实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌方法的试验研究

目的建立金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR的快速检测方法,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据金黄色葡萄球菌femB基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于金黄色葡萄球菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌的方法。结果成功构建了金黄色葡萄球菌重组质粒标准品和金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR方法;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性试验,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;将模拟标本与分离培养对比,两者符合率为100%。结论金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为金黄色葡萄球菌感染诊断及食源性金黄色葡萄球菌污染的快速检测提供依据,可用于临床感染诊断及食品卫生监管、商品检验检疫等。     

DD3基因实时荧光定量RT—PCR检测前列腺癌特异性方法的建立

目的 建立DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法,为前列腺癌的快速诊断提供分子诊断依据.方法 根据Genebank中的 DD3 mRNA全序列,设计DD3基因的特异引物和探针,采用基因重组技术构建用于DD3基因检测的定量标准品;建立DD3基因的实时荧光定量方法.结果 成功构建了用于DD3基因荧光定量PCR检测的标准重组质粒和DD3基因实时荧光定量PCR方法;经稳定性、特异度、重复性和敏感度实验方法学评价,DD3基因实时荧光定量PCR方法的最低检测限为1.64 copy/ml,线性范围为1.64～1.64×1012copy/ml.结论 DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法的建立,将为前列腺癌特异性诊断及其临床应用奠定方法学基础.     

造血干细胞移植后BK病毒监测的临床意义

本研究旨在建立造血干细胞移植后BK病毒(BKV)感染的快速检测方法,探讨该方法的可行性和应用价值。根据BKV基因序列设计引物,构建用于检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测BKV的方法,并对36例造血干细胞移植术后患者的尿液标本中BKV含量进行检测。结果表明:成功构建了BKV的定量标准品和荧光定量PCR检测BKV的方法,并经过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证;在36例造血干细胞移植患者中有20例尿液定量检测出BKV,阳性率为55.56%,尿液负荷量BKV拷贝数为2.46×104-7.8×109/ml。结论:BKV实时荧光定量PCR检测方法的建立对造血干细胞移植后出血性膀胱炎的早期诊断、预防、治疗具有重要意义。     

实时荧光定量PCR检测志贺氏菌方法的实验研究

目的 建立志贺氏菌实时荧光定量PCR快速方法,探讨在志贺氏菌感染检测和食源性污染监测中的应用价值.方法 根据志贺氏菌ipaH基因设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测志贺氏菌的诊断方法;通过特异度、敏感度、稳定性和重复性,以验证方法的可行性.结果 成功构建了志贺氏菌重组质粒标准品,为方法学建立奠定基础;通过特异度、敏感度、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异度,最低检测限为103 copies/ml,相当于100cfu/ml的菌细胞,并具有良好的稳定性和重复性.结论 利用实时荧光定量PCR方法检测志贺氏菌,可直接用于临床粪便中沙门氏菌的快速检测,也可用于分离菌株的鉴定,以及食品、乳品等的检测,对志贺氏菌感染诊断,提高食(乳)品安全的卫生监督检测具有重要的意义.     

实时荧光定量PCR快速检测BCR-ABL融合基因激酶区M244V突变方法的建立

本研究建立一种敏感性好、特异性高的BCR-ABL融合基因M244V突变的检测方法。设计突变点特异性引物,优化实时荧光定量PCR反应体系和条件,建立检测BCR-ABL融合基因M244V点突变的定量PCR方法。结果表明,成功构建了M244V突变及野生的重组质粒标准品和M244V点突变的实时荧光定量PCR方法;验证结果表明该法具有较好敏感性、特异性和准确性。结论：BCR-ABL融合基因M244V突变的实时荧光定量PCR检测方法可用于临床CML患者M244V突变的检查。     

荧光定量PCR检测梅毒螺旋体方法的建立及初步应用

目的采用二聚体蝎型探针技术建立一种高敏感性和特异性的检测梅毒螺旋体(TP)的荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法。方法根据TP特异性外膜蛋白Gpd的基因序列设计引物和荧光探针,采用基因工程技术构建可用于TP定量的标准品,优化荧光定量PCR的反应体系和反应条件,建立检测TP的二聚体蝎型探针定量PCR。采用本研究建立方法和商品化荧光定量PCR试剂盒检测40例临床标本,对比分析检测结果的统计学差异。结果成功构建了TP重组质粒标准品和TP的二聚体蝎型探针定量PCR,该方法线性范围为101~108 copy/mL,灵敏度为10copy/mL,特异性和敏感性均为100.0%;二聚体蝎型探针定量PCR对疑似梅毒病例阳性检出率显著高于目前商品化Taqman荧光定量PCR试剂盒(82.5%vs 62.5%,P0.05)。结论成功建立了二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测TP的方法,为临床上TP的早期诊断和防控奠定了基础。     

实时荧光定量PCR法检测产气荚膜梭菌

目的:运用实时荧光定量PCR法检测产气荚膜梭菌,为早期快速诊断气性坏疽提供新方法.方法:以产气荚膜梭菌16s rDNA基因序列为模板,在其保守区域设计特异性引物与探针,将PCR扩增所得产物片段克隆,作为定量检测的标准品,绘制标准曲线.并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性、重复性及可行性.结果:实时荧光定量PCR法对产气荚膜梭菌的检测具有高度特异性,与创伤弧菌等24种相关细菌等均无交叉反应;检测灵敏度以纯菌计数达9×102cfu/mL,相当于9 cfu/反应;反应体系有较高稳定性;整个操作过程仅需3 h;300例创伤可疑分泌物样本的荧光定量PCR检测结果与细菌培养结果一致.结论:实时荧光定量PCR法特异、灵敏、快速,适用于产气荚膜梭菌的临床检测及突发事件的批量检测.     

建立检测产气肠杆菌的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR方法

目的 建立敏感、特异的普通聚合酶链反应(PCR)方法和TaqMan 荧光定量PCR方法对产气肠杆菌进行快速检测。方法 以产气肠杆菌组氨酸脱氢酶基因(hdc)为靶基因设计引物以及TaqMan FAM探针,建立对产气肠杆菌进行检测的普通PCR方法和TaqMan 荧光定量PCR方法,并评价该方法的特异性、灵敏性和稳定性。结果 普通PCR和TaqMan 荧光定量PCR方法均能对产气肠杆菌进行特异检测;普通PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为 100 copies/l和1.0105 cfu/g,TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为33 copies/l和1.0104 cfu/g;TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本检测的扩增曲线良好;在稳定性评价试验中,普通PCR方法的重复性良好,TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品检测Ct值的组内差异为0.15%~0.98%,组间差异为0.55%~1.63%。结论 本研究建立的检测产气肠杆菌的普通PCR方法和TaqMan 荧光PCR方法特异性好、灵敏度高,能够用于产气肠杆菌的快速检测。     

miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种用于肝癌早期诊断和监测的血清miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR检测方法。方法 采用Trizol法提取肝癌患者血清中总RNA,以肝癌发生具有代表性的miRNA-125a基因为检测序列,分别设计逆转录引物、扩增引物和Taqman探针; 构建和制备miRNA-125a重组质粒标准品,建立血清miRNA-125a Taqman 实时荧光定量PCR检测方法。结果 成功构建了miRNA-125a重组质粒载体,制备了miRNA-125a重组质粒标准品,建立了血清miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR扩增体系。经实验验证,所设计引物具有较好的特异性,引物的最低检测限为78.125 copies/μl; 对17例肝癌患者血清miRNA-125a的检测结果在(1.45×10²～3.52×10⁵)copies/μl之间。结论 血清miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立,为原发性肝癌早期诊断和监测提供一种新的分子诊断定量方法。     

人腺病毒-B55实时荧光定量PCR扩增方法的建立

目的构建人腺病毒(HAdV)-B55的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)扩增方法,并验证其检测性能。方法采用Beacon Designer 7软件设计针对HAdV-B55 Hexon基因序列的特异性引物,建立HAdV-B55的实时荧光定量PCR扩增方法,并评估其敏感性及特异性。结果建立了检测HAdV-B55的实时荧光定量PCR扩增方法,反应敏感性为0.08 PFU/反应体系,且特异性良好,与相关HAdV B组病毒均未检测到交叉反应。结论成功建立了针对我国HAdV-B55的特异性实时荧光定量PCR检测方法,为HAdV-B55的快速检测及防控提供了有力的支持。     

利用实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测人及动物粪便中的沙门菌

目的为了快速检测、鉴定沙门菌属细菌,提高食源性疾病暴发应对能力,本研究建立了针对沙门菌属的实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测方法,并对其特异性、敏感性和检测下限进行评价。方法筛选针对沙门菌的属特异基因,并建立该基因的qPCR检测体系,利用肠道不同种属细菌、不同亚种及血清型沙门菌属细菌、动物及人粪便样本评价该体系的特异度、灵敏度及检测下限。结果获得沙门菌的属特异基因ttrA,建立基于该基因的qPCR检测方法。发现该方法对纯DNA的最低检测下限为2拷贝/反应。对沙门菌属以外的肠道致病菌无扩增,对1 100株不同亚种及血清型的沙门菌的扩增结果均为阳性,对150份沙门菌致腹泻患者的粪便增菌液和210份动物带菌粪便增菌液均检测阳性。结论本研究建立的基于单一基因的沙门菌属快速分子检测方法具有特异度高、灵敏度高的特点,可用于快速筛查、鉴定沙门菌及由其引起的感染性腹泻。     

Twelve hour real-time PCR technique for the sensitive and specific detection of Salmonella in raw and ready-to-eat meat products

Rapid pathogen testing is vital to the food industry. Enzyme immunoassays (EIA) provide reliable negative results in 48 h, but a presumptive positive (suspect) EIA result must be confirmed by traditional culture methods, requiring an additional 72 h. Polymerase chain reaction (PCR) testing technology is accepted as an accurate diagnostic tool. However, traditional PCR techniques can require several days. We sought to develop a rapid, real-time quantitative PCR technique for detecting Salmonella spp. in food products. Salmonella spp. was inoculated into raw and ready-to-eat beef products. Total DNA was extracted and used as template for PCR amplification in the LightCycler (Roche Diagnostics Corp., Idaho Technology Inc., Idaho Falls, ID) PCR instrument. Salmonella-specific PCR primers were designed to amplify a 251 base pair product from the junction of SipB and SipC. Fluorescently-labeled hybridization probes were designed to anneal to SipB and SipC. Salmonella was detected down to 1 colony forming unit/ml in food products. The results of real-time PCR correlated 100% to those of visual immunoprecipitate and culture. PCR methods using the LightCycler can detect and confirm the presence or absence of Salmonella spp. in raw and ready-to-eat beef products within 12 h with increased sensitivity compared to traditional culture and EIA methods.     

实时荧光定量PCR检测DHX32 mRNA方法的建立及初步应用

目的建立实时荧光定量PCR(FQ-RT-PCR)检测DHX32 mRNA的方法并研究其在结直肠癌中的表达。方法用Taq-Man探针建立检测DHX32 mRNA的FQ-RT-PCR方法,评价其特异性、重复性及扩增效率,并用该法检测DHX32 mRNA在结直肠癌中的表达水平。结果批内变异系数1.1%～1.9%,批间变异系数1.2%～2.5%;扩增效率为0.85,相关系数为0.9990。癌组织DHX32 mRNA表达水平中位数为1.90×10-3(四分位间距5.47×10-3),明显高于癌旁组织0.09×10-3(四分位间距1.41×10-3),两者差异有统计学意义(P<0.05)。DHX32 mRNA表达水平与结直肠癌癌栓形成、淋巴结转移、组织学分级以及Dukes分期关系密切(P<0.05)。肿瘤的恶性程度越高,DHX32 mRNA表达水平越高。结论FQ-RT-PCR检测DHX32 mRNA的方法特异性好,重复性高,操作简单,无污染。DHX32 mRNA表达上调可能在结直肠癌发生、发展中起重要作用,其表达水平可作为结直肠癌恶性程度的评价指标。     

应用TaqMan荧光定量PCR技术建立HIV前病毒检测方法

目的建立HIV前病毒荧光定量PCR检测方法。方法常规培养8E5／LAV细胞,收集后计数,提取HIV前病毒核酸,运用实时荧光定量PCR法扩增晚期逆转录基因片段（HIVFL）。结果建立的实时荧光定量PCR技术检测灵敏度可达1拷贝,扩增结果稳定可靠。结论成功建立了HIV前病毒检测方法,为今后筛选和鉴定潜伏感染细胞以及评价抗-HIV药物的治疗效果奠定基础。     

人TIM-1和TIM-3 mRNA实时SYBR Green Ⅰ定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立实时SYBR Green I定量RT-PCR检测人TIM-1和TIM-3mRNA的方法。方法从人外周血单个核细胞提取的总RNA中逆转录扩增人TIM-1和TIM-3的cDNA,将将纯化的人TIM-1和TIM-3的扩增产物分别与pMD18-T Simple载体进行连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验。结果建立了TIM-1和TIM-3基因基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为103-107拷贝。阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,线性相关系数分别为1.00和1.00,扩增效率分别为1.070和1.023,批内及批间变异系数5%。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰。结论我们成功建立检测人TIM-1和TIM-3的实时荧光定量PCR方法,为进一步研究人TIM-1和TIM-3功能奠定基础。     

实时荧光定量PCR技术的理论研究及其医学应用

背景:实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.目的:对实时荧光定量PCR的理论进行研究并探讨其在医学方面的应用和进展.方法:以real.time fluorescence quota PCR,theorem,application为检索词,检索PubMed数据库(2000-01/2008-12).以实时荧光定量PCR,原理,应用为检索词,检索万方数据库(2000-0112008-12),清华同方中文系列数据库(2000-01/2008-12).文献检索语种限制为英文和中文.以细胞因子和肿瘤耐药基因的表达为评价指标.纳入实时荧光定量PCR技术的方法学研究和实时荧光定量PCR技术的医学应用研究.排除重复性研究和Meta分析.结果与结论:实时荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点,成为分子生物学研究中的重要工具.实时荧光定量PCR的应用范围非常广泛,包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定等,已广泛应用于医学临床,它能对结核分枝杆菌、乙型、丙型肝炎、爱滋病病毒、淋球菌、沙眼衣原体等病原体进行准确的定量检测.其定量范围极宽,无需做梯度稀释,特异性更强,克服了假阳性.由于传统的PCR技术不能准确定量,使其在实际应用方面受到很大限制.因此,对PCR产物进行准确定量,尤其是病毒性病原的动态监控,成为迫切需要.     

实时荧光定量聚合酶链反应在肺结核诊断中的应用

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在肺结核诊断中的应用价值。方法应用FQ-PCR对临床诊断肺结核及其他肺部疾病患者的临床标本进行结核分枝杆菌DNA定量检测,同时与涂片抗酸染色、BACTEC 960培养法作比对。结果 189例临床诊断肺结核患者FQ-PCR检测123例阳性,提示敏感度为65.1%(123/189),而涂片抗酸染色、BACTEC 960培养法分别为40.2%(76/189)、63.5%(120/189)。94例其他肺部疾病患者及20例健康对照者FQ-PCR检测均为阴性,特异度为100.0%。结论 FQ-PCR敏感度和特异度均高,检测过程简单、易标准化、全过程仅需4～5h,可用于结核病的快速诊断。     

四种检测方法用于上海市口岸管道水军团菌存在状况调查的研究

目的比较传统的平板培养法、普通聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR,real-time PCR)和荧光染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)结合荧光定量PCR的方法(EMA-荧光定量PCR)对管道水中军团菌的检测效果。方法于2010年对上海市2个口岸管道水进行采样,共采集132份。分别采用传统的平板培养法、普通PCR、荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR对水样中军团菌进行定性和/或定量分析。结果对132份管道水标本进行军团菌定性检测,平板培养法、普通PCR、荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR检出军团菌污染率分别为18.9%、20.5%、24.2%和24.2%。3种定量方法(平板培养法、荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR)对阳性标本中军团菌定量数值分别为50~1320菌落形成单位/升(cfu/L)、20~13 085基因单位/升(GU/L)和10~4480 GU/L。对于132份水样,3种方法对军团菌含量分析的定量数值大小差异有统计学意义(χ2=193.6,P0.01),其中荧光定量PCR的定量数值最高,EMA-荧光定量PCR的数值次之,平板培养的数值最低。结论上海市口岸管道水中军团菌污染率和含菌量高。荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR方法检测管道水中军团菌的灵敏度优于传统的培养方法,EMA-荧光定量PCR方法适合用于环境水体中军团菌活菌监测。     

建立实时荧光LAMPA法检测肺炎支原体

目的:建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体。方法:在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果。以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ染料LAMP法检测,比较2种方法的检出限。肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法灵敏度。以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法特异性。采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法检出率差异。结果:实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为103 copies/μL,当基因拷贝数大于104 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号。SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为104 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色。实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增。实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用。     

Detection of Toxoplasma gondii from amniotic fluid, a comparison of four different molecular biological methods

BACKGROUND: The infection caused by the parasite Toxoplasma gondii (T. gondii) is often asymptomatic or has mild symptoms. The infection can cause serious problems in pregnant women who acquire the infection during gestation and their fetuses are congenitally infected. METHODS: We tested 64 amniotic fluid samples for the presence of T. gondii by using fluorescent PCR and DNA fragment analysis. Later we compared four different molecular biological methods for the detection of the presence of T. gondii on same frozen DNA samples. These methods are the conventional PCR, fluorescent PCR with DNA fragment analysis, quantitative real-time PCR with SYBRGreen I and with fluorescence energy transfer hybridization probe detection. We determined the detection limit of these methods. RESULTS: The conventional PCR and quantitative real-time PCR with SYBRGreen I detection have the detection limit of 1000 parasites, followed by fluorescent PCR with the detection limit of 10-100 parasites. The real-time PCR using fluorescence energy transfer hybridization probes can detect one parasite. This is the most sensitive and the fastest method. We detected 5 T. gondii positive samples with all methods from the studied 64 amniotic fluids. CONCLUSIONS: All studied molecular biological methods are suitable for the detection of congenital toxoplasmosis. The quantitative real-time PCR based methods are more sensitive, simple and easy to perform these are opening the avenue to find out the effect of the number of parasites on fetal abnormalities.