体外培养人眼结膜上皮细胞

目的探索体外分离培养人眼结膜上皮细胞的方法。方法用组织块培养法培养人眼结膜上皮组织，分别种植于培养皿及处理过的羊膜上，培养2周，观察结膜上皮细胞的生长特性。结果接种在培养皿的结膜上皮约6 d组织块之间可融合成膜状，细胞为单层上皮细胞。接种在羊膜上的结膜组织生长较慢，约2周组织块之间可互相连接，融合成膜状，细胞为复层上皮细胞。免疫组化鉴定，结膜上皮细胞CK13染色阳性。结论组织块培养法是人眼结膜上皮细胞培养的较好方法，种植在羊膜上可获得复层上皮细胞。     

培养胎兔角膜缘干细胞移植治疗兔眼碱烧伤的实验研究

目的 探讨羊膜为载体培养的胎兔角膜缘干细胞移植治疗兔角膜缘碱烧伤的效果。方法 将胎兔角膜缘干细胞原代培养于羊膜上7d后。移植于兔角膜缘碱烧伤动物模型眼，并对治疗后的角膜进行临床及病理学检查。结果 体外培养的胎兔角膜缘干细胞可在羊膜上保持高增殖力。并分化为密集的角膜上皮细胞层。角膜缘干细胞移植术后兔角膜上皮完整、基质细胞浸润减轻、新生血管减少，与对照组和单纯羊膜移植组相比其临床评分差异有显著意义。结论 胎兔角膜缘干细胞移植术治疗角膜碱烧伤可有效重建眼表，为临床应用胎儿角膜缘干细胞进行眼表重建奠定了实验基础。     

外周血单核细胞在角膜上皮重建的体外研究

目的　探讨外周血单核细胞作为角膜缘干细胞替代角膜上皮细胞再生的潜能。方法　实验时间为2020年1月至2021年1月，实验动物为来自暨南大学生理实验室5～8月龄健康新西兰大白兔30只；外周血单核细胞体外培养及鉴定：采用密度梯度离心法分离兔外周血单核细胞，在倒置相差显微镜下观察单核细胞形态，细胞分选技术检测单核细胞表面标志物CD14。将收集的单核迁移细胞置于新鲜角膜缘和角膜上皮组织块的微环境中共培养1周，流式细胞仪检测诱导前与诱导后细胞表面特异标志物细胞角蛋白的阳性率，诱导前与诱导后细胞表面角蛋白阳性表达率指数的组间比较采用重复测量设计的方差分析。计量资料采用t检验。结果　流式细胞术检测诱导前单核迁移细胞特异标志物细胞角蛋白阳性率为1.64%，诱导后单核迁移细胞特异标志物细胞角蛋白阳性率为11.30%。诱导前，实验组细胞角蛋白阳性表达率与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；诱导7 d后，实验组细胞角蛋白阳性表达率为（10.298±0.996）%，与对照组（1.786±0.237）%比较，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组诱导前细胞角蛋白阳性表达率为（1.308±0.376）%，与诱导7 d后（10.298±0.996）%比较，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组诱导前细胞角蛋白阳性表达率与诱导7 d后比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论　外周血单核细胞作为角膜缘干细胞的自体替代干细胞来源，被认为是角膜上皮重建的有效治疗策略。     

鼠尾胶原、多聚赖氨酸和明胶3种基质对角膜上皮细胞增殖的影响

目的探讨鼠尾胶原、多聚赖氨酸和明胶3种基质对体外培养角膜上皮细胞增殖的影响。方法采用鼠尾胶原、多聚赖氨酸和明胶作为基质包被培养器皿,以普通培养器皿作对照,培养角膜上皮细胞,观察细胞形态,进行细胞计数并描绘细胞生长曲线,比较不同基质对角膜上皮细胞的增殖作用。结果使用基质包被的培养器皿培养角膜上皮细胞,细胞增殖速度较普通组快,细胞形态、活力和长势比普通组更佳,促进增殖的能力为鼠尾胶原>多聚赖氨酸>明胶。结论鼠尾胶原可促进角膜上皮细胞增殖,且增殖效果优于多聚赖氨酸和明胶。     

胚胎干细胞向体表外胚层及角膜上皮细胞分化过程中信号通路的调节

干细胞泛指体外具有自我更新和多向或定向分化潜能的细胞,胚胎干细胞则可被诱导分化形成内胚层、中胚层及外胚层来源的200余种不同细胞。角膜上皮细胞来源于胚胎发育时期的表皮外胚层。临床上严重、广泛的眼表损伤,需要具有增殖能力的角膜上皮细胞修复损伤。利用体内外研究体系模拟体内胚胎发育及组织环境,阐明具有生物活性的角膜上皮细胞的发育过程,为再生医学提供依据,是近年来研究的热点之一。本文介绍了Notch、Wnt、骨形态发生蛋白及成纤维生长因子等调控表皮外胚层发育及与角膜上皮细胞分化相关的信号通路,以既往实验研究为基础,就各信号通路调控的机制及主要调控因子进行综述。     

人羊膜间充质细胞诱导成骨及与胶原-明胶海绵载体复合的实验研究

目的通过体外诱导的方法促使人羊膜间充质细胞(human amniotic mesenchymal cells,hAMCs)成骨分化,并借用胶原—明胶海绵为载体进行复合培养,观察成骨分化后的hAMCs与胶原—明胶海绵载体的复合情况,旨在寻找修复牙槽突裂的种子细胞。方法结合使用机械法和酶分离法从人羊膜组织中分离hAMCs,将其培养至第三代后利用流式细胞术分选和免疫组织化学的方法进行表型鉴定;加入成骨诱导剂诱导第三代hAMCs,采用茜素红染色检测钙盐沉积的方法判定其成骨分化的程度;将第三代hAMCs消化后接种于胶原—明胶海绵载体上复合培养,观察细胞与胶原—明胶海绵载体复合后的生长情况。结果流式细胞术分选结果显示第三代hAMCs高表达CD29、CD166、CD44、CD73,但不表达CD34、CD45;免疫组织化学结果显示hAMCs波形蛋白染色阳性;茜素红染色结果显示经成骨诱导21 d后可在hAMCs中检测到染色阳性的钙结节;倒置相差显微镜观察显示hAMCs与胶原—明胶海绵在载体复合培养72 h后能形成良好的粘附生长。结论本实验成功从人羊膜组织中分离hAMCs,且培养至第三代的hAMCs符合实...     

兔舌黏膜细胞的体外培养及生物学特性研究

目的 探讨舌黏膜细胞的培养方法,为进一步以舌黏膜细胞作为种子细胞构建组织工程化角膜上皮提供实验依据.方法 体外切取舌侧面和底面黏膜组织,经0.25%Dispase分离上皮层后,再经0.05%的胰酶分离为单个细胞,接种在无血清角质细胞培养液(KSFM)中,进行体外培养,并对其形态学以及生长曲线、传代特点、各代生长特点进行观察.同时,对体外培养获得的舌黏膜细胞进行广谱角蛋白免疫荧光鉴定.结果 舌黏膜细胞能够在无血清角质细胞培养液中稳定生长,呈现典型的"铺路石"状,细胞形态单一,可传至3～4代.细胞免疫荧光显示,体外培养获得的舌黏膜细胞AE1/AE3免疫荧光染色阳性.结论 应用无血清角质细胞培养液,可在短期内获得大量具有增殖能力的舌黏膜细胞,为进一步将其作为种子细胞构建组织工程化角膜上皮奠定了良好的基础.     

原代培养冷冻兔角膜缘上皮细胞的增殖活性研究

为探讨低温保存的兔角膜缘上皮细胞体外培养方法和增殖活性，采用不同的冷冻条件保存兔角膜缘上皮组织；通过若丹明B染色方法定量检查体外培养的原代细胞增殖活性，并对含血清培养和无血清培养、消化培养和组织块培养进行比较性研究。结果表明，二甲基亚砜浓度梯度和降温速率对冷冻角膜缘上皮原代细胞的增殖能力均无显著性影响(P&;gt;0．05)。在细胞增殖活性上，血清培养组优于无血清培养组(P&;lt;0．05)；组织块培养组优于消化培养组(P&;lt;0．05)；RPMI1640组优于MEM组和DMEM组(P&;lt;0．05)；3T3细胞滋养层组与巨噬细胞滋养层组结果相似(P&;gt;0．05)。结论：兔角膜缘上皮细胞具有血清依赖性和低温耐受性。     

鹿茸精诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的:探讨鹿茸精体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法:通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外扩增培养。鹿茸精定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。鹿茸精诱导3小时后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论:鹿茸精可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与培养

目的 建立体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法 应用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞传代培养.倒置显微镜下观察细胞形态及生长特征,测定细胞生长曲线,通过流式细胞仪检测细胞表面标志物,取第3代细胞分别加入成骨、成脂诱导剂并采用碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力.结果 获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.传至第3代细胞纯度可达97%以上,其细胞表型CD29、CD44、CD105、CD166呈阳性表达,CD34、CD80、CD86呈阴性表达.经成骨诱导后细胞碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色呈阳性,成脂诱导后细胞油红O染色呈现阳性.结论 应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠bMSCs,培养的细胞扩增迅速、生物学特性稳定,是一种较为理想的体外分离扩增bMSCs的培养体系.     

自体角膜缘上皮干细胞移植与单纯翼状胬肉切除术疗效比较

目的：观察翼状胬肉单纯切除术与翼状胬肉切除加自体角膜缘干细胞移植术的临床疗效。方法：将2006年3月～2010年6月78例（93眼）翼状胬肉患者随机分为翼状胬肉单纯切除术组（对照组）及翼状胬肉切除加自体角膜缘干细胞移植术组（治疗组）,比较其疗效。结果：采用翼状胬肉单纯切除术后患者复发率为13.3%,上皮修复时间为（5.83±0.84）d;而采用自体角膜缘干细胞移植后复发率仅为2.08%,上皮修复时间为（3.02±0.79）d,且两者相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：翼状胬肉切除加自体角膜缘干细胞移植术与翼状胬肉单纯切除术相比,可以有效地降低复发率,而且缩短角膜上皮修复时间,是治疗翼状胬肉较为理想有效的方法。     

P63及k19标记人角膜缘干细胞特异性对比研究

目的 比较P63及k19在标记人角膜缘干细胞相对特异性的高低.方法 使用免疫组织化学法检测P63及k19在人角膜中央上皮细胞及角膜缘干细胞的分布情况.结果 在人角膜缘干细胞P33少量表达、k19大量表达;角膜中央上皮细胞P63基本没有表达、k19仍有少量表达.结论 P63作为人角膜缘干细胞标记物的特异性高于k19.     

氟尿嘧啶结膜下注射联合重组人表皮生长因子治疗翼状胬肉术后角膜上皮损伤

目的探讨氟尿嘧啶结膜下注射联合重组人表皮生长因子（rhEGF）对翼状胬肉术后角膜上皮缺损的治疗效果。方法将48例（57眼）患者随机分为治疗组与对照组,两组均给予翼状胬肉切除联合角膜缘干细胞移植术,术后治疗组在对照组用药基础上给予rhEGF滴眼液及植床旁球结膜下隔日一次注射氟尿嘧啶,观察并比较两组的临床效果。结果治疗组每天角膜上皮平均愈合速率均较对照组快,术后并发症较少,治疗组角膜上皮平均痊愈时间为（76.2±13.3）h,而对照组角膜上皮平均痊愈时间为（153.5±14.9）h,两组差异有统计学意义（P〈0.01）。结论氟尿嘧啶结膜下注射联合rhEGF对翼状胬肉术后角膜上皮缺损具有良好的治疗效果。     

角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉的疗效分析

目的探讨角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉的手术效果,为进一步提高翼状胬肉治疗方法的选择提供参考依据。方法选择2012年1月～2013年1月在我院行手术治疗的翼状胬肉患者74例,74眼,入选病例中应用角膜缘干细胞移植术38例,设立为研究组,其余36例行生物羊膜移植术,设立为对照组,观察比较两组患者角膜创面上皮愈合时间、比较两组患者术前术后裸眼视力及术后随访其复发率、并发症。结果研究组患者角膜创面上皮愈合时间明显快于对照组,组问比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）。研究组患者术后复发率2．6％,显著低于对照组（P〈0．05）。研究组和对照组患者术后3周其裸眼视力均分别较术前明显提高,且研究组患者术后3周其裸眼视力改善更显著,组间比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉具有愈合快、并发症少、复发率低等优点,值得基层医院广泛推广和应用。     

人口腔扁平苔藓及口腔鳞状细胞癌p21表达的研究

目的：探讨p21基因表达与口腔扁平苔藓及口腔鳞状细胞癌发生、发展的关系。方法：应用免疫组织化学技术（S-P法）检测p21基因在20例正常口腔黏膜组织、38例糜烂型口腔扁平苔藓和38例口腔鳞状细胞癌标本中的表达。结果：38例口腔糜烂型扁平苔藓患者中p21阳性表达率为34.21%（13/38）;在口腔鳞状细胞癌组织p21阳性表达率为60.53%（23/38）和正常组织中检测到p21的表达为10%,口腔鳞状细胞癌组织、口腔扁平苔藓、正常组织之间的p21基因的表达差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：p21基因的表达与上皮细胞的分化状态有关。p21在口腔鳞状细胞癌中高度表达,可能与口腔扁平苔藓预后及癌的发生发展有关,p21蛋白可以作为一种可靠的标志物,指导临床治疗和判断预后,对癌的早期诊断具有重要价值。     

Fascin蛋白及NF-kB在宫颈鳞癌中的表达及其意义

目的：探讨fascin蛋白在宫颈鳞癌中的表达和意义及其NF-kB与的相关性。方法：本研究旨在通过应用免役组化法观察fascin蛋白在正常宫颈上皮组织、宫颈上皮内瘤变及宫颈鳞癌上皮组织中的表达,同时运用免疫组化法对比观察NF-KB在这些组织中的表达。结果：宫颈鳞癌和宫颈上皮内瘤变组织中fascin表达明显增强,其表达阳性率分别为95.45%（21/22）和67.86%（19/28）而正常宫颈上皮组织为0%（0/10）（P〈0.01）;NF-kB的阳性表达率在三者中依次分别为：81.82%（18/22）和50.00%（14/28）和10.00%（1/10）。癌组织比正常上皮组织表达明显增高有显著差异（P〈0.01）;宫颈鳞癌组织中fascin蛋白与NF-kB呈正相关性（r=0.4629,P〈0.01）。结论：fascin蛋白和NF-kB的表达上调促进宫颈鳞癌浸润和转移,有助于对宫颈鳞癌转移及患者预后的判断。     

Corneal epithelial stem cell delivery using cell sheet engineering: not lost in transplantation

Cell-based therapies have now generated significant interest as novel drug delivery systems, with various adult cell types used in treating a wide range of diseases. To overcome the limits that restrict treatments for corneal surface dysfunction, corneal epithelial stem cells expanded ex vivo have been applied as an alternative approach. While previous studies used various carrier substrates, we present a novel method using cell sheet engineering with temperature-responsive culture dishes to create carrier-free corneal epithelial stem cell sheets that can be transplanted without sutures. Results from clinical trials reveal successful transplantation with the recovery of lost visual acuity in all cases. Cell sheet engineering, therefore, presents a novel method for the delivery of corneal epithelial stem cells, and can also be applied for other approaches of cellular therapeutics.     

MSCs分离培养及定向分化为血管内皮细胞的研究

目的建立分离和培养大鼠骨髓源间充质干细胞（MSCs）的方法及定向分化为血管内皮细胞诱导条件的优化。方法淋巴细胞分离液（比重1．077g／m1）密度梯度离心法分离单个核细胞（MNC），在含10％胎牛血清L—DMEM培养基中培养，并传代扩增MSCs；选取状态较稳定的第4代细胞，分别用含10％胎牛血清和2％胎牛血清的诱导液（终浓度为10ng／mlVEGF、2ng／mlbFGF的DMEM培养液）继续培养，于第7、14天用流式细胞术分析CD34的表达情况，免疫组化法观察FVⅢ的表达情况。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs，细胞呈均一的成纤维细胞样，流式细胞术分析MSCs结果显示，CD34阳性率为1．01％、CD29阳性率为97．32％；诱导14d后免疫组织化学法检测FVⅢ的表达，10％和2％胎牛血清诱导体系细胞的阳性率分别为12．21％和91．43％。结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs；就诱导效果而言，2％胎牛血清诱导体系明显好于10％胎牛血清诱导体系，说明低浓度的胎牛血清更有利于MSCs向血管内皮细胞分化。     

自体角膜缘干细胞移植联合羊膜移植治疗复发性翼状胬肉的疗效观察

目的：探讨自体角膜缘干细胞移植联合羊膜移植术治疗复发性翼状胬肉的临床效果。方法选取60例（73眼）复发性翼状胬肉患者为研究对象,按照数字随机法分为观察组（30例,38眼）和对照组（30例,35眼）,对照组采用羊膜移植术,观察组采用自体角膜缘干细胞结膜植片联合羊膜移植术。术后随访12个月,分析比较两种术式的临床效果、复发率及并发症。结果两组患者的手术时间无明显差异（P〉0.05）,术后23周羊膜逐渐溶解、吸收。观察组角膜上皮愈合时间低于对照组（P〈0.05）;所有患者均获得随访,术后未出现角膜、巩膜溃疡,睑球粘连以及眼球活动受限等并发症。观察组2眼（5.3%）翼状胬肉复发,对照组4眼（11.4%）复发,观察组复发率显著低于对对照组（P〈0.05）,具有统计学意义。结论自体角膜缘干细胞移植联合羊膜移植治疗不会影响原术眼局部组织结构,可缩短角膜上皮愈合时间,降低翼状胬肉复发率。     

翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的疗效观察

目的观察翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的临床疗效。方法将80例(92眼)翼状胬肉患者随机分为治疗组38例(45眼)和对照组42例(47眼)。对照组采用传统胬肉切除治疗,治疗组采用翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植治疗。比较2组角膜上皮愈合情况及术后复发情况。结果治疗组角膜上皮愈合速度显著快于对照组;且12个月内,治疗组复发率为2.6%显著低于对照组的31.0%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉疗效可靠,复发率低,无严重手术并发症,值得推广应用。