Sj28GST基因克隆和高效表达产物的纯化

目的　从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中克隆 2 8kDa谷胱甘肽 -S -转移酶 (Sj2 8GST)基因 ,获得用于疫苗和T细胞表位研究的高纯度重组融合蛋白 2 8GST -TRX。方法　应用引物特异性PCR技术 ,从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中扩增Sj2 8GST基因 ,经琼脂糖凝胶电泳结合碱基序列分析鉴定后 ,采用定向克隆技术构建Sj2 8GST -TRX融合蛋白重组表达载体并诱导其在大肠杆菌BL2 1(DE3)的表达 ,用Western -blotting测定以融合蛋白方式表达的Sj2 8GST的免疫原性 ,通过包涵体纯化结合Ni+柱亲和层析获得高纯度重组融合蛋白。结果　Sj2 8GSTPCR产物为约 6 4 0bp ,其碱基序列 (6 33bp)和推导的氨基酸序列 (2 11aa)与GenBank报道一致 ;获得了Sj2 8GST -TRX重组质粒 ;2 8GST -TRX融合蛋白在大肠杆菌以包涵体形式高效表达 ;在分子量为约 4 3kDa处有一能与羊抗Sj2 8GST抗体产生特异性反应的含 2 8GST融合蛋白条带 ;包涵体纯化法结合Ni+ 亲和层析可获得高纯度的重组融合蛋白。结论　获得到了日本血吸虫中国大陆株 2 8GST分子的全长基因和高纯度重组 2 8GST -TRX融合蛋白 ,该融合蛋白具有天然Sj2 8GST免疫原性。     

隐源性肝炎相关新基因CHBP2的原核表达及蛋白纯化

目的:构建隐源性肝炎相关新基因CHBP2原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并纯化CHBP2融合蛋白。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以提取的Huh7细胞mRNA为模板,扩增获得CHBP2基因片段,连接到pGEM-T载体,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,构建原核表达载体pET-32a( )-CHBP2,转化大肠杆菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得CHBP2融合蛋白的可诱导性表达,通过SDS-PAGE电泳、Western blot免疫印迹分析证实蛋白表达的特异性,超声破碎表达细菌,SDS-PAGE分析,利用镍离子亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。结果:成功构建原核表达载体pET-32a( )- CHBP2,并将CHBP2融合蛋白成功表达,通过Western blot免疫印迹,证实了蛋白表达的特异性。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达,并对蛋白成功进行了纯化和复性,获得了表达蛋白的纯品结论:成功表达、纯化CHBP2蛋白,为研究CHBP2蛋白的生物学功能打下了基础,     

FHL2蛋白及其参与心脏离子通道电流调控的研究进展

FHL蛋白是仅由4个半uM结构域和位于N末端的一个锌指结构组成的一类蛋白。由于这一类蛋白缺少其他功能性或结构性的结构域,因而被归为LIM—only蛋白家族。FHL2属于FHL家族。人类的FHL家族包括FHL1、FHL2、FHL3、FHT4和ACT。FHL2参与了多种蛋白质的相互作用,同时也参与了多种骨架蛋白、酶、转录因子等的调控作用。新近的研究发现,FHL2与一些心脏离子通道存在相互作用并对这些通道进行功能调控。本文就FHL2及其对离子通道的调控作用研究进展做一综述。     

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的表达、纯化和鉴定

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与Hsp16.3在大肠杆菌中融合表达并对其进行纯化和鉴定。方法采用PCR方法从质粒pProEX HTb-Hsp16.3扩增Hsp16.3基因,引入48bp的柔性linker结构以确保两蛋白的正确折叠。将目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的基因片段双酶切后,替换质粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6中的ESAT6基因,从而获得重组质粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及活动期结核病人血清进行Western blot分析鉴定,采用镍柱亲合色谱法对融合蛋白进行纯化。结果 PCR扩增获得的目的基因与GenBank报道的一致。SDS-PAGE分析显示构建的融合蛋白在大肠杆菌中表达,且该融合蛋白能够分别与抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及结核病人血清反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析可获得纯化的Ag85B-Hsp16.3融合蛋白。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其生物学功能提供了基础。     

Stx1B基因克隆、表达及重组蛋白的纯化

目的构建志贺样毒素1B亚单位(Stx1B)的原核表达载体,获取高纯度的Stx1B重组蛋白。方法用PCR法扩增Stx1B,通过基因重组技术克隆入原核表达载体pGEX4T-2,将该重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析及Westernblot检测。结果重组质粒经诱导后表达分子量为34kD的重组蛋白,Western blot检测显示特异性条带,亲和层析柱纯化后得到重组蛋白的纯度在90%左右。结论成功构建了Stx1B重组质粒,表达并纯化出高纯度重组蛋白,为进一步的生物性质研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌融合蛋白UreB-Omp11在大肠杆菌中的表达与纯化

近年来,研究者发现了多种Hp的有效保护性抗原成分,UreB、Omp、Hsp、NAP等,其中尿素酶、外膜蛋白等是人们研究的焦点。但它们单独免疫动物时,获得的免疫保护效果均不理想,为克服单一抗原分子诱导的免疫保护水平偏低的问题,本研究用重叠延伸PCR法将H.pylori郑州分离株MELHP27的ur     

猪带绦虫谷胱甘肽转移酶GST的原核表达及免疫学研究

目的通过对猪带绦虫谷胱甘肽转移酶GST的表达,对其免疫性进行初步研究。方法利用生物信息学从猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出谷胱甘肽转移酶(GST)基因,将其克隆到原核表达载体pET28a(+),经过双酶切、PCR鉴定后,异丙基-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析,Western blotting鉴定该蛋白免疫反应性。结果成功构建了重组体,并得到高纯度蛋白,该蛋白可被感染猪带绦虫的病人及猪、感染牛带绦虫病人及感染亚带绦虫病人血清所识别。结论猪带绦虫谷胱甘肽转移酶可在原核系统中获得具有免疫反应性的高效表达。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白基因原核表达产物的纯化

目的 建立日本血吸虫线粒体相关蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物。方法 菌体经冻融、超声破菌及提取包涵体后,用分子筛层析纯化蛋白质并使之复性,再用Western-blot方法对纯化蛋白的抗原性进行分析。经动物免疫后采用dot-ELISA方法检测兔血清中抗体滴度,分析纯化蛋白的抗源活性。结果 经分子筛纯化后的融合蛋白rSj338/26GST经SDS－PAGE电泳鉴定达电泳纯,Western blot显示纯化蛋白能够被日本血吸早重感染兔血清及rSj338/26GST免疫兔血清识别。dot-ELISA法检测结果表明经分子筛纯化并复性的rSj338/26GST融合蛋白免疫兔血清中特异性抗体的滴度最高,为1：51200。结论 纯化后的融合蛋白rSj338/26GST具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为日本血吸虫病疫苗候选分子进一步深入研究。     

TAT-HBX-EGFP蛋白的表达与纯化

目的构建TAT-HBx-EGFP质粒,转化大肠埃希菌BL21,进行蛋白的表达、鉴定及纯化。方法 PCR扩增目的基因HBx,进行EcolR1单酶切,与经EcolR1单酶切的TAT-EGFP质粒进行连接,转化大肠埃希菌BL21,利用IPTG对其进行诱导。应用West-ern blot方法鉴定表达的融合蛋白,采用Ni2＋-金属螯合亲和层析柱法对融合蛋白进行纯化。结果得到构建好的TAT-HBx-EGFP质粒及纯化的目的融合蛋白TAT-HBX-EGFP。结论通过对TAT-HBx-EGFP质粒的构建和TAT-HBX-EGFP蛋白的表达与纯化,为进一步研究HBX蛋白的致肝癌作用奠定了实验基础。     

刚地弓形虫Peroxiredoxin基因的克隆及其融合蛋白的高效表达和纯化

目的克隆刚地弓形虫Prx基因,用IPTG诱导表达Prx融合蛋白并进行纯化。方法用PCR扩增目的基因片段并克隆至pGEX-6P-1载体,构建pGEX-6p-1/TgPrx原核表达载体;IPTG诱导表达Prx融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,GST亲和层析纯化融合蛋白。结果从弓形虫RH株DNA中扩增Prx基因,成功构建了弓形虫重组质粒pGEX-6p-1/TgPrx,并在大肠埃希菌(E.coli)中得到高效表达,表达的融合蛋白分子质量为51ku,该蛋白可被鼠抗弓形虫血清特异性识别。结论原核表达具有生物学活性的弓形虫重组Prx蛋白(rTgPrx),该蛋白有望用于弓形虫病免疫学检测。     

结核分枝杆菌HSP65与IL-2融合蛋白的表达和纯化

目的获得融合表达的结核分枝杆菌热休克蛋白65与人白细胞介素2的重组蛋白,为进一步研究其对结核疫苗的作用奠定基础。方法用PCR的方法分别从H37Rv DNA和质粒pGEM-Teasy-IL-2中扩增目的基因片段hsp65和IL-2,将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序,将测序正确的目的基因片段分别经EcoRI和ClaI,ClaI和HindⅢ双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EX HTa,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,经IPTG诱导后进行融合表达,并通过镍柱对融合蛋白进行纯化。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE和Western-blot分析,在Mr 78000处有特异性的蛋白表达条带。用镍柱进行亲和层析纯化后得到了高纯度的HSP65-IL-2融合蛋白。结论成功的构建了结核分枝杆菌HSP65与人IL-2的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,有望为结核的预防提供有效的疫苗。     

与HERG钾通道相互作用的FHL2蛋白对该通道功能的调控

目的 筛选与心脏人类果蝇相关基因（HERG）的编码蛋白钾通道存在相互作用的蛋白质,并进一步研究该相互作用蛋白对HERG钾通道的调控作用。方法 ①以带有编码人类心脏HERG钾通道的cDNA为模板,通过PCR方法得到编码人类心脏HERG钾通道氨基末端（404个氨基酸）的DNA片段。将该片段克隆入pGBKT7载体, 构建“诱饵”质粒pGBKT7-HERG-NT。②应用酵母双杂交技术筛选人类心脏cDNA文库。③以PCR法扩增4个半LIM结构域（FHL2）基因的开放读框片段(ORF),并克隆入pcDNA3.0载体。④以pcDNA3.0-herg转染HEK293细胞,应用G418筛选得到HEK293/HERG细胞株。以pcDNA3.0-FHL2转染HEK293细胞,筛选得到HEK293/FHL2细胞株后,再将pcDNA3.0-herg转染入该细胞株。⑤应用膜片钳技术,研究FHL2对HERG通道功能的影响。结果 ①用酵母双杂交技术筛选得到37个阳性克隆,其中含有表达FHL2蛋白的克隆。②膜片钳检测发现,FHL2蛋白在增加HERG电流幅度的同时并调节其激活过程。 结论 FHL2蛋白能与HERG氨基末端相互作用而影响HERG钾通道的功能。     

不同条件下乙肝前S2融合蛋白的表达效果分析

目的筛选含有乙肝前S2蛋白全长基因的融合表达载体pMAL-C2／S2在大肠埃希菌中的最佳表达条件。方法依次在不同的宿主菌、培养基、诱导温度、诱导剂种类及浓度中诱导pMAL-C2／S2融合表达载体，目的产物经SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件分析，以获得最佳表达条件。结果表达载体的最适宿主菌为BL21菌株，最佳培养基为Gs，最佳温度28℃；使用IPTG诱导的最佳浓度为0．5mmol／L，使用乳糖诱导最佳浓度为1．5mmol／L；最佳诱导时间是4h。表达载体在最佳条件下表达时，目的蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的43．5％。结论筛选出了pMAL-C2／S2在大肠埃希菌中表达乙肝前S2-麦芽糖结合蛋白HBV PreS2-MBP融合蛋白的最佳条件。     

JC病毒小包膜蛋白VP2抗原及鼠多克隆抗体的制备

目的 构建JC病毒小包膜蛋白VP2的原核表达载体,表达纯化VP2蛋白,并制备其抗体.方法 用PCR方法从患者脑脊液中扩增JC病毒小包膜蛋白VP2基因,测序正确后克隆入pET-32a(+)原核表达载体,转化BL21大肠埃希菌,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达该蛋白并纯化.纯化的VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠多克隆抗体.结果 将pET-32a(+)-VP2重组表达载体分别转化BL21大肠埃希菌,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量为58.5×10~3左右的重组融合VP2蛋白.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示,IPTG诱导6～10 h重组蛋白表达水平较高.Western印迹证实其具有良好的抗原性,且免疫BALB/c小鼠后成功制备了鼠多克隆抗体.结论 成功构建原核表达载体pET-32a(+)-VP2并获得纯化VP2融合蛋白,并制备JC病毒小包膜蛋白VP2抗体,为进一步对VP2蛋白的功能及JC病毒流行病学调查等研究奠定了坚实的基础.     

Expression and purification of the recombinant fusion protein GST-cysteine protease of Ancylostoma ceylanicum

cDNA encoding Ancylostoma ceylanicum cysteine protease (ACEY-1) was cloned into pGEX-4T eucaryotic expression vector then E. coli BL2 cells were transformed with the plasmid using electroporation method. The expression of the recombinant protein in liquid cultures was induced by the addition of IPTG. The Western blot analysis showed that the recombinated ACEY-1 may be solublised only partially at pH 7.4 which allowed affinity-purification of this protein using glutathione-sepharose column.     

人TAT-PDX-1融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

目的构建人TAT-PDX-1表达载体,并对其融合蛋白进行纯化。方法采用RT-PCR技术从人胰腺组织中获得目的基因hPDX-1,将TAT序列与PDX-1克隆到原核表达载体pET-28a;用IPTG诱导、表达融合蛋白;NiNTAagaros纯化融合蛋白,Western blot鉴定。结果目的片段PDX-1被有效扩增,DNA序列测定表明所构建重组质粒pET28a-TAT-h PDX-1与设计相同;TAT-PDX-1融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并成功纯化。结论成功地获得了TAT-hPDX-1融合基因的表达产物,为进一步研究及临床应用奠定了基础。     

弓形虫GRA6可溶性蛋白在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中高效表达及纯化弓形虫GRA6抗原,为制作弓形虫感染基因工程诊断试剂盒奠定基础.方法将重组pGEX-GRA6表达载体转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus（DE3）-RP菌株,在异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导下表达.超声破壁后,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物的表达形式,并对表达产物以硫酸铵沉淀、Sephedax G50脱盐和GST亲和层析柱进行目的蛋白的纯化.通过Western blotting检测其纯化的重组抗原的免疫反应性.结果GRA6以融合蛋白（GST-GRA6）的形式在大肠埃希菌中得到了高效表达.对表达产物可溶性分析表明,表达蛋白在上清液中和包涵体中均有表达.在上清液中表达的可溶性蛋白经纯化后蛋白纯度可达90%以上.Western blotting分析表明纯化蛋白能被弓形虫感染的人血清所识别.结论GRA6在大肠埃希菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化后能特异性地被弓形虫感染者血清所识别.     

丙型肝炎病毒高变区1融合蛋白的表达、纯化及其初步应用

目的　克隆并表达中国不同地区不同基因型的丙型肝炎病毒高变区 1(HCVHVR1)蛋白 ,并用表达纯化产物检测慢性丙型肝炎患者血清中的相应抗体 ,分析其临床意义。方法　根据 31株HCVHVR1序列分析及免疫原性预测结果 ,选择 4株克隆 (1b型 3株 ,2a型 1株 ) ,从 pGEMT E2克隆中扩增得到 4个HVR1片段 ,将其分别克隆到原核表达载体 pQE4 0中 ,表达产物经纯化后用以检测慢性丙型肝炎患者血清中的HVR1抗体。结果　构建的HVR1原核表达载体在大肠埃希菌中成功表达了 4种相对分子质量约为 2 80 0 0的二氢叶酸还原酶 (DHFR) HVR1融合蛋白 ,纯化蛋白的获得率约为 32 0～ 80 0 μg/ 10 0ml培养液。这 4种融合蛋白 (SH1b、BJ1b、SD1b、SD2a)与慢性丙型肝炎患者的血清结合率分别为 72 .8% (5 1/ 70 )、6 0 % (4 2 / 70 )、4 8.6 % (34/ 70 )和 5 8.6 % (4 1/ 70 )。在 2 0例用干扰素治疗的丙型肝炎患者中 ,5 7% (4 / 7)的干扰素治疗无应答者治疗前血清能与之反应 ,而应答者血清中只有 15 .3% (2 / 13)能与之反应。干扰素治疗应答者血清与 4种融合蛋白反应的A值高于治疗无应答者 (P <0 .0 5 )。结论　选择的 4株HCVHVR1片段在大肠埃希菌中获得成功表达 ,所得 4种HVR1融合蛋白能与HCV感染者血清发生较广泛的反应     

SARS-CoVSpike蛋白受体结合区的表达及纯化

目的获得稳定表达SARS冠状病毒spike蛋白受体结合区的果蝇细胞系,表达spike蛋白受体结合区。方法设计引物扩增spike蛋白受体结合区318-513片段,构建重组表达载体S318-pMT/Bip/V5-his,与pCoBlast质粒共转染果蝇S2细胞,经Blasticidin筛选得到的稳定重组细胞系,用硫酸铜诱导表达,Western-Blot检测表达产物。富集的表达产物用镍柱和RESOURCES阳离子交换树脂纯化,SDS-PAGE和Western-Blot检测纯化产物。结果重组spike蛋白受体结合区可在果蝇S2细胞中分泌表达,且具有特异免疫反应性;经镍柱和RESOURCES纯化可得到纯度达90%以上的重组蛋白。结论克隆并在真核生物中分泌表达出具免疫反应原性的spike蛋白受体结合区,镍柱和RESOURCES两步纯化可得到高纯度蛋白。