不同抗凝剂和激活剂组合在自体富血小板血浆凝胶支架促进脂肪干细胞增殖的影响

目的 探讨不同抗凝剂和激活剂组合在自体富血小板血浆(PRP) 凝胶支架对脂肪干细胞(ADSCs) 增殖的影响.方法 在制作自体富血小板血浆支架并植入ADSCs 过程中,使用不同抗凝剂(肝素、EDTA) 和激活剂(凝血酶、Ⅰ型胶原),分为EDTA 与凝血酶组,EDTA 与Ⅰ型胶原组,肝素与凝血酶组,肝素与Ⅰ型胶原组,并设置空白对照组.每日计数细胞并绘制细胞生长曲线,第2、3、4、6 天用MTT 比色法分析各组脂肪干细胞的存活和增殖能力,以ELISA 定量检测生长因子TGF-β1 及细胞的Ⅱ胶原.通过RT-PCR 测定sox-9 基因的表达.结果 与空白对照组相比,各组均保持较高的增殖活性(P<0.05),EDTA 与凝血酶组脂肪干细胞增殖计数最高.各组富血小板血浆均能明显促进生长因子TGF-β1 的释放和Ⅱ型胶原合成以及sox-9 基因的表达,其中EDTA 与凝血酶组生长因子TGF-β1 和Ⅱ胶原量以及sox-9 基因的表达最高.结论 EDTA 与凝血酶组自体富血小板血浆(PRP) 对促进脂肪干细胞增殖效果最好.     

脂肪干细胞和自体富血小板血浆载体复合物体内构建血管化组织工程脂肪的可行性及疗效分析

目的 分析脂肪干细胞以及自体富血小板血浆作为载体复合物在体内进行血管化组织工程脂肪构建的可行性以及应用效果.方法 取吸脂术后健康成人的脂肪组织,并分离出脂肪干细胞,进行原代以及传代培养,以BrdU标记第3代脂肪干细胞,并进行定向诱导,配置细胞悬液,取细胞悬液5 mL+富血小板浆工作液100 μL(实验组,n=10)或DMEM培养基100 μL(对照组,n=10)+纤维蛋白胶0.5 mL,分别移植于裸鼠的背部皮下.结果 人脂肪干细胞的形态表现较好,免疫荧光阳性标记率在90％以上;实验组新生组织湿重为(0.1525±0.0142)g,脂肪组织微血管数为(45.9±5.4)支,对照组分别为(0.0858±0.0104)g、(18.2±3.7)支,实验组均显著高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);两组新生组织经免疫荧光染色显示,细胞和以及部分微血管的内皮细胞核均呈现出绿色荧光.结论 脂肪干细胞、自体富血小板血浆以及纤维蛋白胶载体在机体内能够促进形成血管化组织工程脂肪,且自体富血小板血浆能够促进组织工程构建物重建血运,从而提高种子细胞的成活率.     

脂肪干细胞复合富血小板血浆对脂肪颗粒移植的影响

目的 探讨运用组织工程技术构建的组织工程脂肪对颗粒脂肪移植的影响。 方法 通过酶消化法获取脂肪干细胞(ASCs),采用两步离心法制备富血小板血浆(PRP),运用组织工程技术构建组织工程脂肪。根据移植物的组成不同分为ASCs+PRP+脂肪颗粒、PRP+脂肪颗粒、ASCs+脂肪颗粒及对照组(PBS+脂肪颗粒),分别移植入裸鼠皮下,并于移植后10 d、30 d、60 d及90 d取出移植物,进行大体观察及体积测量,镜下观察组织结构变化。 结果 90 d后ASCs+PRP+脂肪颗粒组移植物质地柔软、颜色淡黄,较其它组别更接近于正常的脂肪组织,且具有更多的存活体积(P<0.05)及更好的组织学形态。 结论 运用ASCs与PRP复合脂肪颗粒能够成功构建组织工程脂肪,是一种新的安全有效的修复颌面部及全身软组织缺损方法,具有较高的应用前景。     

富血小板血浆对体外培养人脂肪来源干细胞增殖及成脂分化的作用

目的观察富血小板血浆对体外培养的人脂肪来源干细胞增殖与成脂能力的影响。方法用酶消化法获取人脂肪来源干细胞,二次离心法制备自体富血小板血浆,将细胞分为实验组与对照组,实验组以含5%、10%、20%自体富血小板血浆的条件培养液干预,对照组不进行富血小板血浆干预。观察细胞形态学,以XTT比色法测定细胞增殖状况,油红O染色检测细胞成脂活性。结果富血小板血浆实验组较对照组细胞形态饱满、密度增大;XTT比色法显示实验组细胞增殖明显(P<0.01);实验组油红O染色阳性率较对照组增高明显(P<0.01)。结论富血小板血浆对体外培养的人脂肪来源干细胞增殖与成脂分化活性具有显著的促进作用。     

富血小板血浆诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的探讨富血小板血浆（PRP）在体外定向诱导脂肪干细胞向成骨细胞增殖分化的可行性。方法体外分离培养兔脂肪干细胞,传至第3代分为两组：对照组加入含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50mg/L抗坏血酸、1×10^-8mol/L地塞米松;实验组在此基础上加入10ml/L富血小板血浆进行诱导培养。观察细胞形态学变化,免疫组织化学染色测定细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色和茜素红染色检测矿化结节的形成。结果实验组脂肪干细胞经成骨诱导培养后,形态规则、多角型细胞增多,细胞倍增时间明显短于对照组。诱导7、10、14d细胞碱性磷酸酶活性均显著高于对照组（P〈0.01）。诱导21d与对照组比较,实验组形成的矿化结节数量增多,结节增大。结论在体外PRP能诱导并促进兔脂肪干细胞向成骨细胞方向分化。     

富血小板血浆与血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞增殖影响的比较

目的 通过对比分析富血小板血浆(platelet rich plasma, PRP)与血小板裂解液(platelet lysate, PL)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)生长增殖、细胞周期的作用,探讨二者对大鼠BMSCs生长增殖的影响。方法 取20只4周龄SD大鼠,采用全骨髓分离培养法扩增传代BMSCs,并采用流式细胞仪鉴定;另取30只12周龄SD大鼠心内采血,梯度离心法获得PRP,采用3次离心结合反复冻融法制备PL。取生长状态良好的第3代BMSCs进行实验,根据培养基成分不同将实验分为7组,普通完全培养基组(A组)、1%PRP条件培养基组(B组)、1%PL条件培养基组(C组)、5%PRP条件培养基组(D组)、5%PL条件培养基组(E组)、10%PRP条件培养基组(F组)及10%PL条件培养基组(G组)。MTT检测BMSCs增殖情况;免疫荧光检测BMSCs中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况;流式细胞仪检测BMSCs细胞周期的变化;蛋白质印迹检测CyclinD1和p27 Kip1蛋白表达。 结果 培养24、48、72 h时,1%、5%、10% PRP与1%、5%、10% PL条件培养基组均可以促进BMSCs的增殖,并具有时间、剂量依赖性(P<0.05);相同浓度的PRP与PL对BMSCs增殖作用的差异均无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光检测显示,PRP与PL均可以促进PCNA蛋白表达(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.01)。流式细胞仪检测显示,不同浓度PRP及PL条件培养基组与普通完全培养基组比较,G₀/G₁期细胞比例逐渐减少,S、G₂/M期细胞比例逐渐增多,增殖指数(PI)升高,差异具有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖性(P<0.05);然而,相同浓度的PRP及PL对BMSCs细胞周期的影响相似,差异均无统计学意义(P>0.05)。蛋白质印迹检测结果显示,5%PRP与5%PL能促进CyclinD1表达上调和p27 Kip1表达下调。结论 不同浓度PRP与PL能够通过上调CyclinD1以及抑制p27 Kip1蛋白的表达,加快体外培养的大鼠BMSCs的细胞周期进程,促进BMSCs增殖,并呈现显著的时间、剂量依赖性;BMSCs增殖过程中,相同浓度PL与PRP的促增殖效果相同,PL可能代替PRP促进骨缺损修复。     

脂肪干细胞联合富血小板血浆修复关节软骨研究进展

关节软骨容易受到损伤,而且缺乏自我修复的能力,传统治疗方法效果并不理想。随着再生医学和组织工程学的发展,越来越多的研究表明,自体脂肪干细胞联合富血小板血浆(PRP)修复关节软骨疗效显著。干细胞是尚未分化的原始细胞,在一定条件下可以向骨、软骨和脂肪等细胞分化;PRP是高度浓缩的血小板提取物,含有多种细胞生长因子。将干细胞与PRP联合应用,双重强化了关节软骨的修复作用,且来源自体,安全可靠。     

不同浓度富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖活性的影响

目的:探讨不同浓度的富血小板血浆(PRP)在不同时间段对体外培养骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖活性的影响。方法:将体外培养的MSCs分为对照组(单纯血清培养组)和不同浓度的PRP组(0.5%,1.0%,1.5%),用四唑盐比色法(MTT)检测在不同作用时间(24h、48h、72h)对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响。免疫组化方法检测细胞CD44、CD29、CD34的变化。结果:PRP中血小板浓度为全血的3.18倍,TGF-β和PDGF的浓度为全血的3.40倍;培养的细胞呈纤维状、克隆样生长;免疫组化表明CD29、CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达;MTT法显示不同浓度的PRP组在24h、48h、72h的平均吸光度(OD)值均高于对照组。结论:不同浓度的PRP在不同时间段可以促进骨髓间充质干细胞的增殖,并且随着浓度的增加PRP促进骨髓间充质干细胞增殖作用也增强。     

富血小板血浆联合自体脂肪在大阴唇填充手术中的应用

目的 探讨富血小板血浆联合自体脂肪在大阴唇填充手术中的治疗效果。方法 选择2021年1月—12月在南昌大学第一附属医院整形外科就诊、希望通过自体脂肪移植技术改善大阴唇外观的23例女性患者,年龄23～59岁,平均年龄（45.23±1.42）岁。依据术前与患者沟通的手术效果,将富血小板血浆和脂肪组织混合并进行注射填充;并分别使用GAIS评价量表、Likert评估量表及FSFI问卷评估手术效果。结果 每例患者每侧大阴唇的注射量为20～35 mL,术后即刻效果均非常满意,未出现感染、血肿等术后并发症。术后6个月随访,所有患者大阴唇形态符合美学标准;GAIS评价结果显示,完全改善率达82.61%,明显改善率为13.04%,轻度改善率为4.35%;阴唇术后效果的满意情况显示,非常满意占86.96%,满意占13.04%,无不满意或非常不满意者;6个月后患者的平均FSFI评分（53.81分）高于术前（31.80分,P<0.001）。结论 富血小板血浆联合自体脂肪注射填充可纠正大阴唇容量缺损,临床疗效良好。     

Differentiation of adipose-derived stem cells towards nucleus pulposus-like cells induced by hypoxia and three-dimensional chitosan-alginate gel scaffold in vitro

Background Injectable three-dimensional (3D) scaffolds have the advantages of fluidity and moldability to fill irregular-shaped defects, simple incorporation of bioactive factors, and limited surgical invasiveness. Adipose-derived stem cells (ADSCs) are multipotent and can be differentiated towards nucleus pulposus (NP)-like cells. A hypoxic environment may be important for differentiation to NP-like cells because the intervertebral disc is an avascular tissue. Hence, we investigated the induction effects of hypoxia and an injectable 3D chitosan-alginate (C/A) gel scaffold on ADSCs. Methods The C/A gel scaffold consisted of medical-grade chitosan and alginate. Gel porosity was calculated by the liquid displacement method. The pore microstructure was analyzed by light and scanning electron microscopy. ADSCs were isolated and cultured by conventional methods. Passage 2 BrdU-labeled ADSCs were co-cultured with the C/A gel. ADSCs were divided into three groups (control, normoxia-induced, and hypoxia-induced groups). In the control group, cells were cultured in 10% FBS/DMEM. Hypoxia-induced and normoxia-induced groups were induced by adding TGF-β1, dexamethasone, vitamin C, sodium pyruvate, proline, bone morphogenetic protein-7, and 1% ITS-plus to the culture medium and maintained in 2% or 20% O2, respectively. Histological and morphological changes were observed by light and electron microscopy. ADSCs were characterized by flow cytometry. Cell viability was investigated by BrdU incorporation. Proteoglycan and type II collagen were measured by safranin O staining and the Sircol method, respectively. mRNA expression of hypoxia inducing factor-1α (HIF-1α), aggrecan, and type II collagen was determined by RT-PCR. Results C/A gels had porous exterior surfaces with 80.57% porosity and 50–200 μm pore sizes. Flow cytometric analysis of passage 2 rabbit ADSCs showed high CD90 expression, while CD45 expression was very low. The morphology of induced ADSCs resembled that of NP cells. BrdU immunofluorescence showed that most ADSCs survived and proliferated in the C/A gel scaffold. Scanning electron microscopy showed that ADSCs grew well in the C/A gel scaffold. ADSCs in the C/A gel scaffold were positive for safranin O staining. Hypoxia-induced and normoxia-induced groups produced more proteoglycan and type II collagen than that in the control group (P <0.05). Proteoglycan and type II collagen levels in the hypoxia-induced group were higher than those in the normoxia-induced group (P <0.05). Compared with the control group, higher mRNA expression of HIF-1α, aggrecan, and type II collagen was detected in hypoxia-induced and normoxia-induced groups (P <0.05). Expression of these genes in the hypoxia-induced group was significantly higher than that in the normoxia-induced group (P <0.05). Conclusions ADSCs grow well in C/A gel scaffolds and differentiate towards NP-like cells that produce the same extracellular matrix as that of NP cells under certain induction conditions, which is promoted in a hypoxic state.     

脂肪组织来源干细胞的细胞生物学研究

目的 探索从脂肪抽吸物中脂质部分分离、培养脂肪组织来源干细胞(ASCs)的方法,并通过其生长动力学、形态学、分化能力、细胞衰老和表面标记物轮廓5个方面的特征进行鉴定.方法 酶消化法处理脂类抽吸物,分离培养ASCs,观察细胞形态;MTT比色法测细胞活性并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,丫啶橙染色检测细胞的衰老;流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定其表面分子表达;成脂定向诱导分化后油红"O"染色定性.结果 原代培养的ASCs呈成纤维细胞样贴壁生长,具有很强的增殖能力;MTT比色法活性测定均证实ASCs具有很强的增殖活性,细胞周期研究发现ASCs具有干细胞的特性.丫啶橙染色3、4、6、8代无明显衰老.流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CD44、CD34的表达均成阳性;HLA-DR、CD133表达为阴性;免疫化学染色发现Ⅷ因子、CD31、CD34、CD105、SMA表达阳性;成脂诱导分化2周后,细胞内可见有大量脂滴,油红"0"染色可见胞浆内有大量红染颗粒.结论 自人体脂类抽吸物中通过酶消化法能分离和培养出具有干细胞特性的成纤维细胞样细胞群,该细胞具有很强的增殖活性且不易衰老,能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂分化.     

诱导脂肪干细胞成软骨分化的研究进展

由创伤或其他病因引起的关节软骨病变通常难以自愈,且目前临床上的治疗方法疗效欠佳。脂肪干细胞 (adipose derived stem cells,ADSCs)是一种来自脂肪组织、具有多向分化潜能的干细胞,基于ADSCs成软骨分化能力的 组织工程学疗法为关节软骨缺损的修复再生提供了新的思路。体外诱导ADSCs分化成软骨的方法主要是采用生长因 子和支架材料模拟体内微环境,进而促进ADSCs向软骨细胞分化,其相关应用已取得初步成功。     

大鼠脂肪干细胞源性神经球分化为雪旺细胞样细胞

目的:体外诱导大鼠脂肪干细胞为雪旺细胞样细胞?方法:分离?培养和鉴定大鼠脂肪干细胞;表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导大鼠脂肪干细胞为神经球,并对神经球进行鉴定;视黄酸?forskolin?血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)及heregulin等诱导神经球为雪旺细胞样细胞,并对雪旺细胞样细胞的形态和表面标志物进行鉴定?结果:大鼠脂肪干细胞为成纤维细胞样单层贴壁细胞,表达间质细胞标志物fibronectin,不表达神经干细胞标志物nestin,并能进行成脂和成骨分化?大鼠脂肪干细胞能被诱导为悬浮生长的神经球;神经球表达nestin,不表达fibronectin,并能进一步分化为雪旺细胞样细胞?雪旺细胞样细胞呈双极或三极,并表达雪旺细胞经典标志物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)?S100和p75?结论:大鼠脂肪干细胞能在体外分化为雪旺细胞样细胞?这种雪旺细胞样细胞对于治疗神经系统疾病具有重要意义?     

人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化

目的 通过成人脂肪体外分离培养脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）研究其生理特性及在特定培养条件下向成骨分化,探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景.方法 从成人脂肪中利用胶原酶消化法分离并体外培养干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,P3代脂肪干细胞通过成骨诱导液诱导向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶（AKP）,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OP）表达变化.结果 成人脂肪间质来源的ADSCs,能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞检测证实其特异表达相关干细胞表面标记物;成骨诱导后表现出呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性,茜素红染色阳性,诱导培养0、3、7、14、21、28天后RT-PCR定量检测证实细胞中ALP、OP阳性表达.结论 成人脂肪中可分离得到ADSCs,其稳定表达特异性的表面抗原,并且经过相应诱导培养后可向骨细胞分化,阳性表达OP、ALP,可作为优良的骨组织工程的种子细胞来源.     

不同浓度人脂肪干细胞与脂肪颗粒混合种植对裸鼠脂肪细胞增长的影响

目的 探讨不同浓度脂肪干细胞对自体脂肪移植的作用,为临床提供理论依据。方法 BALB/c裸鼠随机分为4组（n=2）,裸鼠背部两侧筋膜下分别注入0.5mL待移植脂肪颗粒与不同浓度脂肪干细胞的混合物,脂肪干细胞浓度如下： 200μL脂肪颗粒.A组1×106、B组1×105、C组1×104脂肪干细胞,D组（对照组）注入单纯脂肪颗粒。每2周测量脂肪团块长短径观察裸鼠背部脂肪团块生长情况。6周后处死裸鼠,取出脂肪组织,称质量,H-E染色及CD31血管免疫组化染色对脂肪组织存活、脂肪细胞形态及组织血管化状态进行评价。结果 脂肪团块长短径测量显示,脂肪团块均有缩小且各组间差异无统计学意义。6周后,A、B、C、D各组之间脂肪组织质量差异均有统计学意义（P<0.01）。H-E染色提示B、C、D组脂肪细胞生长良好。CD31血管免疫组化检测显示B组微血管形成情况良好。结论 脂肪干细胞浓度过高时,与脂肪组织的生长竞争导致脂肪细胞的存活率降低。受区空间容量也对脂肪干细胞混合脂肪颗粒的生长产生了影响。