免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞成骨及成脂潜能改变

[目的]探讨免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞（msenchymal stem cell,MSC）向成骨及成脂肪细胞分化潜能的改变。[方法]采用免疫介导法进行再障造模,Babl/c小鼠经60Co射线亚致死剂量照射后,自尾静脉输入DBA/2小鼠的淋巴细胞建立免疫介导型再生障碍性贫血小鼠模型;造模15天后进行再生障碍性贫血小鼠骨髓间充质干细胞培养,并检测骨髓成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）数量变化,观察模型小鼠骨髓病理改变;茜素红和油红O分别检测模型小鼠MSC钙结节数和脂肪细胞形成率。[结果]再障模型小鼠CFU-F数明显减少;骨髓病理切片显示,造血组织减少,并脂肪化;再障小鼠MSC钙结节数量减少,脂肪细胞分化率显著增加。[结论]免疫介导再生障碍性贫血小鼠MSC成骨潜能减弱,成脂潜能明显增强。     

叶绿素铜钠联合三黄三仙汤治疗免疫介导再生障碍性贫血的动物实验研究

目的探讨叶绿素铜钠联合三黄三仙汤（YST）对再生障碍性贫血的治疗作用及机制。方法动物实验研究：建立免疫介导再生障碍性贫血（AA）小鼠模型,随机分为空白对照组、模型对照组、CsA对照组、叶绿素铜钠盐组、叶绿素铜钠联合三黄三仙汤（YST）组,每组10只,2周后处死检测血象、骨髓像、骨髓病理切片、外周血CD4＋、CD8＋、TNF-α、IL-6含量。结果YST能延长模型小鼠生存,降低模型小鼠的死亡率;改善模型小鼠的外周血红细胞,白细胞及血小板;提高骨髓有核细胞数;改善骨髓病理改变;降低外周血CD8＋细胞,增加CD4＋细胞比率,提高CD4＋/CD8＋T细胞比值;降低血TNF-α,IL-6水平;与模型组比较有显著性差异（ P＜0.05）。结论YST对AA模型小鼠有较好的治疗作用。     

环磷酰胺和甲苯合用复制小鼠再生障碍性贫血模型及病理学观察

目的　以环磷酰胺和甲苯联合应用的方法建立小鼠再生障碍性贫血动物模型 ,并进行病理学观察。方法　昆明种小鼠 ,于皮下注射环磷酰胺 (5 0mg kg ,隔天 1次 ,共 4次 )及甲苯吸入染毒 (浓度 30mg L ,每次 2h ,共 8d)。对照组以等量生理盐水皮下注射 ,不染毒。 10d ,观察血象、骨髓、脾脏及外周微循环等病理变化。结果　血象 :模型组小鼠外周血象显示三系细胞均有显著降低 (P <0 0 1) ;病检 :骨髓增生显著低下 ,造血细胞含量减少 ,脂肪细胞明显增多 ;脾脏萎缩 ,脾小体变小或消失 ,部分小鼠有髓外造血灶 ;外周血微循环障碍等。各项指标基本符合再生障碍性贫血形态学表现。经 35d观察 ,病变持续存在 ,病变及表现与人的再障相似。对照组无上述改变。结论　环磷酰胺与甲苯合用复制再生障碍性贫血小鼠模型 ,方法简便 ,成功率高 ,有利于药物筛选应用。     

基因芯片探讨再生障碍性贫血小鼠脾脏基因表达

目的研究正常与再生障碍性贫血(AA)小鼠脾脏的基因表达谱,大规模分析再生障碍性贫血时基因表达水平的变化,探讨AA的发病机制。方法造成免疫介导再生障碍性贫血模型,从正常与再生障碍性贫血小鼠脾脏分别提取mR-NA,经反转录分别用C_(y3)、CY_5荧火标记,获得两组的cDNA探针,与博星基因芯片表达谱杂交,扫描仪扫描结果,用分析软件分析统计。结果模型小鼠外周血白细胞、血小板、血色素较正常小鼠组均有明显降低,两组比较有非常显著性差异,骨髓活检,发现模型组骨髓增生极度低下,造血细胞容量减少,脂肪细胞增多,间质水肿等改变。模型组和正常组差异表达基因共100条(4.88%),其中AA时上调基因29条(1.41%),下调基因71条(3.47%)。下调基因占差异表达基因的多数(71%)。结论利用基因芯片技术结合动物模型能大规模、高通量地研究AA的基因表达谱,初步筛选出疾病相关基因,对进一步阐明AA在基因水平上的发病机制有十分重要的作用。     

扶正养营颗粒对免疫介导再生障碍性贫血小鼠骨髓增殖及bcl-2表达的影响

目的:观察扶正养营颗粒对免疫介导再生障碍性贫血小鼠骨髓增殖及bcl-2表达的影响.方法:BALB/c小鼠40只随机分为正常组、模型对照组、环孢霉素A对照组、扶正养营颗粒实验组,记数外周血象、骨髓有核细胞,测定骨髓造血组织容量及bcl-2表达.结果:与正常组比较,模型组小鼠外周血象记数、骨髓有核细胞数、造血组织容量及bcl-2表达显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,环孢霉素A组、扶正养营颗粒组外周血象记数、骨髓有核细胞数、造血组织容量及bcl-2表达显著增加,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:扶正养营颗粒可能是通过上调拮抗凋亡因子bcl-2的表达,改善骨髓增殖,发挥其治疗再生障碍性贫血的作用.     

人脐带间充质干细胞对再生障碍性贫血小鼠造血的影响

目的:通过从脐带中分离和培养脐带间充质干细胞(MSCs),探讨其对再生障碍性贫血(再障)小鼠骨髓造血的影响。方法:原代贴壁法培养人脐带MSCs,将小鼠分为模型组、对照组、MSCs输注组进行实验。经静脉输注免疫介导方法建立再障模型小鼠,分别于3、7、14、21、28 d观察其外周血象指标变化和骨髓组织形态;ELISA检测造血负调控因子(IFN-γ)的水平,计数骨髓造血干细胞集落生成单位。结果:原代培养中脐带组织块直接贴壁后8～10 d,边缘爬出长梭形MSCs,随传代培养呈平行、漩涡状生长;再障小鼠经MSCs输注治疗后外周血象明显增高,IFN-γ水平下降(P0.01);治疗组骨髓红细胞集落形成单位与粒-巨噬细胞集落形成单位均较模型组明显增高(P0.01),成纤维细胞集落形成单位计数差异无统计学意义(P0.05)。结论:人脐带来源的MSCs对再障模型小鼠骨髓可发挥造血支持作用。     

川芎嗪改善再生障碍性贫血骨髓微环境的研究

目的探讨川芎嗪对再生障碍性贫血（AA）骨髓微环境的影响。方法将78例AA患者随机分为两组,均应用司坦唑醇联合环孢素A作为基础治疗,一组加用川芎嗪注射液治疗,作为川芎嗪组,4周为一疗程,休息1周后再继续应用1疗程;另一组应用基础治疗作为基础治疗组。于治疗前、治疗后第4周及第9周定期测定血象、骨髓象、骨髓病理（微血管情况）,观察临床表现,进行成纤维细胞的培养并进行比较。结果川芎嗪组外周血网织红细胞、中性粒细胞、血小板、血红蛋白骨髓造血细胞比例均有明显升高,与基础治疗组相比有显著性差异（P〈0.05）;骨髓微血管的数量、造血组织容量（%）及成纤维细胞集落,较治疗前及基础治疗组有明显增多（P〈0.05）。结论川芎嗪对AA患者骨髓微环境具有改善作用。     

左归补髓生血方对再生障碍性贫血小鼠骨髓有核细胞凋亡的影响

目的 观察左归补髓生血方治疗小鼠再生障碍性贫血的疗效及其对骨髓中有核细胞凋亡的影响。方法 将40只SPF级ICR小鼠随机分正常组、模型组、西药组、中药组。采用二甲磺酸丁酯和环磷酰胺交替给药12 d的方法复制再生障碍性小鼠模型。观察外周血细胞计数以及骨髓组织形态学变化,采用TUNEL法检测各组小鼠骨髓中有核细胞凋亡。结果 与正常组比较,模型组小鼠外周血白细胞、红细胞、血小板计数和血红蛋白浓度明显减低（P＜0.05）,骨髓有核细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）;光镜下可见小鼠骨髓增生极度减少,红系、粒系、巨核细胞系均明显减少。与模型组比较,中药组以及西药组外周血红细胞、白细胞、血小板计数和血红蛋白浓度明显升高（P＜0.05）,骨髓有核细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）;光镜下可见骨髓中造血组织比例增多。结论 左归补髓生血方可以有效升高再生障碍性贫血小鼠外周血细胞计数,抑制骨髓中有核细胞的凋亡。     

骨形态发生蛋白诱导髓外造血的实验研究

目的:探讨骨形态发生蛋白(BMP)诱导髓外造血以拯救骨髓造血衰竭的作用。方法:采用60Co-γ+氯霉素(CH)+环磷酰胺(CY)的方法诱导小鼠致死性再生障碍性贫血模型,实验组于诱导再障前6d肌肉内植入重组人-BMP-4(rh-BMP-4),对照组小鼠肌肉内植入琼脂。观察血象、病理形态等变化以及两组再障小鼠的死亡率。同时,给正常小鼠大腿肌肉内植入rh-BMP-4,动态观察植入后局部的形态变化、形成骨及骨髓的形态特点,脾集落形成单位(CFU-S)以及基质细胞干细胞生长因子(SCF)的表达。结果:正常小鼠在BMP肌肉内植入1周内,在BMP周围有大量间质细胞增殖,2周后才出现软骨化骨和骨小结形成,其骨髓基质细胞的SCF表达明显高于自体骨髓;BMP植入组的再障小鼠,不仅血象与对照组相比有明显改善,而且死亡率也明显下降,有46.7%存活超过3个月,其血象完全恢复正常,骨髓和脾脏的组织形态学改变也恢复正常。对照小鼠除1只存活超过3个月外(占6.7%),其余均死于急性再生障碍性贫血。结论:肌肉内植入BMP-4可诱导髓外造血,其机制可能与BMP-4诱导成年自体肌肉内存在的干细胞向造血分化有关,这一结果将为干细胞治疗提供了一条新的思路。     

VEGF与Notch信号通路对再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞的调控机制研究

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)通过Notch信号通路对再生障碍性贫血（AA）患者骨髓造血微环境的影响,探讨VEGF与Notch信号通路对骨髓间充质干细胞（MSC）的调控机制。方法选取AA患者与健康志愿者的骨髓MSC,VEGF干预后分别采用CCK-8法、流式细胞仪检测MSC细胞增殖、分化情况,分别采用Westernblot、qRT-PCR法检测MSCVEGF与Notch信号通路相关蛋白、基因表达情况,采用免疫荧光法检测MSC内皮分化能力。结果CCK-8法检测显示,VEGF的干预可明显上调AA患者MSC的增殖能力。流式细胞仪检测显示,VEGF通过阻断S期细胞促进AA患者MSC的增殖,抑制其凋亡。Westernblot、qRT-PCR法检测显示,AA患者MSCVEGF与Notch信号通路相关蛋白、基因表达受抑制,VEGF的干预可促进MSC的Notch信号通路传导。免疫荧光法检测提示,AA患者MSC内皮分化能力弱于正常MSC。结论VEGF或可通过Notch信号通路调控AA患者MSC,从而改善骨髓造血微环境。     

苯诱发再生障碍性贫血小鼠骨髓病理改变及血液细胞的变化

目的：观察苯诱发再生障碍性贫血（再障）模型小鼠骨髓组织的病理改变及血液细胞的变化。方法：清洁级Balb/c小鼠40只,随机分为正常对照组及再障模型组。正常对照组注射玉米油4ml/kg;再障模型组注射苯油混合液（给苯剂量1ml/kg体重）,造模14d后取材。结果：与正常对照组比较,再障模型组小鼠骨髓有核细胞及血细胞数目明显减少,骨髓组织病理学观察显示造血细胞减少,非造血细胞增加。结论：苯试剂可造成再障小鼠骨髓组织损伤及血液细胞减少。     

补肾生血方剂对苯诱发再生障碍性贫血小鼠造血及免疫功能调节的研究

目的：通过观察补肾生血方剂对苯诱发再生障碍性贫血模型小鼠免疫及造血功能的影响,初步探讨中药的调节机制。方法：将清洁级Balb/c小鼠60只随机分为正常对照组、再障模型组和补肾生血方剂治疗组3组各20只;对照组注射玉米油4ml/kg;模型组和治疗组注射苯油混合液（苯剂量为1ml/kg体重）,连注14天;然后治疗组小鼠按临床等效剂量的5倍灌胃给以相当于生药量为5.92g/（kg·d）的补肾生血方药,连续4周。结果：（1）模型组和治疗组小鼠体重及脾指数和胸腺指数较对照组均下降,差异有统计学意义（P〈0.01）;而治疗组小鼠胸腺指数和脾指数明显高于模型组,差异有统计学意义（P〈0.01）。（2）模型组和治疗组小鼠外周血WBC、RBC、Hb、PLT的水平较对照组均明显下降,差异有统计学意义（P〈0.01）,且以模型组最明显;而治疗组与模型组比较,除RBC外,余3项指标均高,差异有统计学意义（P〈0.01）。（3）模型组和治疗组骨髓组织较对照组均有不同程度的病理改变,且以模型组最明显,而治疗组的病理变化较模型组轻微。（4）模型组和治疗组小鼠血清sIL-2含量较对照组明显升高,差异有统计学意义（P〈0.01）;而TNF-α含量略升高,但差异无统计学意义（P〉0.05）。治疗组sIL-2含量低于模型组,差异有统计学意义（P〈0.01）;但TNF-α含量较模型组无统计学差异（P〉0.05）。结论：补肾生血方剂能明显改善苯诱发再障小鼠模型的骨髓造血功能,并可有效调节血清TNF-α、sIL-2的水平,部分纠正了模型小鼠免疫功能的紊乱。     

AA病人血浆和骨髓瘦素及其受体表达与意义

目的探讨瘦素及其受体在再生障碍性贫血（AA）病人血浆和骨髓中的表达及其意义。方法应用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测38例AA病人（其中重型者8例、非重型者30例）及22例健康体检者血浆中瘦素及可溶性瘦素受体（sLR）的水平;应用PV-6000二步法检测32例AA病人（其中重型者14例、非重型者18例）及17例对照组骨髓组织中瘦素及其受体的表达。结果 AA病人血浆瘦素水平为（14.16±4.50）μg/L,显著高于对照组的（10.87±3.21）μg/L（t=3.008,P〈0.01）;AA病人血浆sLR水平为（16.85±4.89）μg/L,显著低于对照组的（20.67±6.18）μg（t=2.641,P〈0.05）。AA病人骨髓组织中瘦素表达水平为0.192±0.030,显著高于对照组的0.168±0.024（t=2.808,P〈0.01）;AA病人骨髓组织中瘦素受体表达水平为0.198±0.041,显著低于对照组的0.235±0.054（t=2.704,P〈0.05）。重型AA病人血浆及骨髓中瘦素水平高于非重型者,瘦素受体水平低于非重型者,但差异无显著性（P〉0.05）。结论 AA病人血浆及骨髓中瘦素水平升高,而受体水平下降;瘦素在AA的发生发展中有失利用现象存在。     

当归多糖干预再生障碍性贫血模型小鼠线粒体功能异常机制研究

目的:研究当归多糖(ASP)对再生障碍性贫血(AA)模型小鼠线粒体功能异常的作用机制。方法:AA小鼠随机分为对照组、再障组和治疗组,再障组与治疗组通过~(60)Coγ、腹腔注射环磷酰胺和氯霉素造模后,分别用生理盐水或ASP喂养2周。透射电子显微镜观察骨髓的线粒体超微结构。从骨髓细胞中分离出Lin~-Sca-1~+c-Kit~+(LSK)细胞,通过流式细胞仪检测线粒体膜电位(MMP),并进行活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、细胞色素氧化酶(COX)和单胺氧化酶(MAO)的相关检测。结果:与对照组比较,再障组和治疗组骨髓的单个核细胞、BFU-Es和CFU-Es、LSK细胞中的线粒体数量减少,MMP降低。应用ASP干预后,骨髓的单个核细胞、BFU-Es和CFU-Es等数值相比再障组显著增加。ASP可以纠正LSK线粒体数量下降的趋势,ASP纠正AA模型小鼠异常的MAO和COX水平,并通过降低ROS和MDA,纠正异常的膜电位而改善线粒体的功能(P0.05或P0.01)。结论:ASP可能通过上调线粒体膜电位、改善线粒体膜稳定性,纠正AA干细胞的过度凋亡。     

穿龙薯蓣皂苷对障碍再生性贫血小鼠骨髓T细胞亚群的影响*

[目的]观察穿龙薯蓣皂苷治疗再生障碍性贫血(简称再障)小鼠的疗效及骨髓CD3+、CD4+、CD8+的表达。[方法]建立再障小鼠模型,各组分别喂饲生理盐水、穿龙薯蓣皂苷、环孢菌素A、雷公藤多苷,连续给药14 d,取骨髓单个核细胞培养24h后,应用流式细胞术检测CD3+、CD4+、CD8+的表达水平。[结果]模型组CD3+和CD4+表达明显低于正常组(P<0.05),CD8+表达高于正常组(P<0.05),各治疗组与模型组相比均有明显差异(P<0.05),穿龙薯蓣皂苷中、高剂量组与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05),与两阳性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。CD4+/CD8+比值:模型组低于正常组(P<0.05),中剂量组与模型组相比有明显差异(P<0.05),其余各治疗组与模型组相比均无明显差异(P>0.05)。[结论]薯蓣皂苷能调节提高再障小鼠骨髓CD3+、CD4+的表达,抑制小鼠骨髓CD8+的表达,促进CD4+/CD8+比值的恢复,从而抑制骨髓T细胞的异常激活,促进骨髓造血功能的恢复。     

rhBMP-2对再生障碍性贫血小鼠骨髓造血恢复的促进作用

探究了人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)对再障小鼠的治疗作用。采用5-FU联合白消安建立小鼠再障模型,通过干预rhBMP-2进行治疗。考察了各实验组小鼠白细胞数、骨髓单核细胞数、体重、存活率、脾系数、粒系-巨系细胞集落(CFU-GM)数以及骨髓单核细胞中CD34⁺细胞比例,进行股骨、脾脏HE切片分析。结果表明,相较于再障对照组,rhBMP-2治疗组小鼠的白细胞数、存活率、CFU-GM集落数及骨髓单核细胞数显著提高,并且骨髓单核细胞中的CD34⁺细胞含量也提高,显著改善脾脏功能和缓解骨髓抑制,证实rhBMP-2能够促进再障小鼠造血损伤的修复。     

Panaxdiol Saponins Component Promotes Hematopoiesis and Modulates T Lymphocyte Dysregulation in Aplastic Anemia Model Mice

Objective: To investigate the potential efficacy of panaxadiol saponins component (PDS-C) in the treatment of aplastic anemia (AA) model mice. Methods: Totally 70 mice were divided into 7 groups as follows: normal, model, low-, medium-, high-dose PDS-C (20, 40, 80 mg/kg, namely L-, M-, H-PDS-C), cyclosporine (40 mg/kg), and andriol (25 mg/kg) groups, respectively. An immune-mediated AA mouse model was established in BALB/c mice by exposing to 5.0 Gy total body irradiation at 1.0 Gy/min, and injecting with lymphocytes from DBA mice. On day 4 after establishment of AA model, all drugs were intragastrically administered daily for 15 days, respectively, while the mice in the normal and model groups were administered with saline solution. After treatment, the peripheral blood counts, bone marrow pathological examination, colony forming assay of bone marrow culture, T lymphocyte subpopulation analysis, as well as T-bet, GATA-3 and FoxP3 proteins were detected by flow cytometry and Western blot. Results: The peripheral blood of white blood cell (WBC), platelet, neutrophil counts and hemoglobin (Hb) concentration were significantly decreased in the model group compared with the normal group (all P<0.01). In response to 3 dose PDS-C treatment, the WBC, platelet, neutrophil counts were significantly increased at a dose-dependent manner compared with the model group (all P<0.01). The myelosuppression status of AA was significantly reduced in M-, H-PDS-C groups, and hematopoietic cell quantity of bone marrow was more abundant than the model group. The colony numbers of myeloid, erythroid and megakaryocytic progenitor cells in the model group were less than those of the normal mice in bone marrow culture, while, PDS-C therapy enhanced proliferation of hematopoietic progenitor cells by significantly increasing colony numbers (all P<0.01). Furthermore, PDS-C therapy increased peripheral blood CD3+ and CD3+CD4+ cells and reduced CD3+CD8+ cells (P<0.05 or P<0.01). Meanwhile, PDS-C treatment at medium- and high doses groups also increased CD4+CD25+FoxP3+ cells, downregulated T-bet protein expression, and upregulated GATA-3 and FoxP3 protein expressions in spleen cells (P<0.05). Conclusion: PDS-C possesses dual activities, promoting proliferation hematopoietic progenitor cells and modulating T lymphocyte immune functions in the treatment of AA model mice.     

Expression of adherent molecule and cyclin by ligustrazine in bone marrow of mice with immune-induced aplastic anemia

Ｉｔｈａｓｂｅｅｎｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｒｏｕｇｈｒｅｎｏｖａ－ｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒａｎｇｉｕｍａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｏｘｙｇｅｎｓｕｐｐｌｙｌｉｇｕｓｔｒａｚｉｎｅｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄａｄｈｅｓｉｏｎｆｕｎｃｔ...     

当归补血汤治疗癌性贫血的实验研究

目的：研究不同浓度当归补血汤对荷瘤小鼠补血作用。方法：建立生长良好的H22小鼠的腹水模型,将荷瘤小鼠随机分为2组（模型组、当归补血汤组）,另外再选12只健康小鼠为空白对照组（正常组）。给予正常组和模型组小鼠每日灌胃生理盐水,当归补血汤组给予当归补血汤灌胃（剂量为12g.kg·d^-1）。分组后连续给药1Od,于末次给药24h眼球采血后处死小鼠收集骨髓。结果：实验数据表明,与正常组相比,模型组红细胞数及血红蛋白含量明显减少,提示可能存在癌性贫血现象。当归补血汤组相比模型组其红细胞数、血红蛋白有所上升,提示当归补血汤可能对抗癌性贫血。将各组骨髓细胞体外培养,当归补血汤组能减缓癌性贫血小鼠骨髓红系祖细胞的凋亡速度。结论：当归补血汤对荷瘤小鼠有一定补血作用。     

补肾生血解毒方对免疫介导的再生障碍性贫血小鼠淋巴细胞分化及血液学参数的影响

目的探讨补肾生血解毒方对免疫介导的再生障碍性贫血(AA)小鼠淋巴细胞分化及血液学参数的影响。方法以~(60)Co-γ射线照射结合异源免疫细胞尾静脉注射致小鼠骨髓造血抑制模型,阳性对照药物免疫抑制剂环孢素A、中药补肾生血解毒方干预治疗,连续给药28 d。分别于第7、14、21、28天用血细胞计数仪检测外周血中血液学参数的变化;给药结束后用流式细胞仪检测小鼠外周血细胞中T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)比率的改变。结果与模型组相比,环孢素A组与补肾生血解毒方组在第21、28天,小鼠外周血中红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、白细胞(WBC)数量均升高(P0.05),差异有统计学意义。与模型组相比,补肾生血解毒方组大鼠外周血中CD3~+CD4~+细胞比率增多(P0.01),CD3~-CD19~+细胞和CD3~-NK1.1~+细胞比率降低(P0.01),差异有统计学意义。结论补肾生血解毒方能够通过调控AA小鼠淋巴细胞分化修复骨髓造血功能,达到治疗AA的目的。