两种人抗失巢凋亡骨肉瘤细胞模型建立方法的比较

目的比较琼脂糖平铺法与poly-HEMA包被法悬浮培养人骨肉瘤细胞建立人抗失巢凋亡骨肉瘤细胞模型的异同和优劣。方法选择hFOB1.19恶性转化细胞和SaOS-2骨肉瘤细胞,分别采用琼脂糖平铺法和poly-HEMA包被法进行悬浮培养建立人抗失巢凋亡骨肉瘤细胞模型,倒置相差显微镜、透射电子显微镜观察悬浮培养后细胞的形态学改变。结果琼脂糖平铺法悬浮培养人骨肉瘤细胞可成功建立人抗失巢凋亡骨肉瘤细胞模型,且与poly-HEMA包被法相比较,琼脂糖平铺法价格经济、操作容易、效果更优。结论琼脂糖平铺法悬浮培养细胞建立抗失巢凋亡细胞模型更适用。     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导caspase-8依赖的骨肉瘤细胞凋亡机制研究

目的：探讨蛋白酶体抑制剂Z-LLL-CHO(MG132)对人骨肉瘤细胞MG-63的作用以及可能作用机制。方法:将不同浓度的MG132作用于骨肉瘤细胞MG-63，采用显微镜观察形态改变、电镜观察细胞超微结构、MTT检测细胞增殖活力、琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡、流式细胞仪分析细胞凋亡率以及细胞周期改变、RT-PCR检测基因转录、Western blotting检测蛋白表达水平。 结果:MG132能有效诱导人骨肉瘤细胞系MG-63细胞周期在G₂-M期的停滞，并引起MG-63的凋亡，出现凋亡的典型形态学改变，同时出现p27kip1蛋白的积累，caspase-8活化蛋白表达增加，Bax∶Bcl-2蛋白含量比例的增高，而对正常的人二倍体成纤维细胞，MG132并未表现诱导其凋亡的活性。结论:MG132引起的人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡也许是与caspase-8、p27kip1和Bcl-2蛋白相关的。     

失巢凋亡

失巢凋亡作为一种特殊的程序化细胞死亡形式,在机体发育、组织自身平衡、疾病发生和肿瘤转移中起重要作用。对失巢凋亡的深入研究,逐步揭示了其分子机制。失巢凋亡通过传统的细胞凋亡途径诱导细胞死亡。整合蛋白感知和传导细胞外基质信号而控制细胞的粘附和存活。B(?)l-2和某些B(?)l-2相关蛋白广泛参与细胞失巢凋亡的调节。多种蛋白激酶信号分子在失巢凋亡中形成调节枢纽。近期研究揭示了一种抑制失巢凋亡和诱导肿瘤转移的蛋白,称作TrkB,为失巢凋亡抑制与肿瘤恶性浸润性的关系提供了实验依据。     

Fas 抗原和caspase-8调控细菌氧化还原蛋白azurin诱导的人骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的：探讨Fas抗原和caspase-8 在细菌氧化还原蛋白azurin诱导人骨肉瘤细胞凋亡中的调控机制及作用。 方法: 用150 mg/L浓度的azurin处理U2OS 细胞,分别作用6、12、24和48 h。细胞免疫化学法检测Fas 抗原的表达。用荧光试剂盒检测caspase-8 的活性。流式细胞仪检测azurin和抗-Fas-抗体诱导的骨肉瘤细胞凋亡百分率,以及加入caspase-8活性抑制剂IETD-FMK后凋亡百分率的变化。 结果: Azurin诱导U2OS 细胞凋亡后,与对照组比较,Fas 抗原表达强度增加(P<0.01)，caspase-8活性升高(P<0.01)。Fas 抗原表达和caspase-8 活性随着azurin作用时间的延长而逐渐升高,至24 h后达到高峰,然后缓慢下降,但仍显著高于对照组(P<0.01) 。Fas抗原的表达与caspase-8 活性变化呈显著正相关(r=0.873，P<0.01)。表达增强的Fas 抗原具有转导凋亡信号的功能,抗-Fas抗体借此增强azurin诱导U2OS细胞凋亡的作用。Caspase-8 活性抑制剂IETD－FMK能阻断caspase-8 活化而抑制 azurin 或抗-Fas抗体诱导的U2OS细胞凋亡,与抑制剂组比较,细胞凋亡百分率显著差异(P<0.01)。 结论： Fas 依赖途径可能为细菌氧化还原蛋白azurin诱导U2OS 细胞凋亡主要机制之一， caspase-8活性上调可能在凋亡过程中发挥重要作用。     

人参皂苷Rh2对人骨肉瘤细胞MG-63凋亡的影响

目的:探讨人参皂苷Rh2对人骨肉瘤细胞MG-63凋亡的影响,并初步探讨可能的分子机制。方法:采用流式细胞术Annexin V-PI双染法和MTT法检测MG-63细胞的凋亡变化;免疫印迹法检测Bcl-2、Bax、Cyt C和激活型caspase-3的蛋白水平。结果:流式细胞术和MTT法结果显示人参皂苷Rh2呈浓度依赖性促进MG-63细胞的凋亡。免疫印迹法结果表明,与空白对照组相比,给药组细胞Bax的蛋白表达显著增加,Bcl-2的蛋白表达显著减少,Bcl-2/Bax比值减少;线粒体中Cyt C蛋白表达显著减少,而胞浆中表达显著增加;激活型caspase-3蛋白水平显著增加(P0.05)。结论:人参皂苷Rh2呈浓度依赖性促进MG-63细胞的凋亡,其凋亡过程可能与调控线粒体凋亡通路相关蛋白有关。     

肺癌细胞系A549抗失巢凋亡的研究

目的研究FAK调节肺癌细胞系A549抗失巢凋亡的功能和信号通路。方法应用光镜观察,Hoechst33342染核、电镜、Western印迹、RNA干涉技术、P13K的抑制剂,对FAK调节肺癌细胞A549抗失巢凋亡的功能和信号通路进行研究。结果发现肺癌细胞系A549具有抗失巢凋亡的能力;A549细胞悬浮培养时,FAKtyr-397／861／925的活性随时间的延长逐渐增加后降低,磷酸化的P13K和AKT表现出与其一致的活性变化;通过RNA干涉实验发现干涉组比对照组细胞出现明显的凋亡现象,同时P13K／AKT的磷酸化水平下降;P13K的抑制剂组比对照组出现更多的凋亡细胞。结论FAK在肺癌细胞A549抗失巢凋亡中发挥了重要作用,其抗失巢凋亡的机制是通过激活下游P13K／AKT通路来实现的。     

白杨素对人骨肉瘤细胞MG-63增殖与凋亡的影响

目的探讨白杨素对人骨肉瘤细胞MG-63增殖与凋亡的影响及可能机制。方法采用不同浓度白杨素(0,2.5,5,10,20,40 mg/L)作用于MG-63细胞后,MTT法和流式细胞仪分别检测白杨素对细胞增殖与凋亡的影响。蛋白免疫印迹检测白杨素(20 mg/L)对骨肉瘤细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、Survivin蛋白表达的影响。Real-time PCR方法检测白杨素(20 mg/L)对骨肉瘤细胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA、Survivin mRNA表达水平的影响。结果白杨素抑制MG-63细胞增殖、促进MG-63细胞凋亡,并呈浓度依赖性。经20 mg/L白杨素处理后,MG-63细胞Bax与Caspase-3蛋白与mRNA表达水平显著升高,而Bcl-2与Survivin蛋白与mRNA表达水平显著降低。结论白杨素在体外抑制MG-63细胞增殖,促进MG-63细胞凋亡,与调控凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Survivin的表达相关。     

流体剪切力通过Piezo1调控MG-63骨肉瘤细胞的凋亡

目的:探讨流体剪切力（FSS）对Piezo1的影响以及调控MG-63细胞凋亡的机制。方法:首先分两组Control和FSS组,FSS组施加FSS,Control组不干预,使用Western Blot检测两组caspase3和Piezo1的表达。再将细胞分为Control组、FSS组、GsMTx4组和FSS+GsMTx4组,FSS组加载FSS,GsMTx4组给予GsMTx4处理,FSS+GsMTx4组先给予GsMTx4处理后再加载FSS,检测各组凋亡相关蛋白caspase3、caspase9、BAD和Bax的表达水平。结果:60 min 12 dyn/cm2的FSS可上调MG-63细胞caspase3和Piezo1的表达,此外,FSS可通过上调Piezo1的水平从而促进caspase3、caspase9、BAD和Bax的表达水平。结论:FSS可通过Piezo1机械敏感离子通道促进MG-63人骨肉瘤细胞的凋亡,Piezo1可能是一种治疗骨肉瘤的新型分子靶点。     

臭灵丹中黄酮类化合物对人喉癌细胞Hep-2凋亡的影响及机制

目的:探讨中药臭灵丹中黄酮类化合物诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡的机制。方法:MTT法检测分离自臭灵丹的黄酮类化合物3,5-二羟基-6,7,3',4'-四甲氧基黄酮(HTMF)对2种正常细胞的毒性和对3种肿瘤细胞株的增殖抑制作用;采用流式细胞仪检测化合物对Hep-2细胞凋亡率的影响;Western blotting法检测凋亡蛋白caspase-3和caspase-9的变化。结果:HTMF显著抑制Hep-2细胞的增殖并呈浓度、时间双重依赖性关系,但对正常细胞Vero和EVC304的毒性较小,对A549和HepG2细胞抑制作用小。流式细胞仪检测结果显示HTMF对Hep-2细胞有促凋亡作用并呈明显的量效、时效关系。Western blotting结果显示HTMF可诱导Hep-2细胞中caspase-3和caspase-9蛋白的活化,并呈时间依赖性关系。结论:HTMF对人喉癌细胞Hep-2的生长有显著的抑制作用,其机制可能通过激活caspase-9进而活化caspase-3诱导Hep-2细胞凋亡。     

反义c-myc寡核苷酸诱导骨肉瘤细胞MG-63凋亡的实验研究

目的： 研究反义c-myc寡核苷酸诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用。方法： 设计反义c-myc寡核苷酸片段,转染入人骨肉瘤MG-63细胞，通过MTT法、流式细胞仪、HE染色及透射电镜方法，观察和分析其对人骨肉瘤MG-63细胞作用的效果。结果： MTT法示反义c-myc寡核苷酸可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖，10.0 μmol/L、作用48 h效果最明显；流式细胞仪检测证实反义c-myc寡核苷酸（终浓度10.0 μmol/L）诱导瘤细胞的凋亡率达37.92%，出现明显的凋亡峰，并可抑制c-myc基因蛋白的表达；细胞呈典型凋亡特征。结论： 反义c-myc寡核苷酸能有效诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡。     

miR-335靶向Sp1对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的调控

 目的：探讨 miR-335对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的调控是否通过靶向抑制Sp1基因的表达实现。方法：利用萤光素酶报告基因实验验证 miR-335能否靶向作用于Sp1基因的3’-非翻译区(untranslated region, UTR);利用real-time PCR和Western blotting分析Sp1 mRNA和蛋白表达的变化;通过 MTT法分析MG-63细胞增殖水平。结果：萤光素酶报告基因实验结果显示,miR-335可特异性结合于Sp1基因的3’-UTR。Real-time PCR和Western blotting结果显示,转染miR-335可减少Sp1蛋白的表达,但对mRNA表达无显著影响;转染Sp1表达质粒可上调Sp1 mRNA和蛋白表达。MTT结果显示,miR-335可抑制MG-63细胞增殖,转染Sp1表达质粒可部分逆转miR-335对MG-63细胞增殖的抑制作用。结论: miR-335可能通过靶向Sp1基因抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖。     

miR-192 enhances sensitivity of methotrexate drug to MG-63 osteosarcoma cancer cells

Chemo-resistance remains a considerable obstacle encountered in osteosarcoma (OS) therapy. Evidence has implied that a reduction in the expression of microRNAs (miRs/miRNAs) leads to exacerbated chemo-resistance. Hence, to better understand the role of miR-192 in the pathogenesis of OS during methotrexate (MTX) treatment, we restore miR-192 in the MG-63 cells and investigate the mechanisms, which are associated with MTX-resistance in OS. Exogenetic overexpression of miR-192 was established by transfecting miR-192 mimics into MG-63 cells using Lipofectamine. Trypan blue dye exclusion test was performed to evaluate the proliferation of the MG-63 cells. Chemo-resistance to MTX was determined using the MTT method after 48 h. ELISA cell death assay was performed to evaluate the apoptosis rate. The quantitative RT-PCR (RT-qPCR) was applied to determine the mRNA expression levels before and after the transfection. Our results illustrated that miR-192 is down-regulated in OS tumor cells. Transfection of miR-192 noticeably alleviated the mRNA expression levels of MMP9, c-Myc, K-Ras, CXCR-4, and ADAMTS compared with the control groups (P-values< 0.05). MTX Combination treatment with miR-192 noticeably elevated the cytotoxic effect of MTX and alleviated its IC₅₀ (P < 0.05). Moreover, miR-192 significantly increased the apoptotic effect of MTX. These results implied that miR-192 enhances the sensitivity of MG-63 cells to MTX. Collectively, our results elucidated that miR-192 contributes to chemo-sensitizing MG-63 cells to MTX, and could be considered as a promising agent to overcome MTX-resistance in OS.     

Prohibitin在姜黄素诱导人成骨肉瘤MG-63细胞凋亡过程中的调控机制

目的 探讨姜黄素（curcumin）诱导成骨肉瘤细胞凋亡前后,Prohibitin（PHB）蛋白的定位与表达变化,及PHB与凋亡相关基因产物的共定位关系。
方法 选择性抽提经姜黄素诱导处理前后的人成骨肉瘤MG-63细胞核基质蛋白,以蛋白质组学、免疫印迹法和激光扫描共焦显微技术对PHB在核基质中存在、分布及其与凋亡相关基因产物在MG-63细胞中的共定位关系进行了研究。结果 双向凝胶电泳、质谱鉴定和免疫印迹法结果显示,PHB存在于MG-63细胞核基质蛋白组分中,细胞凋亡后在细胞核基质蛋白中表达下调。免疫荧光显微镜观察显示,PHB定位于MG-63细胞核基质纤维上,经姜黄素处理后出现分布位置与表达水平的变化。激光扫描共焦显微镜观察结果显示,PHB在MG-63细胞凋亡过程中与Bax、Bcl-2、Fas、P53、c-Myc和Rb等基因产物具有共定位关系,且共定位区域发生了变化。 结论 PHB是一种核基质结合蛋白;PHB在MG-63细胞凋亡过程中的表达与分布变化,及其与细胞凋亡相关基因的共定位关系,对MG-63细胞凋亡具有重要影响。     

骨肉瘤细胞中ArgBP2的表达和定位

目的:构建真核表达载体GFP-hArgBP2并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位。方法:以pcDNA3.1-hArgBP2为模板,利用PCR扩增hArgBP2基因cDNA全长,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-C1中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉瘤细胞MG-63中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察GFP-hArgBP2在MG-63细胞中的定位,免疫沉淀的方法纯化hArgBP2蛋白。结果:hArgBP2基因cDNA全长成功构建到真核表达载体pEGFP-C1中,Western blot检测到了GFP-hArgBP2融合蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为97 000。GFP-hArgBP2在骨肉瘤细胞MG-63中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化hArgBP2蛋白。结论:成功地构建了GFP-hArgBP2真核表达质粒,同时鉴定了GFP-hArgBP2融合蛋白的表达,并纯化hArgBP2蛋白。GFP-hArgBP2蛋白主要定位在细胞质和核周。     

2-甲氧基雌二醇对骨肉瘤MG63细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的探讨2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2-ME)对骨肉瘤MG63细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法不同浓度(0、10、20、40μmol/L)的2-ME作用于肿瘤细胞后,通过显微镜观察细胞形态变化、MTT实验检测增殖抑制、流式细胞术检测细胞周期和凋亡、Western Blot和qRT-PCR实验检测相关分子表达情况。结果随着2-ME浓度的增加,细胞形态学观察显示肿瘤细胞数量逐渐减少、变形;MTT实验表明2-ME对肿瘤细胞增殖抑制作用逐渐增强;流式细胞术结果显示,2-ME能剂量依赖性的诱导肿瘤细胞凋亡,使肿瘤细胞周期阻滞在G_0/G_1期;Western Blot和qRT-PCR实验结果表明,细胞内Bcl-2、VEGF的表达逐渐下降,而Caspase-3的表达则逐渐升高。结论2-ME能抑制骨肉瘤MG63细胞增殖、诱导凋亡,其作用机制可能与Bcl-2、VEGF、Caspase-3相关。     

辣椒素诱导人骨肉瘤细胞MG-63发生免疫原性细胞死亡

目的探讨辣椒素与顺铂能否抑制人骨肉瘤细胞MG-63增殖并诱导其免疫原性死亡(ICD)。方法 MTT检测细胞的增殖;线粒体膜电位分析细胞凋亡;流式细胞计量术检测细胞膜上钙网蛋白(CRT)表达量;荧光素酶法检测细胞外ATP的释放;ELISA检测细胞上清中高迁移率族蛋白1(HMGB1)的分泌。结果辣椒素及顺铂作用均能抑制细胞MG-63增殖(P0.01),且呈剂量依赖性;辣椒素和顺铂均可诱导MG-63细胞凋亡(P0.01),但只有辣椒素能诱导MG-63细胞内质网中CRT转移到细胞膜表面,且促进ATP及HMGB1的释放(P0.01)。结论辣椒素可诱导人骨肉瘤细胞凋亡及免疫原性死亡。     

乳酸链球菌素诱导氧化应激促进人骨肉瘤MG63细胞凋亡

目的:探讨乳酸链球菌素(nisin)对人骨肉瘤MG63细胞凋亡及其相关的氧化应激机制.方法:乳酸链球菌素单独或联合抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)处理MG63细胞后,采用CCK-8法检测细胞活力;annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡;2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(...     

白藜芦醇调控miR-34a表达对骨肉瘤MG-63细胞生长、侵袭和自噬的影响

目的:探讨白藜芦醇通过调控微小RNA-34a(miR-34a)表达对骨肉瘤MG-63细胞生长、侵袭和自噬的影响。方法:将骨肉瘤MG-63细胞分为对照组及10、20、40、60和80μmol/L白藜芦醇处理组。采用MTT法、Transwell小室和Western blot实验检测各组骨肉瘤细胞的活力、侵袭能力及自噬蛋白表达;RT-q PCR检测各组骨肉瘤细胞中miR-34a的表达。转染miR-34a模拟物(miR-34a mimic)及阴性对照(miR-34a NC)至骨肉瘤细胞,检测miR-34a mimic和miR-34a NC在白藜芦醇处理后对骨肉瘤细胞活力和侵袭能力的影响,Western blot检测自噬标志蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和beclin-1的蛋白表达。结果:与对照组相比,不同浓度的白藜芦醇可抑制肿瘤细胞的活力和侵袭能力,促进自噬(P0.05)。白藜芦醇可上调肿瘤细胞中miR-34a的表达,并具有剂量依赖性(P0.05),同时促使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,beclin-1蛋白表达量上调(P0.05)。miR-34a mimic可增加白藜芦醇对骨肉瘤细胞活力和侵袭能力的抑制,并进一步促进自噬。结论:白藜芦醇可能通过上调miR-34a表达抑制骨肉瘤MG-63细胞生长并促进其自噬。     

人骨肉瘤细胞株MG-63中肿瘤干细胞的生物学特性

背景：骨肉瘤干细胞在骨肉瘤的发生、复发及对化疗药物的耐药性中发挥关键作用,而目前关于骨肉瘤干细胞体外分离培养及生物学特性研究的报道甚少。 目的：从人骨肉瘤细胞株MG-63中分离出具有干细胞特征的高致瘤性细胞亚群,检测肿瘤干细胞特异性标志物CD105的表达。 方法：无血清悬浮培养法从人骨肉瘤细胞株MG-63中分离出骨肉瘤细胞球,应用流式细胞术检测细胞球中CD73、CD90、CD105的表达,免疫荧光法检测骨肉瘤细胞株及骨肉瘤细胞球中CD105的阳性率,免疫磁珠法分选出CD105⁺和CD105^-的细胞,传代后分别接种于NOD/SCID小鼠评估其致瘤性。 结果与结论：CD105在球体细胞中高表达,此类肿瘤细胞具有高侵袭性和高致瘤性,在NOD-SCID小鼠中仅需移植1 000个细胞即可形成肿瘤,这些细胞具有自主生长特性,能够在无血清条件下长期培养,CD105⁺骨肉瘤细胞显示了干细胞的生物学特性,CD105可能成为骨肉瘤干细胞的表面标志之一。