU低（P〈0.05）,DDP和MMC的IC50值与对照组比无统计学意义（P〉0.05）。Real time PCR和Western blot检测结果显示实验组P-gp mRNA、蛋白表达水平均比对照组低（P〈0.01）。结论 shDNA-PKcs干扰质粒能够有效抑制BEL7402/5-FU细胞中DNA-PKcs表达,增加细胞对化疗药物的敏感性,其机制可能与P-gp蛋白的下调有关。     

缺氧时三氧化二砷对5-氟尿嘧啶抗肝癌细胞株BEL-7402敏感性的影响

目的探讨缺氧条件下,不同浓度的5-氟尿嘧啶(5-FU)联合0.5μmol/L浓度三氧化二砷(As2O3)对肝癌细胞株BEL-7402生长抑制的影响。方法用二氯化钴(CoCl2)诱导细胞培养的化学性缺氧条件,及四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定缺氧条件下不同浓度5-FU及5-FU联合As2O3对肝癌细胞BEL-7402的生长抑制作用。结果在化学性缺氧条件下,不同浓度5-FU联合As2O3对肝癌细胞株BEL-7402生长抑制作用比单用5-FU有统计学差别(P﹤0.05),呈剂量-效应依赖关系。结论在CoCl2诱导的化学缺氧条件下,非细胞毒剂量As2O3具有改善缺氧状态下5-FU对人肝癌细胞BEL-7402化疗敏感性下降的作用。     

Survivin siRNA对肝癌细胞BEL-7402的增殖与对Survivin基因及蛋白表达的作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)对BEL-7402细胞的生长抑制与生存素(Survivin)基因及蛋白表达的影响。方法:合成Survivin siRNA,以不同浓度转染BEL-7402细胞,MTT法测定细胞生长抑制率,RT-PCR、Western-Blot检测BEL-7402细胞Survivin mRNA及蛋白的表达差异。结果:BEL-7402细胞转染FAM荧光标记的siRNA后,细胞内有绿色荧光表达。分别以10、30、50nmol/LSurvivin siRNA转染细胞后,MTT测得的细胞生长抑制率分别为(38.80±1.71)%,(54.50±1.16)%,(66.79±1.10)%,RT-PCR测得的Survivin mRNA表达分别为0.42±0.02,0.28±0.01,0.12±0.01,Western-Blot测得Survivin蛋白表达分别为0.55±0.04,0.32±0.02,0.21±0.02,三项指标与空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。随着Survivin siRNA浓度的增加,细胞抑制率呈上升趋势,Survivin mRNA及Survivin蛋白的表达逐渐降低,呈浓度-效应关系。结论:Survivin siRNA能抑制BEL-7402细胞的增殖与Survivin基因和蛋白表达。     

MiR-122上调野生p53蛋白增强BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶敏感性

目的探讨MiRNA-122对肝癌耐药细胞株BEL-7402／5。Fu的5．氟尿嘧啶敏感性的影响以及作用机制。方法构建miR-122及其阴性对照空载体稳定转染至BEL-7402／5-FU细胞中,Westernblot检测未转染组,阴性载体转染组和miR-122转染组中与耐药相关的p53蛋白表达水平。用MTT法和流式细胞术检测三组细胞对5-氟尿嘧啶敏感性。结果MiR-122转染组与未转染组,阴性载体转染组比较,野生型p53蛋白表达水平升高。流式细胞术检测,miR-122转染组的细胞凋亡率较未转染组和阴性载体转染组高。结论miR-122能上调野生型p53蛋白表达,增加BEL-7402／5-FU细胞对5-氟尿嘧啶敏感性,从而成为治疗肝癌耐药治疗的一个方法。     

新型多胺缀合物NMMB逆转K562/ADM细胞多药耐药及其机制

目的：研究新型多胺缀合物NMMB对白血病细胞株K562/ADM的多药耐药（MDR）逆转作用,并进一步探讨其耐药逆转机制。方法：分别以不同浓度的NMMB(10～1 000 mg/L)作用于体外培养的K562和K562/ADM细胞24 h,采用MTT 法检测细胞增殖抑制率,确定NMMB的非毒性剂量;采用非毒性剂量,NMMB 0、 2.5 、5.0 和10.0 mg/L组,分别与不同浓度ADM（0.25～100.00 mg/L）联合作用,检测各组细胞生长抑制50%的ADM浓度,即IC50,计算逆转倍数;利用流式细胞术检测NMMB联合ADM作用后K562/ADM 细胞内ADM蓄积程度和细胞周期变化。结果：随着NMMB浓度的增加,细胞增殖抑制率也相应增加,呈剂量-效应关系;NMMB的最大无毒剂量为12.5 mg/L,逆转倍数为4倍;NMMB可明显提高ADM在K562/ADM细胞内的蓄积,与未加NMMB对照组比较差异有显著性（P<0.05）;K562/ADM细胞被阻滞在G0/G1期,与未加NMMB对照组比较差异有显著性（P<0.01）。结论：NMMB对白血病耐药细胞株K562/ADM有增殖抑制和多药耐药逆转作用,其部分逆转机制可能是通过增加细胞内化疗药物蓄积和将K562/ADM细胞阻滞在G0/G1期而实现的。